Investigando alterações na microbiota de caecum após traumatismo cranioencefálico em camundongos
19 de setembro de 2019
É apresentado aqui um protocolo para induzir ferimento de cérebro traumático difuso usando um dispositivo de percussão fluido lateral seguido pela coleção do índice do cécum para a análise do microbioma do intestino.
A simultânea e as interações entre o cérebro e a microbiota intestinal permanecem desconhecidas. Use esta técnica, alterações na microbiota intestinal após lesão cerebral traumática em camundongos podem ser examinados. A principal vantagem dessa técnica é que ela é relativamente simples e eficiente.
Demonstrando o procedimento será Wendong Você, um estudante de pós-graduação do meu laboratório. Para indução traumática de lesão cerebral, confirme a falta de resposta ao beliscão do dedo do pé em um rato anestesiado, e aplique pomada nos olhos do animal. Após a barba, desinfete a pele exposta do couro cabeludo com 70% de etanol antes de incisar o couro cabeludo em um plano sagital.
Usando fórceps, retraia a incisão em ambos os lados e separa ligeiramente o periósteo. Use um marcador para desenhar um círculo de três milímetros de diâmetro na área parietal direita do crânio a dois milímetros da linha média. Use uma broca elétrica para penetrar cuidadosamente o crânio sem danificar a dura.
Remova a aba óssea para expor uma janela óssea de três milímetros e coloque uma cânula de lesão plástica sobre a craniotomia. Depois de cimentar a cânula no crânio com acrílico dental, use uma seringa de cinco mililitros para encher a cânula com soro fisiológico estéril de 0,9%, tomando cuidado para evitar bolhas. Ligue o osciloscópio e o amplificador.
Confirme que o tubo de alta pressão do dispositivo de lesão de percussão de fluido lateral está livre de bolhas de ar, e entregue cerca de 10 pulsos de teste, até que o dispositivo dê um sinal constante. Ajuste o ângulo da posição inicial do pêndulo para atingir uma intensidade de pulso de cerca de duas atmosferas padrão e conecte a cânula da lesão ao dispositivo de lesão de percussão do fluido lateral. Puxe o gatilho para liberar o pêndulo, induzindo a lesão cerebral.
Em seguida, obtenha e transmita um pulso para a dura dura através de todo o sistema de tubos fechado e cheio de fluidos. Após indução de lesão cerebral, remova a cânula e sutura a incisão. Em seguida, coloque o rato em uma almofada de aquecimento com monitoramento até que ele seja ambulatorial, antes de devolver o animal à sua gaiola de origem com acesso a ad libitum à comida e água.
Nos pontos de tempo experimentais indicados, exponha os intestinos de acordo com os protocolos padrão e use fórceps atrauáticos para separar suavemente o caeco dos outros tratos intestinais. Quando o tecido estiver localizado, corte o caecum com uma tesoura afiada e extraia manualmente o conteúdo do caeco em um curativo estéril. Em seguida, transfira o conteúdo para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro, para armazenamento de menos 80 graus Celsius até a análise do microbioma.
Sequenciamento de DNA recombinante 16S demonstra uma diversidade reduzida na microbiota de caecum em camundongos três dias após lesão cerebral traumática, com a taxa mais abundante dentro do conteúdo de caecum dos grupos de lesão cerebral sham e traumática mostrados na figura. Além disso, o dimensionamento multidimensional não métrico revela alterações na composição da microbiota do caecum após lesão cerebral traumática. Lembre-se de manter a duraza intacta ao perfurar o crânio, e ser gentil ao localizar e separar o caeco de outros tratos intestinais.
Após este procedimento, a coloração e análise de hematoxilina e eosina pode ser realizada para examinar a alteração histológica e a resposta inflamatória dentro dos tratos intestinais após lesão cerebral traumática.
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Visão Geral
Este estudo apresenta um protocolo para induzir lesão cerebral traumática (TBI) difusa utilizando um dispositivo de percussão lateral por fluido em camundongos. Após a lesão, o estudo investiga alterações na microbiota intestinal mediante a coleta de conteúdos cegais para análise. A abordagem tem como objetivo elucidar as interações entre lesão cerebral e a composição da microbiota intestinal.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Neurociência
- Análise do microbioma
- Pesquisa sobre lesão cerebral traumática
Antecedentes
- Compreender as relações entre o cérebro e a microbiota intestinal é essencial na pesquisa sobre lesão cerebral traumática (TBI).
- O conhecimento atual sobre como a TBI afeta a microbiota intestinal é limitado.
- O uso de camundongos como organismo modelo permite condições experimentais controladas.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um protocolo confiável para induzir TCE e analisar as alterações subsequentes no microbioma intestinal.
- Investigar possíveis correlações entre lesão neurológica e diversidade da microbiota intestinal.
- Fornecer insights sobre os impactos do TCE na saúde geral e nas interações com o microbioma.
Métodos Utilizados
- Um dispositivo de percussão lateral de fluido foi utilizado para induzir TCE em camundongos anestesiados.
- Procedimentos cirúrgicos cuidadosos foram realizados, incluindo perfuração do crânio e implante de cânula.
- Após a lesão, conteúdos do ceco foram coletados para análise do microbioma e armazenados adequadamente.
- A sequenciação do 16S rDNA foi empregada para determinar alterações na diversidade e composição da microbiota.
Resultados Principais
- A análise indicou diversidade reduzida na microbiota do ceco dentro de três dias após TCE.
- A escala multidimensional não métrica demonstrou alterações significativas na composição da microbiota após a lesão.
- O estudo destaca a necessidade de cautela ao manipular tecidos e manter condições estéreis.
Conclusões
- Este estudo estabelece uma metodologia para explorar o eixo intestino-cérebro no contexto do TCE.
- Os achados sugerem que o TCE pode perturbar a microbiota intestinal, o que poderia ter implicações para a recuperação.
- O aprimoramento do conhecimento sobre as interações entre o intestino e o cérebro poderá orientar futuras estratégias terapêuticas para o TCE.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este protocolo permite a desmistificação mecanicista do eixo microbiota-intestino-cérebro na pesquisa de lesão cerebral traumática, fornecendo um modelo reprodutível para avaliar alterações no microbioma após a lesão. Ele apoia a validação de alvos e a descoberta de biomarcadores ao associar trauma neurológico a mudanças quantificáveis na composição da microbiota do ceco. A abordagem aumenta a confiança preditiva em estudos pré-clínicos ao padronizar os protocolos de indução de TCE e coleta de amostras do microbioma.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite investigar hipóteses sobre o eixo intestino-cérebro mediante a medição de alterações na diversidade da microbiota após indução controlada de TCE.
- Valor Operacional: Fornece um procedimento cirúrgico e de coleta padronizado para obtenção consistente da microbiota do ceco entre grupos experimentais.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera saídas quantitativas de sequenciamento de rDNA 16S para caracterizar alterações na composição microbiana em amostras de ceco.
- Valor Operacional: Estabelece um fluxo de trabalho reprodutível para análise do microbioma que pode ser integrado a protocolos de triagem de terapêuticas direcionadas ao intestino.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Apoia a modelagem de sistemas relevantes para doenças ao correlacionar a gravidade do TCE com alterações no microbioma em um modelo murino.
- Valor Operacional: Permite o acompanhamento longitudinal das alterações na microbiota para orientar decisões de avanço ajustadas ao risco em programas pré-clínicos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método integra a biologia da descoberta e a validação pré-clínica ao padronizar a indução de TCE e a análise do microbioma intestinal para redução de riscos do alvo.
- Biologia da Descoberta: Facilita a testagem de hipóteses sobre interações microbiota-intestino-cérebro por meio de lesões controladas e caracterização do microbioma.
- Triagem: Fornece amostras padronizadas de microbiota do ceco adequadas para sequenciamento 16S e análise de diversidade.
- Análises: Permite comparação quantitativa da composição microbiana por meio de escalonamento multidimensional não métrico e métricas de diversidade.
- Pesquisa Translacional: Conecta modelos de lesão neurológica a biomarcadores do microbioma para continuidade pré-clínica.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para o estudo da modulação do eixo intestino-cérebro em modelos de doenças neurológicas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista na pesquisa do eixo intestino-cérebro ao fornecer leituras quantificáveis da microbiota após TCE.
- Valor Operacional: Garante reprodutibilidade por meio de protocolos padronizados de cirurgia, coleta de amostras e sequenciamento.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avançar/não avançar ao associar modelos de TCE a assinaturas de biomarcadores baseadas no microbioma.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de compostos que visam as interações intestino-cérebro na recuperação do TCE.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em procedimentos cirúrgicos em camundongos e manipulação estéril de tecidos.
- Depende do acesso a dispositivos de lesão por percussão lateral de fluido e infraestrutura para sequenciamento de DNA ribossomal 16S.
- Necessita padronização entre equipes de neurociência e análise de microbioma.
- Envolve considerações de adaptação para amostragem do ceco em diferentes linhagens de camundongos ou modelos de lesão.
- Limitado pela necessidade de técnica asséptica durante a dissecação de tecido intestinal para prevenir contaminação.
