Name: Realização de espectroscopia em nanopartículas Plasmonicas com microscopia de contraste de interferência diferencial de tipo Nomarski baseado em transmissão (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-05T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Aprenda a realizar espectroscopia em nanopartículas plasmônicas usando microscopia DIC de alta resolução. Este protocolo demonstra preparação de amostras de ouro e técnicas de imagem para ambientes complexos.

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Dr. Anthony S. Stender deseja reconhecer o apoio técnico através do nanoscale e Quantum fenômenos Institute (NQPI) na Universidade de Ohio. Este artigo foi tornado possível com o financiamento do start-up fornecido ao Dr. Stender pela Universidade de Ohio.

1. preparação da amostra com lâminas de microscopia de vidro padrão
<ol><li>Prepare lâminas de microscópio de vidro para deposição de amostras. Nota: em algumas circunstâncias, pode ser mais apropriado para armazenar o vidro em água ultrapura em vez de etanol. No entanto, armazenar em água ou ar faz com que o vidro hidrofóbico ao longo do tempo.<ol>
<li>Para melhores resultados, compre o vidro ou o microscópio de quartzo desliza e cubra o vidro.</li>
		<li>Usando uma pena de scribing, coloc uma marca rasa e curta do risco no centro de cada deslizamento de tampa de vidro.</li>
		<li>Limpe todo o vidro do microscópio, mesmo se é comprado "pre-limpado", para remover fragmentos de vidro, poeira, pó, resíduo orgânico, e todos os outros contaminadores que afetam a qualidade de imagem latente ou a deposição da amostra. Nota: Este método de limpeza abaixo funciona bem para os tipos de amostras descritas aqui e evita o uso de produtos químicos agressivos. Os produtos químicos mais duros podem gravar o vidro e exigir mais cuidado na manipulação e na eliminação.<ol>
<li>Coloc o vidro do microscópio em cremalheiras do armazenamento e então em um Beaker, ou em um frasco de coloração. Não coloc o vidro do microscópio na parte inferior dos copos e dos outros produtos vidreiros do laboratório sem racking, porque cada parte e superfície do vidro do microscópio devem inteiramente ser expor aos agentes de limpeza.</li>
			<li>Despeje ~ 1 mL de detergente líquido (tabela de materiais) no recipiente e em cima do recipiente com água. SONICATE por 30 min. Nota: uma vez que o processo de limpeza começa, apenas Manuseie o vidro enquanto estiver usando luvas, para evitar deixar resíduos de impressões digitais no vidro.</li>
			<li>Despeje o conteúdo líquido do recipiente de limpeza em uma pia. Enxague o recipiente várias vezes com água ultrapura para remover toda a aparência de detergente. Encha o recipiente com água ultrapura. SONICATE o recipiente com vidro microscópio por mais 30 min.</li>
			<li>Repita a etapa anterior pelo menos uma vez mais. Realize rodadas adicionais de sonicação em água até que seja óbvio que todos os vestígios do detergente foram removidos.</li>
			<li>Despeje o conteúdo do recipiente de limpeza. Enxague o recipiente com água ultrapura. Encha o recipiente com etanol. SONICATE microscópio de vidro para 30 min.</li>
			<li>Despeje o conteúdo do recipiente de limpeza em um recipiente de resíduos. Reabasteça com etanol. Cubra o recipiente para evitar a perda de etanol através da evaporação. Armazene o vidro do microscópio neste recipiente até o tempo do experimento. As lâminas permanecem limpas e utilizáveis, desde que permaneçam submersas em etanol dentro de um recipiente coberto.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparação de solução de nanopartículas
	<ol>
<li>Utilizando uma micropipeta, retire uma alíquota de 100 μL de 0, 5 mg/mL de solução de nanopartículas de ouro do seu contentor de armazenamento original e ejecte a solução para um tubo de centrifugação de 1,5 mL.</li>
		<li>Centrifugue a amostra por 10 min a 6.000 x g.</li>
		<li>Retire o sobrenadante com uma micropipeta, a fim de remover o excesso de surfactante.</li>
		<li>Utilizando uma micropipeta, coloque 100 μL de água ultrapura no tubo de centrifugação. Nota: se nem todo o sobrenadante pode ser retirado na primeira tentativa, repita as etapas de centrifugação e resuspensão.</li>
		<li>Momentaneamente Vortex a amostra para ressusciter o pellet. SONICATE imediatamente depois de 20 min para totalmente ressuscite e quebrar agregados de nanopartículas. Nota: se a amostra não é usada imediatamente, deve ser sonicated outra vez para 20 minutos antes de depositar a solução no vidro do microscópio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Deposição de amostras
	<ol>
<li>Remova os deslizamentos limpos da tampa e as corrediças do microscópio de seus recipientes de armazenamento. Seque o vidro com nitrogênio pressurizado ou Argon.</li>
		<li>Usando uma micropipeta, drop-Cast 6 μL de solução de nanopartículas a partir do passo 1.2.5 para o deslizamento de cobertura. Para espalhar para fora a gota uniformente, coloc com cuidado um segundo, parte maior do vidro do microscópio sobre a corrediça da tampa, tal como um segundo deslizamento da tampa ou um slide do microscópio. Evite obter bolhas de ar presas entre as duas peças de vidro.<ol>
<li>Gire a carcaça da amostra sobre, e sele fora das bordas do deslizamento da tampa com uma linha estreita de lustrador de prego a fim impedir a evaporação da solução média.</li>
			<li>Alternativamente, para a imagem da amostra "seco", permitir que a solução para ficar por 5-15 min na tampa do deslizamento, antes de remover a peça indesejada de vidro. Soprar suavemente o deslizamento da tampa seco com nitrogênio pressurizado ou Argon.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Se possível, amostras de imagem imediatamente após a preparação. Se isso não for possível, armazene amostras em um recipiente coberto, como uma placa de Petri até a imagem.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. imagem latente de DIC
<ol><li>Alinhe o objetivo e o condensador.<ol>
<li>Depois de colocar a amostra sobre o microscópio, encontrar o plano focal com a amostra sobre ele. Primeiro Localize e concentre-se na marca de rascunho criada anteriormente. Em seguida, afinar o foco até que as nanopartículas entram em exibição.</li>
		<li>Para determinar a colocação exata do condensador, utilize o método da iluminação de Kohler. 5 a iluminação de Kohler na ampliação elevada (80x, 100x) é conseguida mais facilmente ajustando primeiramente a iluminação de Kohler em uma ampliação mais baixa, tal como 20x. Nota: normalmente, a iluminação de Kohler não precisa de ser reajustada durante a imagem latente de uma única amostra. Entretanto, é boa prática verificar que a iluminação de Kohler está ajustada corretamente ao comutar a uma corrediça nova do microscópio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Otimize as configurações de contraste.<ol>
<li>Selecione uma região de interesse dentro da amostra para geração de imagens. Centralize a região no campo de visão da câmera e ajuste o foco conforme necessário.<ol>
<li>Se o microscópio tem o projeto de Senarmont, comece com o polarizador ajustado perto à extinção máxima do fundo e gire gradualmente o polarizador para diminuir a extinção do fundo. A intensidade do fundo aumentará gradualmente.</li>
			<li>Se o microscópio não tem um projeto de Senarmont, comece com o trem ótico ajustado na extinção máxima do fundo. Neste caso, ajuste gradualmente a posição de prisma objetiva para diminuir a extinção do fundo. Nota: a definição ideal é alcançada quando as nanopartículas atingem a sua maior diferença de intensidade (i.e., contraste) a partir do valor de fundo local em média. Para nanopartículas plasmônicas, o contraste óptimo é conseguido normalmente com um fundo relativamente escuro, assim em ajustes perto da extinção máxima do fundo.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Imagem da amostra.<ol>
<li>Desligue a iluminação da sala para evitar que a iluminação disperda interaja com o processo.</li>
		<li>Ao visualizar as nanopartículas com uma câmera de imagem científica, determine o nível de plano de fundo ideal. Usando uma largura cheia de 10 nanômetro no filtro de faixa máximo da metade (FWHM) com seu comprimento de onda central colocalizado com o comprimento de onda principal de LSPR, vista a região do interesse. Ajuste a intensidade da lâmpada ou o tempo de exposição até que o nível de fundo esteja no intervalo de 15% – 40% do nível de capacidade máxima da câmera e nenhum objeto dentro da região de interesse exiba intensidades de sinal que excedam 90% do nível de intensidade máxima da câmera. Observação: o objetivo da etapa 2.3.2 é evitar saturar o sensor ao alternar entre os filtros. O nível de fundo ideal variará entre amostras e câmeras. Uma vez que esta etapa é terminada, o tempo da exposição pode ser ajustado mas não a intensidade da lâmpada.</li>
		<li>Imagem da amostra com uma série de filtros bandpass que cada um tem um FWHM de 10 nm e que, como um todo, permitir a imagem em toda a gama de comprimento de onda de interesse. Assegure-se de que a intensidade do fundo permaneça consistente da imagem à imagem (dentro de ~ 5% de uma outra) ajustando o tempo da exposição. Depois de alternar os filtros, refoque a amostra antes da captura de imagem.</li>
		<li>Salve as imagens como arquivos TIFF descompactados e/ou no formato de arquivo nativo do software, a fim de preservar todas as informações.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gire a amostra.<ol>
<li>Depois de coletar imagens da amostra em sua posição original, a amostra agora pode ser girada e imaged em orientações adicionais no caminho de luz. Realize a rotação em intervalos regulares (por exemplo, 10 ° ou 15 °) através de um intervalo de 180 ° ou de 360 °. Nota: a rotação requer um estágio de amostra rotativo.</li>
		<li>Como nas secções 2.1-2.3, ajuste as definições da câmara para fornecer um nível de fundo consistente da imagem à imagem. Nota: nenhum ajuste à iluminação de Kohler deve ser feito.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. análise de dados utilizando o ImageJ
Observação: os cálculos a seguir podem ser executados em uma variedade de pacotes de software e, às vezes, no programa nativo usado para coletar as imagens. ImageJ é um software livre disponível dos institutos nacionais de saúde (NIH).
<ol><li>Calcule o contraste ou a intensidade da partícula.<ol>
<li>Abra a imagem com o ImageJ.</li>
		<li>Selecione a ferramenta retângulo e desenhe um retângulo em torno da região principal de interesse.</li>
		<li>Na barra de ferramentas, selecione imagem, em seguida, zoom, em seguida, para seleção. A janela de imagem irá ampliar a área selecionada.</li>
		<li>Na barra de ferramentas, selecione imagem, em seguida, ajustar, em seguida, brilho/contraste. Aparece uma nova janela. Para permitir uma melhor visualização da região de amostra, ajuste as quatro configurações: mínimo, máximo, brilho e contraste. Esses ajustes não alteram os dados científicos, eles simplesmente permitem uma melhor visibilidade da região da amostra. Nota: as etapas 3.1.3 e 3.1.4 podem ser executadas várias vezes e em ordem inversa.</li>
		<li>Usando a ferramenta retângulo novamente, desenhe uma caixa em torno da primeira nanopartícula a ser medido. A caixa deve ser apenas ligeiramente maior do que o disco arejado da nanopartícula.</li>
		<li>Na barra de ferramentas, selecione analisare, em seguida, medir. Aparece uma nova janela que relata as intensidades mínima, máxima e média para os pixels localizados dentro da caixa selecionada.</li>
		<li>Arraste a caixa usada para medir a nanopartícula para uma área imediatamente adjacente à partícula, onde o contraste de fundo é relativamente mesmo e não há partículas ou contaminantes presentes. Mantenha o tamanho original da caixa.</li>
		<li>Use a ferramenta medida para determinar a intensidade média para a área de plano de fundo.</li>
		<li>Meça as partículas restantes e uma área de fundo adjacente para cada um.</li>
		<li>Repita o processo para cada partícula em todas as imagens da série.</li>
		<li>Exporte os dados para uma planilha para calcular o contraste ou a intensidade de cada partícula, em todos os comprimentos de onda e ângulos.</li>
		<li>Calcule o contraste de cada partícula, usando a seguinte equação13,14,15: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/59411/59411eq1.jpg"> Observação: usando essa equação, o contraste de partículas deve ser sempre &gt; 0.</li>
		<li>Calcule o valor máximo ajustado do fundo da partícula dividindo a intensidade de partícula máxima medida pela média do plano de fundo: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/59411/59411eq2.jpg">
</li>
		<li>Da mesma forma, calcule o valor mínimo ajustado pelo fundo dividindo a intensidade de partícula mínima medida pela média de fundo: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/59411/59411eq3.jpg"> Observação: conforme calculado, o máximo deve ter um valor maior que um, enquanto o mínimo será menor que um. É aceitável para subtrair cada valor por "1", para que o plano de fundo médio é essencialmente zero, o máximo é representado como um valor positivo e o valor mínimo é atribuído um valor negativo16. Esta última abordagem permite ao analista considerar separadamente o que está ocorrendo ao longo de cada um dos campos de polarização, o que é útil ao estudar partículas anisotrópicas.</li>
		<li>Para traçar graficamente o perfil espectral em uma determinada posição de nanopartícula, plotar dados com o comprimento de onda ao longo do eixo x e o contraste ou intensidade ao longo do eixo y.</li>
		<li>Para representar graficamente o perfil rotacional em um determinado comprimento de onda, plotar o ângulo de rotação ao longo do eixo x e o contraste ou intensidade ao longo do eixo y.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Funston, A. M., Novo, C., Davis, T. J., Mulvaney, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmon+Coupling+of+Gold+Nanorods+at+Short+Distances+and+in+Different+Geometries%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Plasmon Coupling of Gold Nanorods at Short Distances and in Different Geometries.</a> Nano Letters. 9 (4), 1651-1658 (2009).</li>
</ol>

O autor não tem nada a revelar.

Quando a imagem latente com microscopia de DIC, é crítico aperfeiçoar os componentes óticos antes de coletar dados. Mesmo pequenos ajustes para o polarizador no meio de um experimento podem resultar em impactos significativos para os dados finais6. Além disso, os materiais diferentes exigem ajustes diferentes do polarizador. Embora os tamanhos grandes da etapa fossem utilizados aqui para demonstrar o efeito do ângulo da polarização, em um experimento real, é imperativo aperfeiçoar o ajuste do pola...

Desde a década de 1980, a microscopia de contraste de interferência diferencial (DIC) tem sido largamente vista como um importante método de imagem reservado para objetos de microescala dentro das ciências biológicas. No entanto, durante o seu desenvolvimento na década de 1950 e 1960, foi concebido como uma técnica para a ciência dos materiais1. Com os avanços recentes nas ciências materiais relacionadas às nanopartículas plasmônicas, ocorreu um interesse aumentado na caracterização dos materiais com microscopia ótica.
Muitas técnicas ópticas estão certamente disponíveis para a caracterização nanomaterial (por exemplo, campo escuro, brightfield, luz polarizada, fluorescência, etc.). O campo escuro é amplamente popular na pesquisa da nanopartícula, mas confia unicamente na coleção do scatter e fornece a informação limitada sobre amostras complexas2. A fluorescência pode ser útil, mas somente com amostras que luminesce ou que podem corretamente ser manchadas. A microscopia de DIC tem diversos traços que o fazem uma ferramenta valiosa para a análise das nanopartículas. As vantagens mais frequentemente indicadas do DIC em comparação com outros métodos e em relação às nanopartículas plasmonicas são: nenhuma coloração da amostra exigida, nenhuns efeitos do Halo, profundidade de campo rasa, e definição lateral elevada3. DIC tem pontos fortes adicionais que são valiosos para a pesquisa de nanopartículas plasmônicas. Em primeiro lugar, dois campos de polarização inerente e ortogonal estão presentes, podendo ser medidos simultaneamente para fins de espectroscopia2. Em segundo lugar, o sinal depolarizado de nanopartículas não é capturado na imagem final2, que pode ser uma causa para a preocupação séria em medições de espectroscopia de campo escuro.
A finalidade deste artigo é fornecer uma metodologia desobstruída para utilizar a microscopia de Nomarski DIC da luz transmitida para executar a espectroscopia em nanopartículas plasmônicas. Embora DIC é uma técnica poderosa que pode ser aplicada a materiais altamente diversificados, é também uma técnica que requer grande habilidade e compreensão para operá-lo corretamente quando nanopartículas de imagem. A microscopia de Nomarski DIC baseada em transmissão tem um caminho de luz complexo1 que só será brevemente revisto aqui. O trem óptico de DIC é exibido na Figura 1. A luz é transmitida através do microscópio primeiramente sendo passada através de um polarizador e de um prisma de Nomarski da feixe-rachadura antes de ser focalizada pelo condensador no plano da amostra. Depois de passar pelo objetivo, a luz encontra um prisma de Nomarski feixe-combinando e um analisador antes de sair para o detector. Os dois polarizadores e prismas Nomarski são fundamentais para a formação da imagem DIC e são responsáveis pela produção de dois campos de polarização ortogonal do DIC1. Para o leitor interessado em saber mais sobre os princípios de funcionamento e o trajeto ótico de microscópios de Nomarski DIC, ou as diferenças entre Nomarski DIC e outros estilos de DIC, refira por favor outras contas bem escritas nestes tópicos1, 4. º , 5. º , 6 anos de , o 7.
É igualmente importante compreender a natureza básica das nanopartículas plasmonicas antes de tentar realizar espectroscopia neles, seja com Nomarski DIC, campo escuro ou qualquer outra técnica de microscopia. No campo da plasmómica, as nanopartículas são definidas como particulados com dimensões na escala de 10-100 nm8,9. As nanopartículas podem assumir muitas formas (por exemplo, esferas, hastes, estrelas, halteres, etc.), e a maioria de suas propriedades importantes surgem de interações com a luz na faixa infravermelha ultravioleta-visível-próxima do espectro eletromagnético. O termo "plasmonico" não se restringe a nanopartículas10; Entretanto, ao discutir nanopartículas, é usado na referência à ressonância de superfície localizada do Plasmon (LSPR). LSPR é um fenômeno em que os elétrons de condução em uma nanopartícula oscilam devido a uma interação Coulombic com radiação eletromagnética de uma faixa de freqüência altamente específica e relativamente estreita8. Nessas mesmas frequências, as nanopartículas plasmonicas exibem aumento da absorção e dispersão da luz, tornando-as observáveis com microscopia óptica. Em muitos casos, é preferível observar as nanopartículas ao colocar filtros de bandpass antes do condensador2, para melhorar o contraste de imagem e para eliminar a luz que não induz o efeito lspr. Usando filtros também torna possível realizar experimentos de espectroscopia de partícula única.
O comportamento óptico relacionado ao LSPR é altamente dependente do tamanho e da forma das nanopartículas, podendo ser investigado com muitas técnicas de microscopia óptica. No entanto, a fim de decifrar as informações de orientação de nanopartículas plasmonicas com uma forma anisotrópica (i.e., não esférica), é necessário utilizar a polarização do campo de luz. Ao girar cuidadosamente o campo de polarização ou o substrato da amostra em pequenos incrementos, é possível monitorar as propriedades espectroscópicas dependentes da orientação de nanopartículas individuais. A rotação e a polarização podem igualmente ajudar em determinar se uma característica espectral é devido a uma oscilação dipolar ou mais elevada da ordem dos elétrons de superfície da nanopartícula. No entanto, no caso de nanopartículas isotrópicas (i.e., esféricas), o perfil espectral permanece essencialmente inalterado ao girar a amostra luz polarizada.
Quando visualizado através de um microscópio DIC (Figura 2), as nanopartículas têm um disco arejado com uma aparência branca e preta projetada em sombra contra um fundo cinza. As nanopartículas esféricas conservarão esta aparência a rotação e com a mudança de filtros do bandpass; Entretanto, as partículas desvanecem-se gradualmente da vista porque o comprimento de onda central do filtro torna-se mais separado do comprimento de onda dipolar único11da esfera. A aparência de Nanorods pode mudar muito dramaticamente como eles são girados2. Os Nanorods têm duas bandas LSPR com comportamento dipolar, cuja localização é baseada nas dimensões físicas dos Nanorods. Quando o eixo longitudinal de um diamante é orientado paralelamente a um dos campos de polarização DIC, o disco arejado aparecerá todo branco ou preto, se visualizado com um filtro de passe associado a esse comprimento de onda lspr. Depois de girar a amostra 90 °, ele vai assumir a cor oposta. Alternativamente, uma vez que a linha central transversal de um diamante é perpendicular ao eixo longitudinal, a haste tomará na cor oposta ao comutar entre os filtros que combinam os comprimentos de onda de lspr para os dois machados. Em outras orientações e configurações de filtro, os Nanorods parecerá mais como esferas, apresentando uma variedade de padrões de disco arejados de sombra-Cast. Para Nanorods com um eixo transversal &lt; 25 nanômetro, pode ser difícil detectar o sinal nesse comprimento de onda do LSPR usando a microscopia de DIC.
Para realizar a espectroscopia de partícula única, é importante usar os componentes ópticos corretos e alinhá-los corretamente. Um objetivo capaz da microscopia de DIC deve ser usado. Para experimentos de partículas únicas, os objetivos do óleo 80x ou 100x são ideais. Os prismas de Nomarski DIC ordinariamente vêm em três variedades: padrão, alto contraste, e alta resolução. O tipo ideal depende altamente da finalidade do experimento e do tamanho das nanopartículas. Prismas padrão são bons para muitos experimentos; Mas ao trabalhar com nanopartículas menores (&lt; 50 nm), os prismas de alto contraste podem ser benéficos, pois o contraste de partículas diminui à medida que as partículas diminuem no tamanho11. Ajustar o contraste de DIC é conseguido girando um polarizador ou traduzindo um dos prismas de DIC, dependendo da marca do microscópio ou do modelo6.
Depois de definir a iluminação Kohler e as configurações de polarizador, é fundamental não reajustar essas configurações ao coletar dados de espectroscopia. Além disso, um sinal de fundo médio constante deve ser mantido em todos os momentos durante a coleta de dados, mesmo quando se alterna entre filtros e configurações angulares. O valor de fundo ideal real depende da faixa dinâmica da câmera científica, mas em geral, o fundo deve estar no intervalo de 15% – 40% do nível máximo de detecção da câmera. Isso reduz a probabilidade de saturar o sensor da câmera, permitindo o contraste de partículas ideal. Para coletar dados de espectroscopia, é necessário trabalhar com uma câmera científica que capture imagens em preto e branco, em oposição a uma câmera colorida.
A preparação da amostra é outro aspecto crítico das nanopartículas plasmonicas de imagem. É imperativo que os operadores da microscopia DIC tenham uma compreensão das propriedades ópticas da amostra e do substrato da amostra. O vidro do microscópio "pre-limpado" não é preparado suficientemente para nanopartículas da imagem latente, e deve corretamente ser re-limpada antes da deposição da amostra para assegurar a observação desobstruída da amostra. Muitos protocolos da limpeza para corrediças do microscópio foram documentados previamente12, mas não é uma etapa que seja relatada normalmente em estudos experimentais.
Finalmente, os métodos de análise de dados são o componente final para a espectroscopia de partícula única. As intensidades máximas e mínimas para cada nanopartícula devem ser medidas, bem como a média de fundo local. As partículas de interesse devem estar localizadas em áreas sem detritos de fundo, defeitos de substrato ou iluminação irregular. Um método para determinar o perfil espectral de uma nanopartícula é calcular o contraste de partículas em cada comprimento de onda, utilizando a equação abaixo de11,13,14,15:
<img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/59411/59411eq1.jpg">
Alternativamente, o espectro de uma única partícula pode ser dividido em seus componentes máximos e mínimos individuais do sinal, que representam os dois campos da polarização de DIC, assim exibindo os dois espectros direccionalmente-dependentes simultaneamente-recolhidos, através das duas equações:
<img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/59411/59411eq2.jpg">
<img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/59411/59411eq3.jpg">

<table><tbody><tr><td>Contrad 70</td><td>Decon Labs, Inc.</td><td>1002</td><td>Para limpeza de vidro de microscópio, Disponível através de muitos fornecedores de produtos químicos</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A962-4</td><td>Para limpeza e armazenamento de vidro</td></tr><tr><td>de microscópio Lamínulas de cobertura de microscópio de vidro</td><td>Ted Pella</td><td>260148</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de microscópio de vidro</td><td>Ted Pella</td><td>26007</td><td></td></tr><tr><td>Nanobastões de ouro</td><td>Nanopartz</td><td>DIAM-SPR-25-650</td><td></td></tr><tr><td>Nanoesferas de ouro (80 nm)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>742023-25ML</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>N / A</td><td>Software livre disponível para análise de dados de NIJ</td></tr><tr><td>Nail polish</td><td>Microscopia eletrônica Sciences</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Ti-E microscópio</td><td>Nikon</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>Gás nitrogênio</td><td>Airgas</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>ORCA Flash 4.0 V2 + câmera digital sCMOS</td><td>Caneta de</td> riscagem <td>Hamamatsu 77054098</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Amazon</td><td>N / A</td><td>Muitas opções disponíveis online por menos de US $ 10. Não é necessário comprar uma versão cara.</td></tr><tr>Água <td></td><td></td><td>ultrapura</td><td>18 megaohm</td></tr></tbody></table>

realização de espectroscopia em nanopartículas plasmonicas com microscopia de contraste de interferência diferencial de tipo nomarski baseado em transmissão

Performing Spectroscopy on Plasmonic Nanoparticles with Transmission-Based Nomarski-Type Differential Interference Contrast Microscopy

A microscopia do contraste da interferência diferencial (DIC) é uma ferramenta poderosa da imagem latente que seja empregada a mais geralmente para objetos da microescala da imagem latente usando a luz da visível-escala. O objetivo deste protocolo é detalhar um método comprovado para a preparação de amostras de nanopartículas plasmonicas e realizar espectroscopia de partícula única neles com microscopia DIC. Várias etapas importantes devem ser seguidas cuidadosamente, a fim de realizar experimentos de espectroscopia repetível. Primeiro, os pontos de referência podem ser gravados no substrato da amostra, que auxilia na localização da superfície da amostra e no rastreamento da região de interesse durante os experimentos. Em seguida, o substrato deve ser devidamente limpo de detritos e contaminantes que podem de outra forma dificultar ou obscurecer o exame da amostra. Uma vez que uma amostra é preparada corretamente, o trajeto ótico do microscópio deve ser alinhado, usando a iluminação de Kohler. Com um microscópio padrão do estilo de Nomarski DIC, a rotação da amostra pode ser necessária, particular quando as nanopartículas plasmônicas exibem propriedades óticas orientação-dependentes. Porque a microscopia de DIC tem dois campos ortogonais inerentes da polarização, o padrão comprimento de onda-dependente do contraste de DIC revela a orientação de nanopartículas plasmônicas rod-shaped. Finalmente, a aquisição de dados e análises de dados devem ser cuidadosamente executadas. É comum representar dados de espectroscopia com base em DIC como um valor de contraste, mas também é possível apresentá-lo como dados de intensidade. Nesta demonstração de DIC para espectroscopia de partícula única, o foco está em nanopartículas de ouro esféricas e em forma de haste.

Ao trabalhar com amostras que são grandes o suficiente para ser visto a olho nu, colocando pontos de referência sobre o substrato de vidro não é normalmente necessário. No entanto, ao trabalhar com nanomateriais ou quando a rotação da amostra é necessária, os pontos de referência podem fornecer um método fácil para localizar, distinguir e rastrear a orientação da amostra. Apesar de técnicas mais sofisticadas podem ser utilizadas para deixar Marcos em substratos de vidro1...

O objetivo deste protocolo é detalhar uma abordagem comprovada para a preparação de amostras de nanopartículas plasmonicas e para a realização de espectroscopia de partícula única neles com microscopia de contraste de interferência diferencial (DIC).

Realização de espectroscopia em nanopartículas Plasmonicas com microscopia de contraste de interferência diferencial de tipo Nomarski baseado em transmissão

Differential interference contrast (DIC) microscopy is a powerful imaging tool that is most commonly employed for imaging microscale objects using ...

A microscopia DIC é superior ao campo escuro em nanopartículas plasmônicas de imagem em ambientes complexos. No entanto, a DIC também requer maior conhecimento e habilidade para obter resultados reprodutíveis. A microscopia DIC fornece alta resolução lateral e profundidade de campo rasa.Ambos os traços são extremamente importantes no monitoramento de nanopartículas dentro das células ou em ambientes complexos. Para começar, use uma caneta de assinatura para colocar uma marca de arranhão rasa e curta no centro de cada mancha de vidro e, em seguida, limpe o vidro conforme descrito no protocolo de texto que acompanha. Em seguida, use uma micropipette para remover 100 microlitadores de uma solução de nanopartícula de ouro de 05 miligramas por mililitro de seu recipiente de armazenamento original, e ejete a solução em um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro.Centrifugar a amostra por 10 minutos a 6.000 vezes a gravidade. Quando terminar, remova o supernatante com uma micropipette para se livrar do excesso de surfactante da solução de nanopartículas. Em seguida, adicione 100 microliters de água ultra-pura ao tubo centrífuga.Brevemente vórtice a amostra para quebrar a pelota, e depois sonicá-la por 20 minutos imediatamente depois para resususpensar totalmente os agregados de nanopartículas. Usando uma micropipette, dropcast seis microliters de solução de nanopartículas no deslizamento de vidro limpo e arranhado. Em seguida, vire cuidadosamente a tampa e coloque-a em cima de um segundo pedaço maior de vidro microscópio.A queda deve se espalhar rapidamente uniformemente entre os dois pedaços de vidro. Tome cuidado para evitar ficar bolhas de ar presas entre os dois pedaços de vidro. Use uma linha estreita de esmalte para selar as bordas da tampa para evitar a evaporação do líquido.Coloque a amostra no estágio do microscópio e alinhe o objetivo e o condensador do microscópio. Ajuste o foco para encontrar o plano focal com a amostra nele e localize a marca de arranhão criada anteriormente. Concentre-se nele e ajuste o foco até que as nanopartículas entrem em vista.Para determinar a colocação precisa do condensador, utilize o método de iluminação Kohler começando com o objetivo de 20x e, em seguida, movendo-se para altas ampliações como 80 ou 100x. Em seguida, selecione uma região de interesse dentro da amostra para imagem. Centralize a região no campo de visão da câmera e ajuste o foco conforme necessário.Se o microscópio tiver o design de Senarmont, comece com o polarizador perto da extinção máxima do fundo e gire gradualmente o polarizador para diminuir a extinção de fundo. A intensidade de fundo aumentará gradualmente. O cenário ideal é alcançado quando as nanopartículas atingem sua maior diferença de intensidade em comparação com a média de fundo local.Para nanopartículas plasmônicas, o maior contraste é tipicamente alcançado com um fundo relativamente escuro em ou perto da extinção máxima de fundo. Desligue a iluminação da sala para evitar que a iluminação perdida interaja com o processo. Coloque em prática um filtro de largura total de 10 nanômetros a meio máximo de largura com seu comprimento de onda central co-localizado com o comprimento de onda de plasmon de superfície localizado principal, a fim de ver a região de interesse.Em seguida, ajuste a intensidade da lâmpada ou o tempo de exposição até que o nível de fundo esteja em 5% a 40% do nível máximo de capacidade da câmera. Nenhum objeto dentro da região de interesse deve exibir intensidades de sinal que excedam 90% do nível máximo de intensidade da câmera. Imagem a amostra com uma série de filtros de passe de banda que cada um tem uma largura total a meio máximo de 10 nanômetros, e que como um todo permitem a imagem em toda a faixa de comprimento de onda de interesse.Certifique-se de que a intensidade de fundo nas imagens permanece dentro de 5% uma da outra, ajustando o tempo de exposição e não a potência da lâmpada. Depois de trocar filtros, refoco a amostra antes de capturar imagens. Salve as imagens como arquivos TIFF não compactados e/ou no formato de arquivo nativo do software, a fim de preservar todas as informações relevantes.Para começar a análise, abra a imagem com ImageJ. Use a ferramenta retângulo para desenhar um retângulo ao redor da região principal de interesse. Em seguida, na barra de ferramentas, selecione imagem, vá para zoom e selecione para seleção.A janela de imagem aumentará a área selecionada. Em seguida, selecione imagem, vá para ajustar e selecione brilho/contraste. Para melhorar a visão da região da amostra, ajuste o mínimo, máximo, brilho e contraste da imagem.Esses ajustes não alteram os dados científicos, apenas permitem uma melhor visibilidade da região amostral. Agora, use a ferramenta retângulo novamente e desenhe uma caixa em torno da primeira nanopartícula a ser medida. A caixa deve ser apenas um pouco maior do que o disco arejado da nanopartícula.Uma vez selecionado, vá analisar e selecione a medida. Uma nova janela aparece que relata as intensidades mínimas, máximas e médias para os pixels localizados dentro da caixa selecionada. Mantendo o tamanho original da caixa, arraste a caixa para uma área imediatamente adjacente à partícula onde o contraste de fundo é relativamente uniforme, e não há partículas ou contaminantes presentes.Use novamente a ferramenta de medida para determinar a intensidade média da área de fundo. Repita este processo para cada partícula em todas as imagens da série. Em seguida, exporte os dados para uma planilha para calcular o contraste ou intensidade de cada partícula em todos os comprimentos de onda e ângulos.Digite na equação a seguir para calcular o contraste de cada partícula. Finalmente, gráfico o perfil espectral em uma determinada posição de nanopartículas, plotando dados com o comprimento de onda ao longo do eixo X e o contraste ou intensidade ao longo do eixo Y. Para determinar a configuração de imagem ideal, essas nanosferas de ouro foram imagens em várias configurações polarizadoras.A zero graus, as partículas aparecem principalmente brancas com uma faixa escura correndo através de sua seção média. Isso é um indicativo de polarização cruzada para amostras de nanosfera. Quando o polarizador é girado para diferentes ângulos, as partículas lançam sombras escuras em direção a um canto.No entanto, os valores de contraste de partículas mudam drasticamente. Para esta amostra, a configuração de imagem ideal é com uma mudança polarizadora de 10 graus. Aqui o comprimento de onda é traçado contra o contraste das nanosferas de ouro.Cada ponto de dados representa uma média de 20 nanosferas para cada diâmetro de partícula. O contraste de pico para cada partícula muda ligeiramente dependendo do seu tamanho. A intensidade e rotação é ainda mais importante com formas anisotrópicas como este nanorod dourado.Aqui o comprimento de onda é plotado contra a intensidade em duas configurações polarizadoras diferentes. Em cada caso, a intensidade do lado bom é muito mais forte do que a do lado negro. O perfil de intensidade de um único nanorod de ouro em seu comprimento de onda de ressonância de plasmon de superfície localizada durante a rotação do palco mostra uma grande diferença de intensidade entre os lados escuro e brilhante à medida que a amostra é girada através de 180 graus.A imagem da amostra é extremamente importante. Requer diligência e paciência por parte do microscopista. Se você está realizando um experimento que requer reimaginar a amostra durante uma série de dias, então marcos como as marcas de arranhões são fundamentais para realocar sua região de interesse.A microscopia dic está crescendo no interesse de pesquisadores que estudam nanopartículas, especialmente em ambientes dinâmicos e celulares. Porque o DIC oferece uma resolução espacial ideal, especialmente em ambientes de amostragem complexos.

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Research

JoVE Journal

Chemistry

Química

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