Interrogando os centros germinativos auto-reativas individuais por Photoactivation em um modelo misto de quimérico de auto-imunidade

Este modelo quimérico fisiologicamente relevante de centros germinal autoretivos espontâneos permite a vinculação da localização celular in vivo com análises moleculares a jusante. A principal vantagem do modelo quimérico misto dos centros germinos autoretivos é sua natureza versátil e marginal, permitindo o interrogatório de praticamente qualquer subconjunto celular ou via molecular desejado. A relevância fisiológica desse modelo de desenvolvimento de doenças autoimunes permite novas percepções que possam auxiliar o avanço de novas terapias.

Este modelo de quimera de medula óssea pode ser usado em imunologia, imuno-oncologia e pesquisa de células-tronco. O componente de fotoativação tem amplo uso, pois liga a localização tecidual à análise de células a jusante. A preparação e reconstituição da medula óssea e as etapas de rotulagem in vivo e explantação de tecidos são procedimentos tecnicamente complexos que se prestam bem às demonstrações visuais.

Para extrair o doador 564Igi fêmur e tíbia do rato, remova a pele de um membro traseiro, e retire as articulações do joelho e tornozelo puxando o pé com força. Vá quebrar a articulação do tornozelo. Em seguida, puxe o pé em direção ao corpo enquanto segura a tíbia, retirando assim os tendões e músculos da tíbia.

Quebre a articulação do joelho para soltar a tíbia, e puxe o osso em direção ao corpo enquanto segura o fêmur para tirar os tendões e músculos do fêmur. Em seguida, faça uma incisão na articulação do quadril, e corte os tendões antes de puxar o fêmur para fora da tomada do quadril. Depois de remover os ossos do membro traseiro contralateral de forma semelhante, esfregue cuidadosamente os ossos com uma toalha de papel grosseira para remover qualquer músculo restante e tecido conjuntivo, e enxágue os ossos despojados no tampão de medula óssea gelado.

Em seguida, use o número sete de Dumont para transferir os ossos para um recipiente de tampão de medula óssea fresco no gelo. Para extrair as células da medula óssea, enxágue uma argamassa no tampão de medula óssea gelado e use uma pipeta sorológica de 10 mililitros para substituir o tampão de lavagem por 10 mililitros de tampão de medula óssea fresco e gelado. Use os fórceps para transferir os ossos para a argamassa, e use um pilão para esmagar e moer os ossos para liberar a medula óssea.

Use a pipeta de 10 mililitros para coletar o extrato da medula óssea antes de passar a solução de medula óssea através de um coador de células de 70 micrômetros em um tubo cônico de 50 mililitros no gelo. Em seguida, enxágue a argamassa com mais 10 mililitros de tampão de medula óssea fresco e gelado para garantir uma recuperação completa das células. Para preparar as suspensões do doador, misture os volumes apropriados de GFP fotoativatável e medula doadora 564Igi em um tubo cônico de 50 mililitros e pelota as células por centrifugação.

Resuspengue a pelota celular mista em uma concentração de uma vez 10 para as oito células por mililitro de tampão de medula óssea gelado, e transfira as células para um tubo de microcentrifuge pré-cozido de 1,5 mililitro no gelo. Em seguida, confirme a falta de resposta ao beliscão do dedo do pé no rato receptor CD45.1 anestesiado e filme o tubo de células de medula óssea doadora para garantir uma ressuspensão adequada. Carregue 200 microliters de medula óssea misture em uma seringa de insulina de 0,3 mililitro, de 30 bitolas, e, com o receptor de lado, estique suavemente a pele acima e abaixo do olho para estourar ligeiramente o olho para fora.

Insira cuidadosamente a ponta da seringa em um ângulo aproximado de 30 graus na frente da órbita ocular, tomando cuidado para evitar o olho e o tecido circundante. Quando a ponta da agulha tocar o osso sublinhando a órbita ocular, retraia a agulha cerca de 0,5 milímetros antes de usar pressão constante para injetar lentamente a medula óssea do doador. Em seguida, devolva o rato à sua gaiola com água antibiótico ad libitum, com monitoramento até a recuperação completa.

Para rotular o linfonodo popliteal, diluir dois microliters de anticorpo anti-rato de rato rotulado phycoerythrin CD169 em 18 microliters de PBS, e adicionar duas gotículas de 10 microliteres do anticorpo em um pedaço de filme plástico parafina. Carregue cada gota em uma única seringa de insulina de 0,3 mililitro com uma agulha de calibre 30, e injete 10 microliters de anticorpo no bloco de pés do animal receptor anestesiado. Antes de colher o nódulo linfático, coloque uma mancha quadrada em uma superfície plana e use uma seringa de cinco mililitros carregada de graxa de vácuo para rastrear as bordas do deslizamento de tampas com graxa de cerca de um a dois milímetros de cada borda.

Transfira a câmara para uma superfície fria e plana e encha a câmara de graxa de vácuo com tampão de medula óssea gelado. Para acessar os linfonodos popliteal, use uma tesoura reta e fina para fazer uma incisão na pele logo abaixo do poço do joelho do animal receptor eutanizado, e estender o corte para cima ao longo da linha do tendão quase até a articulação do quadril. Usando dumont número cinco ou número sete fórceps, puxe cada um dos retalhos expostos da pele para fora para expor o tecido na fossa popliteal, e use os fórceps para entrar cuidadosamente na fossa apenas medial para a veia popliteal.

Abra e feche os fórceps ao longo do eixo da perna para expor o linfonodo popliteal subjacente antes de usar o polegar e o dedo indicador para beliscar o músculo quadríceps do lado dianteiro proximal para o joelho, para tirar o linfonodo da fossa. Deslize as fórceps sob o linfonodo para liberar o nódulo do tecido circundante, e coloque-o na câmara de graxa de vácuo. Após a coleta do segundo linfonodo, coloque uma segunda mancha na borda da graxa de vácuo e pressione suavemente para fechar a câmara, tomando o cuidado de extruir todas as bolhas de ar.

Para identificar os centros germinais em amostras de tecido de baço colhidos, coloque a câmara de imagem no palco de um microscópio fluorescente de dois fótons e use uma pipeta de transferência de plástico de 3,5 mililitros para colocar uma gota de água destilada em cima da tampa superior. Abaixe o objetivo até o ponto de contato, e use a luz transmitida para focar na parte superior do tecido. Mude para o modo escuro e a excitação de dois fótons, e sintonize o laser em 940 nanômetros.

Localize as áreas individuais de polpa branca bordadas pela coloração CD169 perto da superfície do tecido, e identifique a baátima linfoide periarteriolar pela segunda geração harmônica associada à arteriola central. Na zona entre a bainha linfoide periarteriolar e a zona marginal, identificar a presença de macrófagos altamente autofluorescentes, ativados do corpo tingível e, usando esses marcos, atrair uma região de interesse em torno de uma única área do centro germinal. Em seguida, configure uma pilha Z de cerca de 100 a 150 micrômetros de profundidade, começando pela superfície do tecido e usando um tamanho de passo de cerca de três micrômetros antes de mudar para um comprimento de onda de excitação de 830 nanômetros.

Desligue ou diminua todos os canais para evitar fotodamagem nos detectores e imagem da pilha. Em seguida, mude de volta para o comprimento de onda de excitação de 940 nanômetros e reabra os canais, escaneando através da pilha para confirmar uma fotoativação eficiente e uma ausência de fotodamagem em toda a pilha de imagens. A sorotipagem das quimeras de medula óssea mista revela números de células B normalizados em seis semanas após a reconstituição, com uma baixa frequência de células B circulantes 9D11 positivas derivadas do compartimento 564Igi.

Dentro do portão total de linfócitos, houve baixa frequência de células derivadas de receptores residuais, cerca de 6% das quais são derivadas do CD45.1, indicando um grau global de chimerismo de cerca de 94%, houve um chimerismo praticamente completo no compartimento de células B e um domínio das células B derivadas da medula óssea GFP, uma consequência da seleção negativa pesada de células B derivadas de 564Igi. Como observado, a rotulagem in vivo com CD169 facilita uma visualização robusta da zona marginal. O segundo sinal harmônico é aparente em elementos estruturais contendo colágeno e vasos principais, incluindo a arteriola central da bainha linfoide periarteriolar e macrofagos altamente autofluorescentes, ativados tingíveis associados à atividade do centro germinal.

Juntos, esses dados permitem a identificação de uma região de interesse que provavelmente contém um único centro germinal fotoactivatable. A avaliação citométrica do fluxo a jusante confirma ainda mais a presença de números de compartimentos de células B normalizados, uma população do centro germinal espontâneo e um subconjunto de células germinais fotoativadas do centro B. É importante restringir o tempo total de retorno das etapas de explanação, fotoativação e processamento de tecidos para quatro a seis horas para garantir uma viabilidade celular suficiente.

As células fotoativadas podem ser classificadas a fluxo e submetidas a sequenciamento unicelular para, por exemplo, caracterizar o repertório do receptor de células B de um único centro germinal. O modelo de quimera mista permitiu a exploração da biologia do centro germinal autoretivo em uma nova profundidade, por exemplo, fornecendo insights sobre como o processo de propagação de epítope se desenrola. Note que a fonte de luz para microscopia de dois fótons são lasers de classe 4 pulsados muito poderosos que podem danificar severamente os olhos.