Name: Ensaio de matar Opsonophagocytic para avaliar as respostas imunológicas contra patógenos bacterianos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Aprenda o ensaio de matar opsonofagocítico para avaliar respostas imunológicas contra Streptococcus pneumoniae. Este método padronizado mede a eficácia de anticorpos na eliminação bacteriana por células fagocíticas.

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Agradecemos o Dr. Moon Nahm (Universidade de Alabama Birmingham) por sua inestimável ajuda no estabelecimento de ensaios OPKA em nosso laboratório. Este trabalho foi financiado pelos institutos nacionais de saúde Grant 1R01AI123383-01A1 para FYA.

1. cultura, diferenciação e validação de células HL-60

<ol><li>Prepare meios de cultura celular HL-60, composto de 500 mL RPMI com L-glutamina e 50ml inactivadas pelo calor fetal soro bovino. Não adicione antibióticos como isso pode afetar a diferenciação das células HL-60.</li>
	<li>Para propagação/manutenção de células HL-60,6 células de cultura 5 x 10 em 10 mL de meios de cultura de células HL-60 em 75 cm2 exalados frascos em 37 ° C e 5% de CO2. Passagem células todos os dias 3−4 para manter as concentrações de célula ideal. Nota: A concentração de célula não deve exceder 5 x 106/mL.</li>
	<li>Gere ações de trabalho de células HL-60 por alíquotas aproximadamente 1 x 106 células/mL em meios de cultura HL60 com 10% de Dimetilsulfóxido (DMSO) para tubos criogênicos de 1 mL. Nota: Estoques de trabalho podem ser armazenados a-80 ° C. O estoque de mestre deve ser armazenado a-120 ° C.</li>
	<li>Diferencie células HL-60 pelo cultivo de 1,5 x 107 células em 15 mL de meios de cultura de células HL-60 com 0,6% N, N-dimetilformamida (DMF) a 37 ° C e 5% CO2 em frascos de2 estéril 75cm filtro tampado por 3 dias antes da OPKA.</li>
	<li>Validar que as células HL-60 tem sido diferenciadas com êxito e são apropriadas para uso no ensaio de OPKA através do teste de viabilidade e marcadores de superfície celular de acordo com o estabelecido fluxo cytometry protocolos16,17, 18,19. Após a diferenciação, colher células HL-60 e mancha de aproximadamente 1 x 104 células com anticorpos conjugados a fluorescente/manchas para CD71, CD35, anexina V e iodeto de propidium. Nota: Células diferenciadas devem ser ≥55 viável, ≥65% % CD35+e ≤20% CD71+ , conforme determinado pela estabeleceu protocolos de validação14 (Figura 1).</li>
</ol>
2. preparação de reagentes e Buffers OPKA

<ol><li>Prepare 50 mL de tampão estéril opsonização B (OBB) misturando 42,5 mL de estéril 1x tampão fosfato salino (PBS) com Ca2 +/ mg2 +, 5 mL de soro bovino fetal inactivadas pelo calor e 2,5 mL de 0.1% gelatina estéril. Loja a 4 ° C.</li>
	<li>Obter coelho bebê complemento e armazenar a-80 ° C.</li>
	<li>Obter ou preparar pratos de cultura bacteriana (ou seja, placas de ágar sangue de 15 x 100 mm2 5% ovelha).</li>
</ol>
3. preparação de amostras bacterianas de estoque

<ol><li>Obter um estoque de uma estirpe bacteriana a ser testado. Nota: Para este protocolo, sorotipo 3 Streptococcus pneumoniae (WU2, generosamente fornecidos pelo Dr. Moon Nahm) é usado.</li>
	<li>Crescer a estirpe bacteriana em um caldo apropriado (ou seja, caldo Todd-Hewitt + extrato de levedura 0,5% para esta estirpe WU2) para aproximadamente 2−4 h a 37 ° C. Nota: A densidade óptica em 600 nm (OD600) da cultura deve estar entre 0,6 e 0,8.</li>
	<li>As bactérias de pelotas por centrifugação a 6.000 x g por 2 min e ressuspender as células em 10−30 mL de glicerol de 15% do caldo apropriado. Alíquota a cultura bacteriana (500 µ l por alíquota) em tubos de centrífuga estéril 1,5 mL e loja a-80 ° C.</li>
	<li>Descongele um frasco de estoque bacteriana em banho maria a 37 ° C. As células bacterianas de pelotas e Resuspenda em 500 µ l de OBB sob condições estéreis.</li>
	<li>Prepare diluições diferentes das ações bacterianas no OBB (i.e., 10 µ l da diluição não, 10 µ l de 01:10, 10 µ l de 1: 100, etc.). Realize o ensaio OPKA (seções 4-6, incluindo co-cultura HL-60/complemento) conforme descrito abaixo, utilizando várias diluições do estoque bacteriana não tratada. Cultura as placas durante a noite a 30 ° C (não CO2). Nota: A temperatura de 30 ° C é específica para WU2 prevenir o crescimento excessivo; outros cepas/serótipos podem crescer otimamente a 37 ° C.</li>
	<li>Conte as colônias para cada diluição do estoque de bacteriana não tratada co cultivada com complemento e células HL-60. Determine qual diluição de bactérias produz o número ideal de colônias contáveis (aproximadamente 80−120 CFUs por bactérias não tratadas co cultivadas com células HL-60). Observe esta diluição para OPKAs futuras envolvendo este estoque bacteriana.</li>
</ol>
4. cultura e tratamento bacteriano

<ol><li>Descongele um tubo de estoque bacteriana preparado no passo 3.3. Bactérias (6.000 x g por 2 min) de pelotas e resuspenda o pellet celular em OBB a diluição ideal conforme determinado na etapa 3.6.</li>
	<li>Pipete 10 µ l da diluição bacteriana ressuspensa por alvéolo em uma placa de cultura de células 96 poços de fundo redondo.</li>
	<li>Adicione 20 µ l de tratamento adequado de anticorpos ou drogas a cada poço experimental em duplicado. Nota: Neste protocolo, um anticorpo sorotipo específico gerado em camundongos é adicionado como tratamento X e uma enzima de glicosídeo hidrolase conhecida para degradar a cápsula de polissacarídeo 3 sorotipo é adicionada como tratamento de4,Y (Figura 2)20. Para poços de controle, use 1X PBS ou OBB, dependendo o buffer usado para poços de tratamento.</li>
	<li>Agite a placa de amostra em cerca de 90 rpm por 1h à temperatura ambiente. Ajuste a estas condições, dependendo da temperatura ideal ou agitação condições dos tratamentos sendo testados.</li>
</ol>
5. HL-60 cultura bacteriana de co

<ol><li>Prepare células HL-60 por colheita de células HL-60 diferenciados que são tratadas com DMF três dias antes (consulte a etapa 1.4) para tubos cônico de 15 mL. As células (500 x g, 3 min) de Pelotas, desprezar o sobrenadante e lavar pelo menos 10 mL de 1X PBS.</li>
	<li>As células lavadas (500 x g, 3 min) de Pelotas, desprezar o sobrenadante e ressuspender as células em OBB (começa com 1 mL OBB e ajustar para uma concentração final de 1 x 107/mL após a contagem de células).</li>
	<li>Adicione complemento de coelho bebê (soro de coelho bebê estéril, não diluído, semanas de idade 3−4) em um volume final de 1:5. Nota: A concentração final da mistura HL-60-complemento deve ser 1 x 107/mL. Se o teste de complemento de dependência, uma segunda solução contendo células HL-60 ativas com complemento inactivadas pelo calor pode ser utilizada (complemento pode ser inactivado por incubar em banho-maria em > 55 ° C, durante pelo menos 30 min).</li>
	<li>Após cultura bacteriana de 1h é completo (passo 4.4), divida cada amostra (ou seja, 10 µ l de cada 30 µ l da amostra em dois novos poços) em poços de duplicados para os dois grupos (ou seja, uso somente 20 µ l de cultura co original de 30 µ l a conta para pipetagem erro) : um conjunto será co cultivado com HL-60-complemento e um incluirá apenas bactérias. Adicionar 50 µ l da mistura HL-60-complemento (da etapa 5.3) para cada conjunto experimental de poços (delegada + HL-60); Adicione 50 µ l de OBB sozinho aos poços de bactérias única (delegada -HL-60). Nota: Para este exemplo, aproximadamente 800 CFUs bacterianas são usados para a inicial co-cultura com células de HL-60 5 x 10550 µ l. Se essa multiplicidade de infecção é muito alta ou muito baixa, como indicado pelos números do final da colônia, ajuste a diluição inicial bacteriana em oposição a contagem de células HL-60.</li>
	<li>Agite a placa de 96 poços a 37 ° C por 1 h (não CO2).</li>
</ol>
6. amostra chapeamento e incubação durante a noite

<ol><li>Dilua cada poço 1:5 com OBB, para que cada amostra possui um volume de pelo menos 50 µ l.</li>
	<li>Pipete 50 µ l de cada amostra diretamente sobre uma área designada de uma placa de cultura bacteriana, garantindo o espaçamento adequado entre as amostras. Para 15 x 100 mm2 rodada placas de ágar, amostras de pipeta aproximadamente 4 em um prato.</li>
	<li>Cobrir e deixar amostras secar por aproximadamente 15 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Inverta as placas e cultura durante a noite a 30 ° C (não CO2). Alternativamente, placas em frascos anaeróbios para testar se anóxica condições afetam o crescimento bacteriano ou de controle para a morfologia da cultura.</li>
	<li>Depois da cultura durante a noite, conte as colônias em cada área de amostra designado. Analisar dados, comparando o número de células vivas em cada conjunto para o controle correspondente e/ou amostras que não recebem co-cultura de células HL-60 (indicativo de sobrevivência da pilha de 100%, 0% célula matar).</li>
</ol>

<ol><li>Romero-Steiner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization+of+an+opsonophagocytic+assay+for+the+measurement+of+functional+antibody+activity+against+Streptococcus+pneumoniae+using+differentiated+HL-60+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Diagnostic+Laboratory+Immunology%22%5BJournal%5D)">Standardization of an opsonophagocytic assay for the measurement of functional antibody activity against Streptococcus pneumoniae using differentiated HL-60 cells.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 4 (4), 415-422 (1997).</li>
<li>Nanra, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capsular+polysaccharides+are+an+important+immune+evasion+mechanism+for+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Vaccines+and+Immunotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Capsular polysaccharides are an important immune evasion mechanism for Staphylococcus aureus.</a> Human Vaccines and Immunotherapeutics. 9 (3), 480-487 (2013).</li>
<li>Ishibashi, K., Yamaguchi, O., Shiraiwa, Y., Ogihara, M., Shigeta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+therapy+of+Pseudomonas+aeruginosa+pyelonephritis+in+neutropenic+mice+with+human+antilipopolysaccharide+monoclonal+antibody+and+cefsulodin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Urology%22%5BJournal%5D)">Combination therapy of Pseudomonas aeruginosa pyelonephritis in neutropenic mice with human antilipopolysaccharide monoclonal antibody and cefsulodin.</a> Journal of Urology. 155 (6), 2094-2097 (1996).</li>
<li>Middleton, D. R., Paschall, A. V., Duke, J. A., Avci, F. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+Hydrolysis+of+Pneumococcal+Capsular+Polysaccharide+Renders+the+Bacterium+Vulnerable+to+Host+Defense%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Enzymatic Hydrolysis of Pneumococcal Capsular Polysaccharide Renders the Bacterium Vulnerable to Host Defense.</a> Infection and Immunity. , (2018).</li>
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<li>Tian, H., Weber, S., Thorkildson, P., Kozel, T. R., Pirofski, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+opsonic+and+nonopsonic+serotype+3+pneumococcal+capsular+polysaccharide-specific+monoclonal+antibodies+against+intranasal+challenge+with+Streptococcus+pneumoniae+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Efficacy of opsonic and nonopsonic serotype 3 pneumococcal capsular polysaccharide-specific monoclonal antibodies against intranasal challenge with Streptococcus pneumoniae in mice.</a> Infection and Immunity. 77 (4), 1502-1513 (2009).</li>
<li>Parameswarappa, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Semi-synthetic+Oligosaccharide+Conjugate+Vaccine+Candidate+Confers+Protection+against+Streptococcus+pneumoniae+Serotype+3+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">A Semi-synthetic Oligosaccharide Conjugate Vaccine Candidate Confers Protection against Streptococcus pneumoniae Serotype 3 Infection.</a> Cell Chemical Biology. 23 (11), 1407-1416 (2016).</li>
<li>Jackson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Randomized+clinical+trial+of+a+single+versus+a+double+dose+of+13-valent+pneumococcal+conjugate+vaccine+in+adults+55+through+74+years+of+age+previously+vaccinated+with+23-valent+pneumococcal+polysaccharide+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Randomized clinical trial of a single versus a double dose of 13-valent pneumococcal conjugate vaccine in adults 55 through 74 years of age previously vaccinated with 23-valent pneumococcal polysaccharide vaccine.</a> Vaccine. 36 (5), 606-614 (2018).</li>
<li>Cywes-Bentley, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+to+a+conserved+antigenic+target+is+protective+against+diverse+prokaryotic+and+eukaryotic+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+USA%22%5BJournal%5D)">Antibody to a conserved antigenic target is protective against diverse prokaryotic and eukaryotic pathogens.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 110 (24), 2209-2218 (2013).</li>
<li>Fleck, R. A., Romero-Steiner, S., Nahm, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+HL-60+cell+line+to+measure+opsonic+capacity+of+pneumococcal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Diagnostic+Laboratory+Immunology%22%5BJournal%5D)">Use of HL-60 cell line to measure opsonic capacity of pneumococcal antibodies.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 12 (1), 19-27 (2005).</li>
<li>Collins, S. J., Ruscetti, F. W., Gallagher, R. E., Gallo, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Terminal+differentiation+of+human+promyelocytic+leukemia+cells+induced+by+dimethyl+sulfoxide+and+other+polar+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+USA%22%5BJournal%5D)">Terminal differentiation of human promyelocytic leukemia cells induced by dimethyl sulfoxide and other polar compounds.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 75 (5), 2458-2462 (1978).</li>
<li>Melnick, N., Rajam, G., Carlone, G. M., Sampson, J. S., Ades, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+novel+therapeutic+approach+to+treating+severe+pneumococcal+infection+using+a+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Vaccine+Immunology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a novel therapeutic approach to treating severe pneumococcal infection using a mouse model.</a> Clinical and Vaccine Immunology. 16 (6), 806-810 (2009).</li>
<li>Dwyer, M., Gadjeva, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opsonophagocytic+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Opsonophagocytic assay.</a> Methods in Molecular Biology. 1100, 373-379 (2014).</li>
<li>Burton, R. L., Nahm, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+fourfold+multiplexed+opsonophagocytosis+assay+for+pneumococcal+antibodies+against+additional+serotypes+and+discovery+of+serological+subtypes+in+Streptococcus+pneumoniae+serotype+20%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Vaccine+Immunololgy%22%5BJournal%5D)">Development of a fourfold multiplexed opsonophagocytosis assay for pneumococcal antibodies against additional serotypes and discovery of serological subtypes in Streptococcus pneumoniae serotype 20.</a> Clinical and Vaccine Immunololgy. 19 (6), 835-841 (2012).</li>
<li>Clarke, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-cost%2C+high-throughput%2C+automated+counting+of+bacterial+colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Low-cost, high-throughput, automated counting of bacterial colonies.</a> Cytometry Part A. 77 (8), 790-797 (2010).</li>
<li>Aanei, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Database-guided+Flow-cytometry+for+Evaluation+of+Bone+Marrow+Myeloid+Cell+Maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Database-guided Flow-cytometry for Evaluation of Bone Marrow Myeloid Cell Maturation.</a> Journal of Visualized Experiments. (141), e57867(2018).</li>
<li>Hirz, T., Dumontet, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+Isolation+and+Analysis+to+Determine+their+Role+in+Lymphoma+Cell+Sensitivity+to+Therapeutic+Agents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visulaized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents.</a> Journal of Visulaized Experiments. (109), e53846(2016).</li>
<li>Rieger, A. M., Nelson, K. L., Konowalchuk, J. D., Barreda, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+annexin+V%2Fpropidium+iodide+apoptosis+assay+for+accurate+assessment+of+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Modified annexin V/propidium iodide apoptosis assay for accurate assessment of cell death.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), 2597(2011).</li>
<li>Blair, O. C., Carbone, R., Sartorelli, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+HL-60+promyelocytic+leukemia+cells%3A+simultaneous+determination+of+phagocytic+activity+and+cell+cycle+distribution+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Differentiation of HL-60 promyelocytic leukemia cells: simultaneous determination of phagocytic activity and cell cycle distribution by flow cytometry.</a> Cytometry. 7 (2), 171-177 (1986).</li>
<li>Middleton, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+the+Streptococcus+pneumoniae+type+3+capsule-specific+glycoside+hydrolase+of+Paenibacillus+species+32352%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of the Streptococcus pneumoniae type 3 capsule-specific glycoside hydrolase of Paenibacillus species 32352.</a> Glycobiology. 28 (2), 90-99 (2018).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

OPKAs servir papéis essenciais na avaliação de respostas imunes de anticorpo mediada induzidas pela vacinação6,8. O principal significado deste OPKA simplificado é a capacidade de adaptação nas condições a serem testadas (ou seja, anticorpos, enzimas tratamentos, etc.). Neste sentido, este ensaio pode ser usado para testar a contribuição de opsoninas (ou seja, anticorpos) na fagocitose, mas pode também ser usado para avaliar maneiras de superar os fatores de viru...

O opsonophagocytic matar o ensaio (OPKA) é uma ferramenta fundamental para vinculação de alterações na estrutura bacteriana ou função alterações posteriores na resposta imune e na função. Como tal, é frequentemente usado como um ensaio complementar para determinar baseados em imune a eficácia de tratamentos anticorpo candidatos vacinais, otimização de enzimas, etc. Enquanto os ensaios in vivo são necessários para determinar o espaço livre efetivo ou proteção em um modelo de infecção bacteriana, o OPKA pode ser usado para avaliar a contribuição imune à morte da célula bacteriana componentes mais básicos: bactérias, células do sistema imunológico e experimental tratamentos. Estudos anteriores mostraram que os OPKAs podem ser modificados e utilizados para uma variedade de bactérias e sorotipos, incluindo Streptococcus pneumoniae1, Staphylococcus aureus2, Pseudomonas aeruginosa3. Além disso, estes ensaios otimizados podem ser usados para avaliar diferentes tratamentos experimentais, incluindo a capacidade de uma enzima para tornar a bactéria mais acessíveis aos tratamentos4 e anticorpo de células do sistema imune mediada por complemento para melhorar opsonização5. Classicamente, ensaio OPKA tem sido utilizado com sucesso na investigação básica e clínica configurações como um indicador poderoso para proteção induzida por anticorpos específicos do patógeno6,7,8,9 .
Diferentes tipos de células do sistema imunológico podem ser utilizados para avaliação de matar opsonophagocytic. Uma população fagocítica comumente usada é a linha de células leucêmicas humanas HL-60. Esta linha de celular pode ser mantida como promielócitos inactivados em cultura; no entanto, eles podem ser diferenciados em vários Estados ativados via drogas diferentes tratamentos10,11. Tratamento de HL60 com N, N-dimetilformamida diferencia a linha celular em neutrófilos ativados com forte atividade fagocítica11. Enquanto as células HL-60 foram otimizadas e são frequentemente utilizadas para estes ensaios de fagocitose10, outros leucócitos polimorfonucleares primários podem ser usados como o braço imune do experimento12.
Além disso, estes ensaios podem ser simplificados13 ou multiplexagem14 olhar para várias estirpes resistentes aos antibióticos das bactérias a ser testado. O método multiplexado tornou-se mais viável através do desenvolvimento de software que pode eficientemente contar bactérias formadoras de unidades (CFUs) por ponto sobre uma placa de ágar15. Aqui, descrevemos um método simplificado usando uma estirpe bacteriana, células HL-60, complemento de coelho bebê e placas de ágar sangue. Com este método, vários tratamentos podem ser avaliados rapidamente, para abordar questões específicas de investigação sobre como a resposta imune inata a infecção bacteriana pode ser modulada.

<table><tbody><tr><td>Anexina V (conjugada com APC)</td><td>BioLegend</td><td>640919</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD35, humano (conjugado com PE)</td><td>BioLegend</td><td>333405</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD71, humano (conjugado com PE)</td><td>BioLegend</td><td>334105</td><td></td></tr><tr><td>cepa bacteriana a ser usada (ou seja, Streptococcus pneumoniae, WU2)</td><td>Laboratório de Referência Respiratória Bacteriana (Dr. Moon Nahm)&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>placas de ágar sangue</td><td>Hardy Diagnostic</td><td>A10</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Clone serum</td><td>HyClone</td><td>SH30080.03</td><td></td></tr><tr><td>glicerol</td><td>Sigma</td><td>G9012-1L</td><td></td></tr><tr><td>HL-60 células</td><td>ATCC</td><td>CCL-240</td><td></td></tr><tr><td>IgG Controle de isotipo (PE conjugado)</td><td>BioLegend</td><td>400907</td><td></td></tr><tr><td>N,N-dimetilformamida (DMF)</td><td>Fisher Meios químicos</td> de <td></td> Sigma P4864 RPMI do iodeto do propídio de UN2265 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> com L-glutamina Corning 10-040-CV <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ensaio de matar opsonophagocytic para avaliar as respostas imunológicas contra patógenos bacterianos

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

Um aspecto fundamental da resposta imune a colonização bacteriana do host é fagocitose. Um ensaio de matança de opsonophagocytic (OPKA) é um procedimento experimental em que células fagocíticas são co cultivadas com unidades bacterianas. As células do sistema imunológico irão fagocitar e matar as culturas bacterianas de forma dependente de complemento. A eficiência da matança imune mediada por células é dependente de uma série de fatores e pode ser usada para determinar bacteriano como diferente culturas comparam no que diz respeito a resistência à morte celular. Desta forma, a eficácia da terapêutica potencial imunológico-baseado pode ser avaliada contra estirpes de bactérias específicas e/ou serótipos. Neste protocolo, descrevemos um OPKA simplificado que utiliza condições de cultura de base e célula contando determinar a viabilidade celular bacteriana após co-cultura com condições de tratamento e HL-60 células do sistema imunológico. Este método tem sido utilizado com sucesso com um número de diferentes sorotipos de pneumococo, capsulares e estirpes de acapsular e outras espécies bacterianas. As vantagens deste protocolo OPKA são sua simplicidade, versatilidade (como este ensaio não é limitado aos tratamentos de anticorpo como opsoninas) e a minimização do tempo e reagentes para avaliar grupos experimentais básicos.

Validação de HL-60 diferenciação deve ser executada antes de iniciar o OPKA. Isso pode ser feito usando citometria de fluxo para determinar a expressão extracelular de CD11b, CD35, CD71 e anexina V (Figura 1). Iodeto de propidium também pode ser usado como um marcador da viabilidade. Após o tratamento com DMF durante 3 dias, a expressão de CD35 deve ser aumentada (≥55% de todas as células) e expressão de CD71 deve ser diminuída (≤20% de todas as células). Deve ser a porcentagem de células de...

Este ensaio de matança de opsonophagocytic é usado para comparar a capacidade de células fagocíticas de imunes a responder e matar as bactérias com base em diferentes tratamentos e/ou condições. Classicamente, este ensaio serve como o padrão ouro para avaliar funções efetoras dos anticorpos produzidos contra uma bactéria como opsoninas.

Ensaio de matar Opsonophagocytic para avaliar as respostas imunológicas contra patógenos bacterianos

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...

Este ensaio liga a modulação da estrutura bacteriana e função à atividade antibacteriana baseada em células imunes. Como tal, um imunoterapêutico chave de um tratamento potencial pode ser avaliado na determinação da probabilidade de melhor liberação bacteriana. O ensaio de morte opsonofofocítico tradicionalmente serve como padrão-ouro para avaliar funções eficazes de anticorpos levantados contra a bactéria como obsonant.Este protocolo oferece simplicidade e versatilidade sobre os ensaios padronizados de alto rendimento existentes. Neste protocolo, investigamos os efeitos de um tratamento medicamentoso na pneumonia estreptococo e como esses efeitos se traduzem em fagocitose melhorada da bactéria. Aqui, aplicamos o OPKA em células de pneumonia estreptococo.No entanto, este protocolo pode ser adotado para avaliar a morte fagocítica de outros patógenos por células imunes. Dedique tempo para otimizar os estoques bacterianos e garantir que os CFUs finais a serem contados se enlouqueçam dentro da faixa ideal. Recomendamos fortemente o uso da citometria de fluxo para garantir que as células HL60 sejam viáveis e ativas e tentando diferentes condições culturais para garantir células funcionalmente ativas.A demonstração visual dará uma melhor compreensão de como a amostra deve ser emplacado e como alcançar amostras contáveis. Para começar, prepare a mídia de cultura celular HL60 composta por 500 mililitros RPMI complementados com L-glutamina e 15 mililitros de soro bovino fetal inativado. Para a propagação e manutenção de células HL60, cultura cinco milhões de células em 10 mililitros de mídia de cultura celular HL60 em frascos de 75 centímetros quadrados ventilados a 37 graus celsius e 5% de dióxido de carbono.Para gerar estoques de trabalho de células HL60, adicione aproximadamente um milhão de células por mililitro na mídia cultural HL60 complementada com sulfóxido de 10% de dimetil em tubos criogênicos mililitros. Para diferenciar as células HL60, a cultura 1,5 vezes 10 para as sete células em 15 mililitros de mídia de cultura celular HL60 complementada com 0,6% DMF em filtro estéril tampado frascos de 75 centímetros quadrados a 37 graus celsius e 5% dióxido de carbono por três dias antes da OPKA. Para preparar as amostras de estoque bacteriano, cresça a cepa bacteriana WU2 em um caldo apropriado por aproximadamente duas a quatro horas a 37 graus celsius.Em seguida, pelotar as bactérias por centrifugação a seis mil vezes G por dois minutos e resuspensar as células em 10 a 30 mililitros de 15% glicerol no caldo apropriado. Alíquotar da cultura das bactérias em tubos de centrífugas estéreis de 1,5 mililitro e armazenar a 80 graus celsius. Em seguida, descongele um frasco de caldo bacteriano em um banho de água de 37 graus celsius.Pelota as células bacterianas e resuspend em 500 microlitres de OBB em condições estéreis. Diluições de placas do estoque bacteriano não tratado em placas de ágar de sangue e cultura as placas durante a noite a 30 graus celsius. Após a etapa de incubação, conte as colônias para cada diluição de estoque bacteriano não tratado co-cultivado com células HL60.Registo qual diluição de bactérias produz o número ideal de colônias contáveis para futuros OPKAs com este estoque bacteriano. Descongele um tubo de estoque bacteriano. Bactérias de pelotas a seis mil vezes G por dois minutos e resuspensam a pelota celular em OBB na diluição ideal obtida na etapa anterior.Pipeta 10 microliters da diluição bacteriana resuspended por poço em uma placa redonda de cultura de células de fundo 96. Em seguida, adicione 20 microliters de um anticorpo apropriado ou um tratamento medicamentoso a cada poço experimental em duplicata. Para poços de controle, utilize 1XPBS ou OBB dependendo do buffer utilizado para os poços de tratamento.Agite a placa de amostra a aproximadamente 90 rpm em temperatura ambiente por uma hora. Para colher as células diferenciadas HL60 que são tratadas com DMF três dias antes, pelota as células a 500 vezes G por três minutos. Descarte o supernatante e lave a pelota com pelo menos 10 mililitros de 1XPBS.Pelota as células lavadas a 500 vezes G por três minutos. Descarte o supernatante e resuspenque as células na OBB. Adicione soro de coelho bebê não diluído estéril em um volume final de um a cinco.Após uma hora de cultura bacteriana, divida cada amostra em poços duplicados para dois grupos. Em seguida, adicione 50 microliters da mistura complementar HL60 a cada conjunto experimental de poços e 50 microliters de OBB apenas aos poços de bactérias. Agite a placa 96 a 37 graus celsius por uma hora.Para colher amostras, diluir cada poço com OBB em um volume final de um a cinco para que cada amostra tenha um volume de pelo menos 50 microlitadores. Em seguida, pipeta 50 microliters de cada amostra diretamente em uma área designada de uma placa de cultura bacteriana, garantindo um espaçamento adequado entre as amostras. Cubra e deixe as amostras secarem por aproximadamente 15 minutos à temperatura ambiente.Inverta as placas e a cultura durante a noite a 30 graus celsius. Alternativamente, placas de cultura em frascos anaeróbicos para testar se as condições anoxicas afetam o crescimento bacteriano ou para controlar a morfologia. Após a cultura da noite para o dia, conte as colônias em cada área amostral designada e prossiga para analisar dados comparando o número de células vivas em cada conjunto com os controles correspondentes.Os aspectos mais difíceis de estabelecer essa técnica pela primeira vez provavelmente serão otimizar os CFUs iniciais do estoque bacteriano, bem como garantir que as células HL60 sejam efetivamente diferenciadas. Antes de iniciar o OPKA, a diferenciação HL60 foi validada usando citometria de fluxo com iodeto de propídio como marcador de viabilidade. Após ser tratado com DMF por três dias, a expressão de CD35 foi aumentada e a expressão de CD71 foi diminuída.Os percentuais médios de CFUs bacterianas nos grupos tratados hl60 em comparação com os grupos tratados não-HL60 correspondentes foram utilizados para comparar a sobrevida celular bacteriana de diferentes tratamentos. Os resultados mostraram que, com um tratamento eficaz, o número de colônias foi diferente entre a cocultura HL60 e nenhuma célula HL60, indicativo de fagocitose mais eficiente. Os resultados mostraram que quando a diluição bacteriana não foi otimizada ou o crescimento da colônia não foi cuidadosamente observado após o revestimento, o crescimento excessivo das colônias poderia impedir a contagem precisa das colônias.A coisa mais importante a ser lembrada ao tentar este procedimento é monitorar cuidadosamente a incubação bacteriana para evitar o crescimento excessivo das UFC. Ensaios in vivo podem ser usados para avaliar o desembaraço bacteriano eficaz dentro de um hospedeiro. Estes ensaios podem ser usados para confirmar que a eficácia imunológica observada com o OPKA é traduzível para modelos humanos ou animais.O ensaio de morte opsonofocítico tem sido usado para grande efeito em pesquisas significativas anteriores para vincular terapias antibacterianas a respostas imunes fagosticas. Trabalhar com patógenos bacterianos pode ser perigoso. Por favor, use equipamentos pessoais de proteção o tempo todo durante este ensaio.

opsonophagocytic-killing-assay-to-assess-immunological-responses

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Nós apresentamos um ensaio de fluxo de alto rendimento por citometria de determinar a atividade fagocítica de antígenos-anticorpos específicos a partir de amostras clínicas, utilizando antígenos fluorescentes revestido contas e uma linha celular monocítica expressar múltiplos receptores Fc-proporcionando o uso do receptor e determinações atividade fagocitária em um padronizados e forma reproduzível para qualquer antígeno de interesse.

Determinação da atividade fagocítica de amostras de anticorpos Clínica

Fonte: Nagre, N., et al. Macrófago alveolar, fagocitose e eliminação bacteriana em camundongos. J. Vis. Exp. (2019).Este vídeo demonstra a avaliação da fagocitose mediada pelo receptor do complemento usando glóbulos vermelhos de ovelha opsonizados com IgM e complemento, seguida de sua absorção por macrófagos de camundongos. A extensão da fagocitose é quantificada medindo um produto cromogênico azul formado por oxidação catalisada por hemoglobina do diaminofluoreno.

Modelagem da Fagocitose Mediada por Complemento Usando Glóbulos Vermelhos Opsonizados In Vitro

Fonte: Seman, B. G., et.al. Modelo de imagem neonatal da sepse bacteriana Gram-negativa. J. Vis. Exp. (2020)Este vídeo demonstra o isolamento de neutrófilos e monócitos inflamatórios de baços de camundongos neonatais e sua aplicação em um ensaio luminescente que mata bactérias. Ele cobre dissociação mecânica, lise de glóbulos vermelhos, enriquecimento celular baseado em esferas magnéticas, incubação bacteriana e proteção antibiótica. Leituras de luminescência temporizadas indicam internalização...

Avaliação In Vitro da Morte Bacteriana por Fagocitos Esplênicos de Camundongos Neonatais

Este vídeo demonstra uma técnica para avaliar a atividade bactericida mediada por complemento de anticorpos presentes no soro. Essa abordagem combina soro isolado com bactérias patogênicas e proteínas exógenas do complemento. Após a incubação, as bactérias são cultivadas em uma placa de ágar e as colônias produzidas são quantificadas para medir o título bactericida sérico.

Um ensaio bactericida sérico para a atividade bactericida mediada por complemento de anticorpos

Neste vídeo, demonstramos um ensaio para detectar a citotoxicidade de cepas virulentas e menos virulentas de Staphylococcus aureus contra neutrófilos humanos após fagocitose usando citometria de fluxo.

Ensaio de citotoxicidade de cepas de Staphylococcus aureus em neutrófilos após fagocitose

O vídeo mostra um ensaio de morte opsonofagocítica in vitro usando uma co-cultura de neutrófilos humanos com Streptococcus pneumoniae. Anticorpos e proteínas do complemento facilitam a opsonização da bactéria, permitindo que os neutrófilos reconheçam e matem bactérias, mostrando atividade opsonofagocítica de neutrófilos bem-sucedida.

Avaliação da atividade de morte opsonofagocítica contra patógenos bacterianos

Este vídeo demonstra um ensaio de opsono-aderência para examinar a interação entre bactérias opsonizadas e células imunes. Bactérias marcadas com fluorescência, tratadas com soro de teste contendo anticorpos anticápsula, são incubadas com macrófagos. Após a coloração dos macrófagos com fluorescência, as bactérias aderidas na superfície dos macrófagos são observadas ao microscópio para visualização.

Um ensaio de opsonidade para avaliar a opsonização de bactérias encapsuladas por anticorpos anticápsula

Aqui, apresentamos um protocolo para medir a virulência das bactérias planctônicas ou conectado à superfície usando d. discoideum (ameba) como um host. Virulência é medida durante um período de 1h e anfitrião matando é quantificada usando análise de imagem e de microscopia de fluorescência. Vamos demonstrar a este protocolo utilizando a bactéria p. aeruginosa.

Um ensaio rápido de virulência bacteriana baseada em imagem usando ameba

Aqui nós apresentamos um protocolo elegante na vivo avaliação da vacina respostas imunes de eficácia e de acolhimento. Este protocolo pode ser adaptado para modelos de vacina que estudar virais, bacterianas ou parasitárias patógenos.

Avaliação das respostas do hospedeiro-patógeno e eficácia da vacina em camundongos

Aqui nós apresentamos um protocolo para medir a atividade Shigellacidal de anticorpos no soro. Soro é misturado com bactérias e complemento exógeno, incubado, e a mistura de reação é revestida em placas de ágar. Bactérias viáveis formam colônias que são contadas, usando um enumerador de colônia automatizado e usado para determinar a concentração bactericida.

Um do elevado-throughput Shigella-ensaio bactericida específico

O ensaio opsono-adesão é um método alternativo ao ensaio opsono-fagocítico de matar para avaliar as funções opsônicas dos anticorpos no desenvolvimento de vacinas.

Ensaio opsono-adesão para avaliar anticorpos funcionais no desenvolvimento de vacinas contra bacillus anthracis e outros patógenos encapsulados

Aprenda o ensaio de matar opsonofagocítico para avaliar respostas imunológicas contra Streptococcus pneumoniae. Este método padronizado mede a eficácia de anticorpos na eliminação bacteriana por células fagocíticas.

Ensaio de matar Opsonophagocytic para avaliar as respostas imunológicas contra patógenos bacterianos

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