Método para obter padrão de respiração em camundongos senescentes através de plethysmografia barométrica sem restrições

Este protocolo pode ser usado para medir padrões de respiração em camundongos. É importante ressaltar que pode minimizar o impacto de comportamentos ativos em cepas geneticamente modificadas que podem confundir resultados. As principais vantagens dessa técnica são que ela não é invasiva e que não requer o uso de restrições anestésticas ou indutoras de estresse.

Comece certificando-se de que todas as mangueiras e tubos estejam conectados à câmara de plethysmógrafo barométrico e conectando um tubo de entrada de gás e um tubo de saída de vácuo diretamente à câmara de pletismografia barométrica. Para calibrar o baixo fluxo para dentro da câmara, coloque o fluxo dentro e fora da câmara para zero e remova o tubo de fluxo para dentro da câmara. Desligue o vácuo e digite um zero na célula de unidade baixa para registrar o fluxo zero na configuração do amplificador 7700 do software pletimógrafo barométrico.

Em seguida, recoloque o tubo de entrada e ligue o fluxo de vácuo para calibrar o alto fluxo e permitir que 20,93% de oxigênio balanceado gás nitrogênio flua através da câmara de pletiismografia barométrica da misturador de gás. Em seguida, converta o valor de entrada medido a partir do medidor de fluxo de litros por minuto em mililitros por segundo e clique na célula unitária alta para inserir o valor em mililitros por segundo. Clique duas vezes em cal alto, altere o tempo para três segundos e clique em Medir.

Em seguida, deixe a aba de configuração do amplificador 7700 aberta para calibrar os analisadores metabólicos ao software de plethysmografia barométrica. Para calibrar o analisador metabólico, no programa de mistura de gás, coloque a batedeira a gás em 20,93% oxigênio e 79,07% nitrogênio. E no analisador metabólico, defina o nível de calibração de oxigênio para 20,93% e o dióxido de carbono para 0% Volte a colher o mostrador para a amostra, uma vez que os valores apropriados tenham sido inseridos nos analisadores de gás para definir a alta porcentagem de oxigênio e baixo dióxido de carbono.

Clique na guia ABCD 4 do software de plethysmografia barométrica e digite 20,93 em alta unidade da linha C2 para oxigênio. Em cal alto, altere o tempo para três segundos e clique em Medir. Digite zero sob cal baixo da linha C3 para dióxido de carbono.

Em seguida, mude o tempo para três segundos e clique em Medir sob cal baixo. No programa de mistura de gás, altere o valor do oxigênio para 10% e o valor do dióxido de carbono para 5% e espere vários minutos para que o fluxo de gás se ajuste a esses valores. Nos analisadores metabólicos, gire os botões de ajuste para calibrar o dióxido de carbono para 5%, tomando o cuidado de virar o mostrador de volta à amostra depois que os valores tiverem sido calibrados.

Depois de verificar se as leituras do analisador estão estáveis, clique na unidade alta em C3 e digite cinco para dióxido de carbono. Em seguida, mude cal alto para três segundos e clique em Medir. Clique em unidade baixa na opção C2 e digite 10 para oxigênio e clique em cal baixo, insira três segundos e clique em Medir.

Mude a batedeira de gás para 20,93% de oxigênio e 79,07% nitrogênio e espere vários minutos para que a câmara se ajuste a esses valores. Execute rotineiramente calibrações adicionais com tanques de gás certificados para confirmar que o misturador de fluxo e os analisadores de dióxido de carbono estão funcionando corretamente. Quando os analisadores metabólicos tiverem sido calibrados, verifique novamente os medidores de fluxo conectados à câmara de plethysmógrafo barométrico e ajuste o fluxo de ar para dentro e para fora da câmara para taxas apropriadas para o experimento.

Quando todas as configurações tiverem sido aplicadas ao software de plethysmografia barométrica, clique em Fechar na guia Aquisição. Clique em Iniciar Aquisição, nomeie o arquivo e clique em OK para começar a gravar. Para a plethysmografia barométrica sem restrições, registo o peso e a temperatura corporal inicial do mouse antes de devolver o rato à sua gaiola doméstica.

Aguarde 10 minutos para coletar os dados de oxigênio e dióxido de carbono de fundo da câmara vazia antes de colocar o rato na câmara. Durante a primeira hora, documente o comportamento do animal tomando notas detalhadas que incluem os valores específicos do entrada e saída da câmara. No final da habituação da câmara, observe segmentos de respiração silenciosa pelos próximos 60 minutos tomando medidas de temperatura corporal a cada 10 minutos ao usar um dispositivo implantável.

Tome cuidado para se familiarizar com os comportamentos gerais do rato para que casos de respiração calma sem cheirar, aliciamento ou exploração possam ser adequadamente identificados. No final do experimento, devolva o rato à sua gaiola e limpe e limpe completamente o equipamento. Para uma análise do metabolismo, abra o painel metabólico no software e obtenha a média dos primeiros 10 minutos dos níveis de oxigênio e dióxido de carbono de quando a câmara estava vazia.

Visualize o painel de fluxo do software de plethysmografia barométrica e clique com o botão direito do mouse' Analisar atributo para definir parâmetros apropriados. Para um padrão de análise respiratória, confirme os tempos para os 15 segundos de respiração silenciosa usando notas sobre o comportamento animal, bem como o rastreamento do painel de fluxo. Em seguida, digite os horários em diálogo de analisador aberto a partir da guia analisador de dados e clique em Modo de Exibição de Parser para mostrar apenas os segmentos específicos de 15 segundos de interesse.

Para analisar apneias e respiração aumentada, no arquivo de revisão aberto, saia do modo de exibição do analisador e clique em Configuração P3 e Configuração de gráfico para selecionar Page View como o tipo e cinco como o número de painéis. Digite menos dois na caixa rotulada baixa e duas na caixa rotulada alta para as medidas de fluxo em mililitros por segundo e aplique as alterações. Em seguida, role até a marca de 30 minutos no painel de rastreamento de fluxo e conte manualmente as apneias e respirações aumentadas para o período de 30 a 60 minutos depois que o mouse foi colocado na câmara.

Para esta análise, períodos de respiração suspensa com duração maior ou igual a 0,5 segundos são indicativos de uma apneia. As respirações aumentadas são indicadas por um aumento acentuado no traço respiratório acima de 1,25 mililitros por segundo, seguido por uma queda acentuada abaixo de menos 0,75 mililitros por segundo. Este rastreamento de fluxo representativo de respiração silenciosa em um rato de 22 meses de idade é típico de um padrão no qual a respiração é consistente com nenhum comportamento respiratório ativo.

Este padrão respiratório é de um segmento mais ativo durante o qual os camundongos estavam explorando a câmara farejando e/ou preparando e não é ideal para o tipo de coleta de respiração utilizada para essa metodologia. O parâmetro selecionado para a avaliação de possíveis diferenças de respiração entre os dois pontos de tempo foram frequência respiratória, volume de maré, ventilação minuciosa, relação de tempo inspiratório de volume de maré e relação de dióxido de carbono expelido pela ventilação minuciosa. Foram realizadas análises mais aprofundadas com cada um dos quatro segmentos de linha de base de 15 segundos para frequência, volume de maré, ventilação minuciosa, relação de tempo inspiratório de volume de maré e relação de dióxido de carbono expelido pela ventilação minuciosa.

Não foram encontradas diferenças significativas entre nenhum dos pontos de tempo e nenhuma diferença na variabilidade entre nenhum dos quatro segmentos vezes para qualquer padrão de medida respiratória. Quantificação do número de apneias e respirações aumentadas observadas para cada animal durante minutos 30 a 60 do protocolo de pletiismografia barométrica não contido revelou que animais idosos apresentaram um alto número de apneias e a presença de respirações aumentadas em um período de 30 minutos. Os pesquisadores também podem empregar desafios gasosos como hipóxia ou hipercapnia para documentar quaisquer alterações no padrão respiratório resultantes de uma intervenção ou terapia.

Esta técnica fornece um meio para caracterizar padrões de respiração em pequenos roedores e cepas animais geneticamente modificadas que podem apresentar diferenças comportamentais distintas.