Name: Inducible, expressão de tipo específico de célula em Arabidopsis thaliana mediada através de LhGR Trans-ativação (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Aprenda a criar linhas transgênicas de Arabidopsis thaliana com expressão induzível e específica de tecido em meristemas usando o sistema de clonagem modular green gate. Este método avança a biologia do desenvolvimento vegetal.

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Trabalho em nossos laboratórios é suportado pelo Fundação de pesquisa alemã (DFG) subvenções WO 1660/6-1 (S.W.) e GR 2104/4-1 (T.G.) e SFB1101 (para T.G. e J.U.L) e por um Conselho Europeu de investigação consolidador conceder (PLANTSTEMS 647148) de T.G.  S.W. é suportado através de Emmy Noether comunhão da DFG através de Grant WO 1660/2.

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<li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VASCULAR-RELATED+NAC-DOMAIN6+and+VASCULAR-RELATED+NAC-DOMAIN7+effectively+induce+transdifferentiation+into+xylem+vessel+elements+under+control+of+an+induction+system%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">VASCULAR-RELATED NAC-DOMAIN6 and VASCULAR-RELATED NAC-DOMAIN7 effectively induce transdifferentiation into xylem vessel elements under control of an induction system.</a> Plant Physiology. 153 (3), 906-914 (2010).</li>
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Os autores não têm nada para divulgar.

Aqui, descrevemos os passos necessários para gerar e aplicar um conjunto de ferramentas abrangente e versátil para inducible, célula tipo específico trans-ativação. Atravessando a fronteira transportando cassettes effector sob controle do promotor pOp com linhas de motorista permite estudar os efeitos de expressão mis na geração F1, permitindo a rápida avaliação de perturbação genética em uma ampla gama de tipos de células. Alternativamente, effector construções podem ser usadas para transformar linhas ...

Uma grande limitação em biologia na era postgenomic é para decifrar o papel específico do contexto de um determinado fator ou perturbação genética. Perturbações genéticas constitutivas como abordagens da função de perda e ganho-de-função muitas vezes só permitem a análise de ponto de extremidade de processos de adaptação ao longo da vida, ofuscando a distinção entre efeitos primários e secundários. Além disso, funções específicas do contexto podem ser mascaradas ou diluídas por efeitos de grande escala em tecidos distantes ou durante as outras fases do desenvolvimento. Além disso, em casos extremos, a letalidade pode exclui qualquer visão mecanicista. Idealmente, para contornar esses problemas, pode-se analisar o efeito aguda perturbação genética dentro de um contexto específico, como um tipo específico de célula de forma tempo-resolvido. Para conseguir isso, ferramentas genéticas para expressão de tipo específico de célula inducible, são necessários1. Para fornecer um recurso para a rápida avaliação da dinâmica de uma resposta a uma determinado efetoras spatiotemporal, combinamos a facilidade de clonagem fornecidos pelo sistema GreenGate2 com a eficácia comprovada do sistema a GR-LhG4,3, 4,5,6. Podemos ter gerado um conjunto de linhas que expressam o fator de transcrição quimérico que lhg4 fundido para o domínio de ligação do ligante do receptor (GR) corticoide rato7 sob o controle de célula bem caracterizadas de promotores específicos tipo8. Em condições de repouso, o fator de transcrição permanece fora do núcleo, como o domínio GR é ligado pelo HSP90 citosólica. Com a adição de dexametasona ligante sintético (Dex), translocação nuclear é induzida e LhG4 vai mediar a transcrição das fitas de expressão sob controle de um promotor de cognato sintético pOp-tipo , tais como um repórter mTurquoise2 incluídas nas linhas de motorista Visualizar o domínio de expressão após a indução.  Assim, as linhas de motorista tecnicamente também contêm uma gaveta effector. O cruzamento de um conjunto de linhas de motorista com uma linha carregando uma gaveta effector com, por exemplo, um gene de interesse sob o controle do promotor pOp-tipo mesmo assim, permite a avaliação rápida das consequências agudas ou a longo prazo da expressão effector em uma ampla gama de tipos de células.
Aqui, nós fornecemos um protocolo descrevendo os procedimentos necessários para gerar as linhas de driver e efetoras e demonstrar como expressão específica do tipo celular pode ser induzida e seguido no meristema apical de fotos, a meristema apical de raiz e o cambium da Arabidopsis. Para ilustrar a valentia e a especificidade desta abordagem, nós utilizamos o fator de transcrição conhecidos VND7 que é capaz de conduzir o engrossamento em espiral do tipo xilema secundário celular parede ectopically9. Tratamento de F1 de um cruzamento entre o Carbono2grl3vuoluk10,11 motorista e a pOp6:VND7 effector linha leva à formação de células de xilema, como gravidez ectópica na bainha de amido células da Arabidopsis da haste.
Para facilitar a geração de grandes conjuntos de DNA necessária para a construção de plasmídeos de expressão driver e efetoras, usamos o rápido e eficiente GreenGate clonagem método2. GreenGate clonagem é baseado no tipo II S, enzimas de restrição como Eco31I ou sua isoschizomer BsaI2. Estas enzimas cortar a jusante de seus sites de reconhecimento assimétrica produzindo saliências com variando a composição de base. Incorporando o Eco31I /Bsaeu restrição sites em oligonucleotides e alocando sequências específicas saliência para elementos de DNA, clonagem modular é alcançado, facilitando a geração de grandes módulos (assemblies). No quadro GreenGate, módulos de DNA se enquadram em categorias A-F com base na sequência de saliência que servem como adaptadores e são montadas nessa ordem. Portanto, as primeiras demão projetadas para amplificar seu produto desejado devem estar de acordo com o módulo selecionado2 (figura 1A). Se há um interno Eco31I /Bsaeu site e a sequência não é compatível com os módulos de entrada e destino GreenGate, você pode prosseguir sem mutagenizing, mas com menor eficiência. Como alternativa, use o mutagenesis local-dirigido para remover Eco31I /Bsaeu locais de restrição, tomando cuidado para não alterar os aminoácidos em produtos de genes.

<table><tbody><tr><td>Ampicilina</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>K029.1</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>Cloranfenicol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1919</td><td></td></tr><tr><td>Purificação</td> de coluna <td>Qiagen</td><td>QIAquick PCR Purification Kit (250)</td><td></td></tr><tr><td>Câmara de cultura para imagem Sarstedt</td><td>AG & Co. KG</td><td>Câmara de cultura de tecidos de 1 poço, em lamínula II</td><td></td></tr><tr><td>Dexametasona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4903</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher Scientific, Reino Unido</td><td>D139-1</td><td></td></tr><tr><td>Eco31I</td> Cânula de injeção <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FD0294</td><td></td></tr><tr><td>(0,30 x 12 mm, 30 G x 1/2)</td><td>Sterican, Braun</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>T832.2</td><td></td></tr><tr><td>Leica TCS SP5 CLSM, HCX PL APO lambda azul 63x objeto de imersão em água</td><td>Leica, Wetzlar, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MS medium</td><td>Duchefa, Haarlem, Holanda</td><td>M0221.0050</td><td></td></tr><tr><td>Nikon A1 CLSM, Apo LWD 25x&nbsp; 1.1 NA objetiva de imersão em água</td><td>Nikon, Minato, Tóquio, Japão</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri 35/10 mm</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Alemanha</td><td>627102</td><td></td></tr><tr><td>placa de Petri 60/150 mm</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Alemanha</td><td>628102</td><td></td></tr><tr><td>placa de Petri 120/120/17</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Alemanha</td><td>688102</td><td></td></tr><tr><td>Ágar Plant</td><td>Duchefa, Haarlem, Holanda</td><td>P1001</td><td></td></tr><tr><td>Extração de plasmídeo</td><td>Qiagen</td><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td></td></tr><tr><td>Iodeto de propídio (PI)Lâmina de</td> barbear <td>Sigma-Aldrich</td><td>P4170</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Classic, Wilkinson Sword GmbH</td><td>7005115E</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de reação</td><td>Sarstedt AG & Co. KG</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>Silwet L-77</td><td>Kurt Obermeier GmbH & Co. KG, Bad Berleburg, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectinomicina</td><td>AppliChem GmbH</td><td>3834.001</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotômetro</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NanoDrop 2000c</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>4621.1</td><td></td></tr><tr><td>Sulfadiazina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6387</td><td></td></tr><tr><td>Tetraciclina</td><td>AppliChem GmbH</td><td>2228.0025</td><td></td></tr><tr><td>T4 Ligase 5 U/&micro; l</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EL0011</td><td></td></tr><tr><td>T4 Ligase 30 U/&micro; l</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EL0013</td><td></td></tr></tbody></table>

inducible, expressão de tipo específico de célula em arabidopsis thaliana mediada através de lhgr trans-ativação

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Expressão inducible, tecido-específica é uma ferramenta importante e poderosa para estudar a dinâmica espaço-temporal da perturbação genética. Combinando o GreenGate flexível e eficiente sistema com o comprovada e aferido LhGR sistema (aqui denominado GR-LhG4) para a expressão inducible de clonagem, geraram um conjunto de linhas de Arabidopsis transgênicas que pode guiar a expressão de um efetor gaveta em uma variedade de tipos de célula específica nos três os meristemas planta principal. Para este fim, escolhemos o sistema GR-LhG4 previamente desenvolvido, com base em um fator de transcrição quimérico e cognato pOp-tipo promotor garantindo controlo apertado sobre uma ampla gama de níveis de expressão. Além disso, para visualizar o domínio de expressão onde o fator de transcrição sintética está ativo, um repórter fluorescentes mTurquoise2 ER-localizada sob o controle do promotor pOp4 ou pOp6 é codificado em linhas de motorista. Aqui, descrevemos as etapas necessárias para gerar uma linha de driver ou efetoras e demonstrar como expressão específica do tipo celular pode ser induzida e seguido no meristema apical de fotos, a meristema apical de raiz e o cambium de Arabidopsis. Usando vários ou todos os driver de linhas, o efeito de contexto específico de expressar um ou múltiplos fatores (efetores) sob controle do promotor sintético pOp pode ser avaliadas rapidamente, por exemplo em plantas de F1 de um cruzamento entre um efetor e múltiplo linhas de motorista. Esta abordagem é exemplificada pela expressão ectópica de VND7, um factor de transcrição do NAC capaz de induzir a deposição de parede ectópica secundária de célula de forma autónoma de célula.

Geração de linhas de driver e efetoras através de clonagem GreenGate
O GreenGate clonagem sistema baseia-se na GoldenGate clonagem e uso a endonuclease de restrição do tipo IIS Bsaeu ou sua isoschizomer Eco31I. Como saliências produz a enzima distante do seu local de reconhecimento assimétrica, a composição de base das saliências podem ser livremente escolhido, que é a base forma a modularidade do sistema. Cada elemento gerado pelo PCR, por exemplo, uma sequê...

Aqui, descrevemos a geração e aplicação de um conjunto de transgénicos Arabidopsis thaliana linhas permitindo expressão inducible, tecido-específica nos três os meristemas principais, a meristema apical de atirar, a meristema apical de raiz e o cambium.

Inducible, expressão de tipo específico de célula em Arabidopsis thaliana mediada através de LhGR Trans-ativação

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the ...

O objetivo principal na biologia do desenvolvimento é entender o papel específico do contexto de um gene. E isso pode ser difícil de conseguir por mutantes convencionais ou por linhas de superexpressão constitutivas. Utilizamos o sistema modular de clonagem de portão verde para gerar um recurso para expressão indutível de cito nos três principais meristamos da planta modelo Arabidopsis thaliana.Usando a mesma estratégia de clonagem modular, este método pode ser aplicado a outras espécies vegetais que são imutáveis à transformação. A demonstração visual deste procedimento é valiosa porque analisar o efeito da transativação nos meristems do caule e o ápice curto requer dissecção antes da imagem, o que pode ser bastante desafiador. Para começar, esterilize as sementes conforme descrito no protocolo de texto.Em seguida, prepare mísrico Murashige e Skoog médio em pH 5.8 e adicione uma por cento de sacarose e 0,9% de ágar. Após a autoclavagem, adicione Dex dissolvido em DMSO às placas de indução em uma concentração final entre 10 e 30 micromolar. Adicione uma quantidade igual de DMSO às placas de controle.Coloque as sementes para imagens de raízes em placas e estratifique-as por 48 horas na escuridão e a quatro graus Celsius. Coloque as placas em posição vertical em uma incubadora de plantas e plante-as por cinco dias. Cinco dias após a germinação, use microscopia de varredura a laser confocal para imagem das mudas.Para começar, prepare e plante as sementes conforme descrito no protocolo de texto. Seis a sete dias após a germinação, transfira cada muda para o solo em um pote separado. Se induzir as usinas por rega, utilize uma solução DEX de 25 micromolar em água, preparada a partir de um estoque de 25 milmolarES DEX dissolvido em etanol.Água a cada dois ou três dias até o tempo desejado de indução. Se induzir mergulhando, prepare um béquer de um litro com 750 mililitros de água contendo 0,02% Silwet L77 e DEX a 25 de concentração final de micromolar ou uma quantidade equivalente de DMSO para o DEX e tratamento simulado. Mergulhe uma única planta na solução de indução ou simulação por 30 segundos.Repita a cada dois ou três dias, até o tempo desejado de imagem. Para começar, prepare e plante as sementes conforme descrito no protocolo de texto. Seis a sete dias após a germinação, transfira cada muda para o solo em um pote separado.Quando a haste tiver cerca de um centímetro de comprimento, pulverize o SAM influorescente com entre 10 e 50 micromolares de solução DEX em água. Para indução e imagem em estágios posteriores de desenvolvimento, induza SAMs de hastes mais longas ou brotos laterais. 24 a 48 horas após a indução, disseque os SAMs e prossiga para a imagem.Primeiro, transfira as mudas da placa para uma solução de 10 microgramas por milileter de iodeto de propídio e contraten-las por cinco minutos. Coloque as raízes em uma câmara de imagem de microscópio e imagem-as usando um microscópio de varredura a laser confocal com um objetivo de imersão de água de 63x. Para visualizar a fluorescência de iodida propidato, use um comprimento de onda de excitação de 488 nanômetros e colete emissão entre 590 e 660 nanômetros.Para fluorescência mTurquoise2, use 458 nanômetros de excitação e colete emissões entre 460 e 615 nanômetros usando varredura sequencial. Primeiro, fixar uma haste com um dedo no lado oposto da seção desejada. Usando uma lâmina de barbear, corte um segmento de aproximadamente três centímetros e realize vários cortes finos.Enxágüe a lâmina de barbear em uma placa de Petri contendo água da torneira e colete as seções de haste. Ou colore as seções ou monte-as diretamente em slides de microscópio. Para coloração, prepare um mililitro de uma solução de 250 microgramas por mililitro de iodeto de propídio em um tubo de reação.Retire a água da torneira da placa de Petri com uma pipeta e substitua-a pela solução de iodeto de propídio e manche por cinco minutos. Em seguida, remova a solução de iodeto de propídio e enxágue com água. Usando fórceps finos ou um pincel fino, transfira as seções manchadas para slides de microscópio.Use um microscópio de varredura a laser confocal com uma lente de imersão de água mergulhando 25x para a imagem das amostras. Use uma luz laser de 561 nanômetros para excitar a fluorescência de iodeto propidium e coletar emissões de 570 a 620 nanômetros. Use uma luz laser de 405 nanômetros para excitar o efeito fluorforeiro mTurquoise2 codificado pelas construções da linha do motorista e coletar emissões de 425 a 475 nanômetros.Primeiro, use fórceps para cortar a haste dois centímetros abaixo da ponta de tiro. Segure a haste em uma mão e use fórceps finos para remover os botões de flores e primordia grande. Para remover a primordia jovem, fixe o SAM em uma posição vertical em uma placa de Petri contendo 3% de agarose.Em seguida, use um binóculo e fórceps para remover qualquer primordia jovem perto do SAM. Transfira o SAM dissecado para um tubo contendo uma solução de 250 microgramas por mililitro de iodeto de propídio. Deixe a amostra manchar por cinco a 10 minutos, certificando-se de que a amostra permaneça totalmente submersa durante o procedimento de coloração.Coloque o SAM manchado em uma pequena placa de Petri contendo 3% de meio de agarose. Cubra o SAM com água dupla destilada. Use um microscópio de varredura a laser confocal equipado com uma lente de imersão de água mergulhando 25x para imagem dos SAMs dissecados.Use uma luz laser de 561 nanômetros para excitar a fluorescência de iodeto de propidium e coletar emissões de 570 a 620 nanômetros. Use uma luz laser de 405 nanômetros para excitar o fluoróforo mTurquoise2 e coletar emissões de 425 a 475 nanômetros. Registo pilhas de imagens que abrangem 50 micrômetros na direção Z com um tamanho de passo de 0,5 micrômetros.A indução com DEX leva à expressão mTurquoise2 específica do tipo celular na endoderme raiz os precursores de phloem e cambium, e as células-tronco no meristem apical shoot. Como um caso de teste para transativação, uma linha de efeitos codificando o fator de transcrição mestre de parede de células secundárias VND7 fundido ao domínio de ativação V16, é gerada. Após cinco dias de tratamento único com 15 microlitadores de DEX ou DMSO, as seções de haste são preparadas para a visualização da lignificação ectópica na bainha inicial.As células induzidas em amostras induzidas mostram um forte sinal para o canal de iodeto de propídio e algumas células mostram o típico espessamento reticulado da parede celular em células xilema. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma compreensão clara de como induzir a expressão genética em diferentes tecidos e como preparar suas amostras para imagens. Após este procedimento, as linhas de driver estabelecidas podem ser usadas com uma grande variedade de construções de efeitos gerados por outros usuários de acordo com seus interesses de pesquisa.Este atalho deve ajudar os pesquisadores da planta a avaliar rapidamente o efeito da expressão específica do tipo celular ou a derrubada de um gene de interesse de uma maneira reservada de tempo. Este sistema de indução específico do tipo celular requer o uso da dexametasona corticosteroide. O contato direto deve ser evitado, por isso é importante usar luvas e uma máscara facial durante o tratamento.

inducible-cell-type-specific-expression-arabidopsis-thaliana-through

Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

A base molecular do espaço-respostas específicas fitocromo está sendo investigado o uso de plantas transgênicas que apresentam tecidos e órgãos específicos deficiências fitocromo. O isolamento de células específicas exibindo esgotamento cromóforo fitocromo induzida por fluorescência-Activated Celular classificação seguido por análises de microarray está sendo utilizada para identificar genes envolvidos em respostas espaciais específicos fitocromo.

Investigando Tecido e órgãos específicos Responses Fitocromo usando FACS assistida Célula tipo Profiling expressão específica no Arabidopsis thaliana</em

Uma abordagem confiável e útil para detectar modificações das histonas em genes específicos de plantas é descrito. A abordagem combina cromatina imunoprecipitação (chip) e real-time PCR quantitativo. Ela permite a detecção de modificações das histonas em genes específicos, com um papel em diversos processos fisiológicos.

Detecção de histona Modificações nas folhas das plantas

Análise de célula específico<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Folhas utilizando ordenação células activadas por fluorescência

Nós apresentamos o procedimento para montar um ensaio da cama tegumento (SCBA) de Arabidopsis thaliana sementes. O ARA foi demonstrado ser uma ferramenta poderosa para explorar geneticamente e in vitro como a germinação de sementes de controlo do endosperma de sementes de dormentes e em resposta a sinais de luz. O SCBA é, em princípio, aplicável em qualquer situação em que se suspeita que o endosperma para influenciar o crescimento embrionário.

A Brasão Cama Ensaio de Sementes para explorar Geneticamente<em&gt; In Vitro</em&gt; Como a germinação Controles do endosperma das sementes em<em&gt; Arabidopsis thaliana</em

Cromatina imunoprecipitação é uma técnica poderosa para a identificação de locais de Arabidopsis proteínas de ligação ao ADN in vivo. Este procedimento inclui a ligação cruzada da cromatina e fragmentação, imunoprecipitação com anticorpos selectivos contra a proteína de interesse, e análise de qPCR de DNA ligado. Nós descrevemos um ensaio ChIP simples otimizado para plantas de Arabidopsis.

Ensaio para imunoprecipitação da cromatina a identificação de Arabidopsis interações proteína-ADN<em&gt; In Vivo</em

O Sistema Induzível de Raiz Lateral (LRIS) permite a indução síncrona de raízes laterais e é apresentado para Arabidopsis thaliana e milho.

Lateral Root Inducible sistema no<em&gt; Arabidopsis</em&gt; E Milho

Este protocolo descreve um método para observar a embriogênese em Arabidopsis através do apuramento ovule, seguido de inspeção de formação padrão de embrião sob um microscópio.

Um método para caracterizar a embriogênese em Arabidopsis

Um protocolo melhorado é apresentado para a medição transitória da expressão do gene do repórter construções nas células de aleurona de cevada após o bombardeio de partículas. A combinação de grãos automatizado moagem com ensaios enzimáticos de placa de 96 poços fornece alto throughput para o procedimento.

Expressão gênica em camadas de aleurona cevada bombardeado com maior Throughput de medição

Este trabalho descreve dois métodos para quantificar as respostas de defesa em Arabidopsis Arabidopsis thaliana após a exposição aos elicitors imunes: o estouro oxidativo transiente, e a inibição do crescimento de plântulas.

Ensaios de explosão oxidativa desencadeada por padrão e inibição do crescimento de plântulas em Arabidopsis Arabidopsis thaliana

Traduzir purificação de afinidade costela (TRAP) oferece a possibilidade de dissecar programas de desenvolvimento com processamento mínimo de órgãos e tecidos. O protocolo produz RNA de alta qualidade a partir de células direcionadas com uma subunidade ribossômica rotulada como proteína fluorescente verde (GFP). Ferramentas de análise a jusante, como qRT-PCR ou RNA-seq, revelam perfis de expressão específicos de tecido e célula.

Traduzindo a Purificação da Afinidade ribossófica (TRAP) para investigar o desenvolvimento raiz arabidopsis thaliana em uma escala específica de tipo de célula

Aprenda a criar linhas transgênicas de Arabidopsis thaliana com expressão induzível e específica de tecido em meristemas usando o sistema de clonagem modular green gate. Este método avança a biologia do desenvolvimento vegetal.

Inducible, expressão de tipo específico de célula em Arabidopsis thaliana mediada através de LhGR Trans-ativação

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