Name: Uso de uma única molécula fluorescente hibridação In Situ (FISH-SM) para Quantify e Localize os mRNAs em oócitos murino (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: Aprenda a técnica de hibridização in situ por fluorescência de molécula única (RNA-FISH) para quantificar e localizar mRNAs em oócitos de camundongo. Este método otimizado oferece dados reprodutíveis com baixa variação para estudos de biologia do desenvolvimento.

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Agradecemos o Dr. Daniel R. Larson por sua generosa ajuda com a instalação e utilização do local encontrando e programa de rastreamento 13 e o apoio técnico da Universidade de Nebraska Lincoln microscopia núcleo para a imagem de microscopia confocal. Este estudo representa uma contribuição da Universidade da divisão de pesquisa agrícola de Nebraska, Lincoln, Nebraska e foi apoiado por fundos de hachura UNL (NEB-26-206/adesão número-232435 e NEB-26-231/adesão número-1013511).

Animais procedimentos foram revisados e aprovados pelo Comitê de uso da Universidade de Nebraska-Lincoln e institucional Cuidado Animal e todos os métodos foram realizados em conformidade com os regulamentos e orientações pertinentes. Para este estudo, CD-1 consanguíneo ratos tem acesso ad libitum chow roedor normal e água; Eles foram mantidos em um 12:12 escuros: ciclo de luz.
1. preparação dos meios de comunicação necessários
<ol><li>Para a mídia de base (OMM), adicione 100 mM NaCl, KCl de 5 mM, 0.5 mM KH2PO4e 1,7 mM CaCl2-2 H2O a 100 mL de água estéril. Nota: Médio OMM pode ser armazenado por até 1 mês.</li>
	<li>Para a mídia completa (OMOPS), adicionar 20 mM 3-morpholinopropane-1-sulfônico (MOPS), 1,2 mM de MgSO4-7 H2O, glicose de 0,5 mM, 6 mM L-lactato, 1mm ala-gln, taurina, 0,1 mM 1 x não aminoácidos essenciais (timina), 0,01 mM (de ácido etilenodiaminotetracético EDTA), o ácido alfa lipoico 10 µM, 10 gentamicina µ g/mL sem diluir, 21 mM 1 M NaOH, 5mm NaHCO3, 0,2 mM piruvato, 0.5 mM citrato, 4mg/mL FAF BSA para uma 01:10 diluição da OMM em água estéril para um volume total de 100 mL. Esterilize o meio com um filtro de 0,22 µM. Nota: OMOPS pode ser armazenado por até 1 semana.</li>
	<li>Por meio de exploração (HM) Adicione 5% de soro fetal bovino para OMOPS. Fazer 2 mL HM por rato.</li>
	<li>Para solução de hialuronidase Adicione 0,1 mg/mL de hialuronidase derivado de testículos de bovinos, a HM de 1 mL.</li>
	<li>Para o buffer de fixação combine paraformaldeído 4% em 10 mL de 1X PBS juntamente com 0,1% embrião grau polivinilpirrolidona (PVP)14.</li>
	<li>Para preparar 50 mL de tampão de lavagem (WB), adicionar 0,1% de tensoativo não-iônico e 0,1% PVP de 1X PBS14.</li>
	<li>Para preparar 10 mL de tampão de permeabilização, adicione 1% não - iónico de 1X PBS14. Nota: Os buffers de lavagem e permeabilização descritos acima substituem os buffers proprietários nos kits comercialmente disponíveis.</li>
</ol>2. recolha de ovócitos ovulados dos ratos fêmeas
<ol><li>Preparação:<ol>
<li>Estimular os ratos fêmeas em 5-8 semanas de idade com uma injeção intraperitoneal (IP) de 5 IU equinos gonadotrofina coriônica (eCG) seguida de 5 IU gonadotrofina coriônica humana (hCG) 44-48 h mais tarde15,16.</li>
		<li>Manter pratos de Petri 35mm, contendo 2 mL de HM em uma placa de aquecimento de 37 ° C. Pipete uma, gota de 100 µ l de HM contendo hialuronidase diluída, seguido de três, gotas de 50 µ l de HM sem hialuronidase em um prato de petri de 60 mm. Coloque placas contendo gotas sobre a 37 ° C de aquecimento da placa antes da utilização. Nota: As gotas de hialuronidase devem ser feitas antes da dissecação de cada par de oviduto para evitar a evaporação e concentração dos componentes da HM com ou sem hialuronidase.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eutanásia em ratos, 16 h após a injeção do IP do hCG, utilizar isoflurano sobredosagem seguido por deslocamento cervical.</li>
	<li>Limpe o mouse usando etanol a 70%. Expor na cavidade abdominal e visualizar o trato reprodutivo feminino. Segure o ovário com pinça e retire os ligamentos uterinos e o excesso de tecido adiposo ao redor do ovário. Corte do oviduto, do útero e coloque o par de ovário-oviduto no HM quente no prato de 35 mm.</li>
	<li>Remova o ovário e qualquer tecido adiposo circundante. Rasgo na ampola inchada de oviduto usando uma agulha de calibre 27 de ½ polegada. Empurre o oviduto no site do rasgo e os complexos de célula-oócito cumulus (COCs) serão expulso. Transferência de oócitos ovulated, que se presume ser em metáfase II (MII) da meiose, para a entrega de 100 μL contendo mídia HM com hialuronidase usando uma pipeta de boca (Figura 2).</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59414/59414fig2.jpg"> Figura 2 : Peças da pipeta de boca usado para transferência de oócitos. (A) boca da parte (B) 0.22, 4mm filtro (C) tubulação (D) 1000 μL pipeta ponta aspiradora (E) 9" pipeta Pasteur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59414/59414fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<ol start="5"><li>Pipete os complexos de célula cumulus-oócito MII acima e para baixo na hialuronidase contendo HM com a pipeta de boca para desalojar as células do cumulus. Cada oócito de transferência, uma vez que eles são desprovidos de células do cumulus para uma lavagem soltar HM contendo apenas usando a pipeta de boca. Repita isto para cada gota de lavagem. Não transferência de oócitos fragmentada ou transparente15. Nota: É importante transferir os oócitos de cada gota no prato com 35mm como HM pouco quanto possível. Isto é verdadeiro para cada transferência no protocolo. Os oócitos MII não devem permanecer na hialuronidase contendo meio de HM para mais de um minuto.</li>
</ol>3. SM-peixe de coloração de ovócitos
<ol><li>Resolver os oócitos em um poço individual de uma placa de 6 contendo 500 µ l de tampão de fixação. Mergulhe 20 oócitos ou menos no poço. Incube durante 20 min à temperatura ambiente. Nota: Cada passo de coloração SM-peixe ocorre dentro de um poço individual em uma placa 6-poço cónico. Certifique-se de que os oócitos são completamente submerso nos buffers e não flutuando em cima do buffer. Cada passo deve ser realizada com 20 oócitos ou menos em cada poço.</li>
	<li>Transferência de ovócitos fixos para 500 μL de tampão de lavagem (WB descrito na etapa 1.6) por 10 min cada. Repita 2 vezes mais.</li>
	<li>Incube os oócitos no buffer de permeabilização por 30 min à temperatura ambiente. Nota: O buffer de permeabilização descrito na etapa 1.7 substitui o buffer de permeabilização de decoro.<ol>
<li>Reunir conjuntos de sonda e rapidamente girá-los para baixo em um microcentrifuge. Aquecer cada sonda definida por 10 min em um banho de água a 40 ° C ou incubadora. Esfriar até a temperatura de quarto. Nota: Esta etapa deve ser executada durante a incubação de permeabilização</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lave os oócitos em 500 µ l de WB por 10 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Transferência de ovócitos de 80 μL de Protease III Buffer (disponível a partir do kit), que é diluído 1:8 em 1X PBS, por 30 min à temperatura ambiente. Nota: O volume de 80 µ l adequadamente cobre o fundo de um poço individual em uma placa de 6.</li>
	<li>Lave os oócitos em 500 µ l de WB por 10 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Diluir os conjuntos de sonda aquecida para Nanog, Pou5f1 e DapB (um gene de controlo negativo), 01:50 no diluente de sonda. Incubar os oócitos em 80 μL da sonda específicos de transcrição por 2 horas a 40° C. Nota: Cada conjunto de sonda proprietário está disponível em um dos três canais de fluorescência (C1, C2 e C3). As sondas Nanog e Pou5f1 foram marcadas com C2 e C3, respectivamente.</li>
	<li>Aquecer o proprietário, 1 amplificador (1 AMP), amplificador 2 (AMP2), amplificador 3 (AMP3) e amplificador 4-fluorescência (AMP 4-FL) à temperatura ambiente. Nota: Esta etapa deve ser executada durante a incubação sonda de transcrição específicos de 2 horas.</li>
	<li>Transferência de oócitos para 500 μL de WB e incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente.</li>
	<li>Incube os oócitos sequencialmente nos buffers de amplificação.<ol>
<li>Incube os oócitos em 80 µ l de AMP1 durante 30 min em oócitos de transferência de 40° c a 500 µ l de WB, durante 10 minutos à temperatura ambiente.</li>
		<li>Incubar os oócitos em 80 µ l de AMP2 por 15 min a 40 ° C. Transferência de ovócitos a 500 µ l de WB por 10 min à temperatura ambiente.</li>
		<li>Incubar os oócitos em 80 µ l de AMP3 por 30 min a 40 ° C. Transferência de ovócitos a 500 µ l de WB por 10 min à temperatura ambiente. Nota: O restante do protocolo é realizado no escuro porque AMP-FL contém o fluoróforo. Quando se trabalha sob o microscópio de dissecação, reduza a luz, tanto quanto possível.</li>
		<li>Adicionar oócitos de 80 μL de AMP4-FL 15 min a 40° C. Nota: AMP4-FL é fornecido como alternativa de reserva-A (Alt-A), Alt-B ou Alt-C. Selecione o buffer de AMP4-FL dependente na qual emissão de comprimento de onda é desejado.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lave os oócitos em 500 µ l de WB por 10 min à temperatura ambiente. Incube os oócitos em 80 µ l de DAPI por 20 min em temperatura ambiente. Lave os oócitos em 500 µ l de WB por 5 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Pipete 12 µ l de mídia anti-fading montagem no centro de um slide sem adição de bolhas para o reagente. Transferir oócitos com como pouco WB quanto possível para a mídia de montagem e uma lamela.<ol>
<li>Lamela em um ângulo de inclinação e lenta e suavemente, coloque sobre o líquido no slide. Evite pressionar a lamela muito duro para impedir a distorção dos oócitos e introdução de bolhas.</li>
		<li>Armazene os slides em uma caixa escura para secar durante a noite em temperatura ambiente. Revesti as bordas dos slides em esmaltes claros para selar a lamela.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Use um microscópio padrão para encontrar oócitos sobre o slide e o círculo com um marcador permanente. Nota: Este passo não é obrigatório, mas melhora a localização oócitos no slide. Para melhores resultados, slides de imagem dentro de 1 a 5 dias como o sinal fluorescente começará a desvanecer-se.</li>
</ol>4. processamento de imagem
<ol><li>Imagem 3-dimensional oócitos, utilizando microscopia confocal de passo de z. Nota: Para analisar com precisão as imagens, cada passo de z deve ser 1,0 µm/fatia.</li>
	<li>Salve imagens confocal como um comprimido nd2 ou individuais. Arquivos TIFF para cada oócito. Ambos os tipos de imagem são compatíveis com o programa de processamento de imagem open source, Fiji.</li>
	<li>Baixe e instale o software de Fiji de acesso aberto (https://imagej.net/Fiji/Downloads).<ol>
<li>Arraste arquivos nd2 em Fiji e escolha hyperstack. Se imagens confocal foram salvos como. Arquivos TIFF pule para a etapa 4.4. Nota: Quando o arquivo de nd2 é Descartado em Fiji o dropdown hyperstack deve aparecer automaticamente.</li>
		<li>Clique na guia imagem , selecione a core clique em Canais de Split para separar os canais fluorescentes do arquivo nd2.</li>
		<li>Gere individuais. Arquivos TIFF para cada z-fatia do oócito em cada canal fluorescente. Clique na guia imagem , selecione Stackse clique em pilha de imagens. Clique na guia imagem , selecione o tipoe clique em Cor RGB para converter cada fatia de z para uma imagem de cor RGB individual. Nota: A cor do RGB é artificial e pode ser escolhido como desejado para cada comprimento de onda de emissão.</li>
		<li>Salve cada imagem convertida como. Arquivo TIFF. Coloque imagens de um oócito único para cada canal fluorescente em uma nova pasta para evitar confusão durante a costura (etapa 4.3).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Normalize a cada um. Imagem TIFF para Pou5f1 e Nanog usando imagens de controlo negativo (DapB). Nota: A normalização é executada usando um programa de edição de fotos. Certifique-se de remover os mesmos níveis de fluorescência de fundo de cada imagem do controle.</li>
	<li>Abra cada normalizado. Arquivo TIFF em Fiji para costurar todos os z-fatias para cada oócito em cada comprimento de onda.<ol>
<li>Clique na guia de Plugins , selecione costurae clique na Grade/coleção (Figura 3A). Selecione Imagens sequenciais do menu drop-down e clique Okey (Figura 3B).</li>
		<li>Procure o diretório e selecione a pasta que contém todas as imagens de z-fatia para um oócito individual em um comprimento de onda (ver passo 4.3.4). Clique Okey.</li>
		<li>Mova o controle deslizante na parte inferior da imagem costurada para o canal de cor apropriada para o comprimento de onda utilizado e criar a imagem final de costurados RGB clicando em imagem, selecionar o tipoe clique em Cor RGB. Nota: Esta imagem será usada para quantificação de fluorescência descrita na etapa 4.6 abaixo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Converta a imagem costurada para 32-bit máxima imagens projetadas. Clique na imagem, selecione o tipoe clique em 32-bit (Figura 3). Salve esta imagem como um novo. Arquivo TIFF.</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59414/59414fig3.jpg"> Figura 3 : Costura juntos de imagens confocal z-series de ovócitos. (A) Screenshot mostrando a ferramenta grade/coleção de plug-in em Fiji que foi usado para produzir imagens compostas do oócito. (B) imagens sequenciais usa sobreposição de fluorescência entre sequencial. Arquivos TIFF para gerar uma imagem composta. (C) a imagem composta foi salvo como um 32-bit. Arquivo TIFF. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59414/59414fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<ol start="7"><li>Baixe e instale o local encontrando e programa de rastreamento13, que está disponível no site para D.R. Larson, um investigador no nacional institutos de saúde Instituto Nacional de câncer (https://ccr.cancer.gov/Laboratory-of-Receptor-Biology-and-Gene-Expression/daniel-r-larson). Baixe e instale a máquina virtual de acesso livre para o sistema operacional no idioma (IDL) interativa de dados que é necessário para executar o programa de rastreamento (http://www.spacewx.com/pdf/idlvm.pdf) e encontrar o lugar.</li>
	<li>Abra a imagem de 32 bits, costurada, que foi gerada na etapa 4.6 (Figura 4A), no local encontrando e programa de rastreamento. Selecione o menu suspenso localizar e clique em Localizar (Figura 4B), que irá calcular as números manchas encontradas na imagem. Nota: Cada ponto contado representa um mRNA individuais. Configurações de limite de banda pass e fóton são mostradas na captura de tela (Figura 4B). Para este protocolo, utilizou-se o padrão para cada configuração de limiar. Representante positivo e manchas de fundo são mostradas (Figura 4).</li>
</ol><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59414/59414fig4.jpg"> Figura 4 : Quantificação dos mRNAs utilizando Spot Finder e rastreamento. (A) z-série Individual imagens foram costuradas conforme descrito na Figura 3 e salvo como um máximo de 32-bit projectado. Arquivo TIFF. (B) imagem composta foi inaugurada em Spot Finder e rastreamento. Localizar foi usada para contar as manchas fluorescentes (caixa vermelha). Limite de banda pass e fóton são indicadas pela caixa azul. (C) a seta azul aponta para um sinal positivo (acima do limiar). A seta branca mostra uma fluorescente ponto abaixo do limiar e, portanto, não contados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59414/59414fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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<li>Gilbert, C., Svejstrup, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+Immunoprecipitation+for+Determining+RNA-Protein+Associations+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">RNA Immunoprecipitation for Determining RNA-Protein Associations In Vivo.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 75 (1), 27.4.1-27.4.11 (2006).</li>
<li>Kwon, S., Chin, K., Nederlof, M., Gray, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative%2C+in+situ+analysis+of+mRNAs+and+proteins+with+subcellular+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Quantitative, in situ analysis of mRNAs and proteins with subcellular resolution.</a> Scientific Reports. 7 (1), 16459(2017).</li>
<li>Voigt, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Molecule+Quantification+of+Translation-Dependent+Association+of+mRNAs+with+the+Endoplasmic+Reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Single-Molecule Quantification of Translation-Dependent Association of mRNAs with the Endoplasmic Reticulum.</a> Cell Reports. 21 (13), 3740-3753 (2017).</li>
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<li>Cookson, W., Liang, L., Abecasis, G., Moffatt, M., Lathrop, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+complex+disease+traits+with+global+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mapping complex disease traits with global gene expression.</a> Nature Reviews Genetics. 10 (3), 184-194 (2009).</li>
<li>Houle, D., Govindaraju, D. R., Omholt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenomics%3A+the+next+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Phenomics: the next challenge.</a> Nature Reviews Genetics. 11, 855(2010).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada a declarar

Uma série de pequenas etapas durante o protocolo irá garantir sucesso fluorescência e contagens exatas dos mRNAs. Em primeiro lugar, o protocolo deve ser realizado imediatamente após a coleta e fixação de oócitos. Observe que o PVP é adicionado para o buffer de fixação paraformaldeído 4% para evitar oócitos grudem uns aos outros. Nós achamos que é necessário realizar o experimento imediatamente após a coleta e fixação de oócitos. Qualquer atraso resulta em um muito menor sinal de fluorescência que resultaria em subcontag...

Transcriptase reversa cadeia da polimerase (PCR) tem sido o padrão-ouro para quantificação de mRNA. Dois ensaios, digital PCR (dPCR)1 e quantitativo, real time PCR (qPCR)2 são utilizados atualmente. Das duas técnicas de PCR, dPCR tem maior sensibilidade do que qPCR, sugerindo que poderia ser usado para medir a abundância de mRNA em células únicas. No entanto, em nossas mãos, dPCR análise de mRNAs baixa abundância nas piscinas de ovócitos de 5 a 10 por cada amostra experimental produziu dados com baixa reprodutibilidade e alta variação3. Isto é provavelmente devido ao erro experimental associado a extração do RNA e transcrição reversa eficiência. A sequenciação do ARN também foi executada usando um único rato e oócitos humanos4,5. Esta técnica requer etapas de amplificação do cDNA necessárias para a geração de biblioteca que provavelmente aumenta a variabilidade dentro de um grupo experimental. Além disso, transcrições de baixa abundância podem não ser detectáveis. Embora os preços de sequenciamento caíram nos últimos anos, ainda pode ser custo proibitivo devido ao alto custo das análises de Bioinformática. Finalmente, a localização de mRNA é um processo dinâmico, com alterações espaciais, contribuindo para a proteína função6. Portanto, decidimos para adotar uma técnica que produziria medidas quantitativas precisas e reprodutíveis e localização dos mRNAs individuais em oócitos único.
DNA em cadeia ramificada acoplado a fluorescência hibridação in situ amplifica o sinal de fluorescência em vez de amplificação do RNA/cDNA permita deteção dos mRNAs único em células individuais 7,8,9. O ensaio é realizado através de uma série de hibridização e amplificação (usando DNA em cadeia ramificada) fluorescência rotulagem passos a fim de amplificar o sinal de fluorescência7. A técnica começa com ligação de pares de sonda de 18 a 25-base do oligonucleotide que são complementares a uma específica do mRNA3,8,10. Quinze a vinte pares de sonda são projetados para cada especificidade de transcrição garantindo para a transcrição do alvo. A hibridação de mRNA específico é seguida por sondas pré-amplificador e amplificador que formam uma configuração ramificada. Aproximadamente, 400 rótulo fluorophores bind para cada amplificador, resultando em um 8000-fold aumento na fluorescência permitindo a deteção de mRNAs individuais (Figura 1)11.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59414/59414fig1.jpg"> Figura 1: esquemático do protocolo SM-peixes. Sequencial hibridização da sonda específica de transcrição, ramificado DNA amplificador e fluoróforo para um destino de mRNA é mostrado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59414/59414fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Estudos anteriores usando fluorescência única molécula em situ da hibridação (SM-peixe) localizada β-actina mRNAs em neurônios individuais12 e DNA de papilomavírus humano em câncer de colo uterino de células linhas7. O software de computador, encontrar o local e o programa de rastreamento identifica o sinal fluorescente punctate individual e tem sido usada com sucesso para quantificar o número de mRNAs em cada célula3,13.
Baseado nos resultados da deteção do mRNA em neurônios12, formulamos a hipótese que SM-peixe provaria uma ferramenta útil para dosar os níveis de transcrição de murino oócitos e embriões, incluindo baixa abundância mRNAs. No entanto, a técnica é otimizada para uso com pilhas fixos aderentes e formaldeído fixada parafina incorporado cortes de tecido (FFPE). Oócitos não podem aderir a um slide, mesmo quando eles são revestidos com poli-L-lisina. Além disso, eles são mais frágeis do que as células somáticas e cortes de tecido, resultando em lise celular quando submetido a alguns dos buffers de proprietários em kits comercialmente disponíveis3. Para superar estes desafios, oócitos foram fixo e manualmente transferidos entre gotas dos buffers. Além disso, os buffers de permeabilização e lavagem nos kits foram substituídos para reduzir o lysis da pilha. Sondas preconcebidas são compradas juntamente com o kit de peixe ou transcrições específicas podem ser solicitadas. Cada conjunto de sonda proprietário está disponível em um dos três canais de fluorescência (C1, C2 e C3) para permitir a multiplexação. Na experiência atual, murino oócitos foram manchadas de dual e quantificados usando uma sonda de C2 Nanog e uma sonda de C3 Pou5f1 . Estas sondas foram selecionadas com base em expressão relatado de Nanog e Pou5f1 de oócitos e embriões. Na conclusão das etapas da hibridação, oócitos foram colocados em gotas de mídia anti-desvaneça-se montagem para aplicação de lâminas histológicas. Confocal imagens foram usadas para quantificar o número de sinais fluorescentes punctate que representam os mRNAs individuais. Além de quantificar os mRNAs, imagem também mostrou a distribuição espacial do mRNA específico na célula, quais outros métodos de quantificação de RNA são incapazes de alcançar. Esta técnica provou ter baixa variabilidade dentro de um grupo experimental, permitindo o uso de um menor número de oócitos em cada grupo experimental para identificar diferenças significativas entre os grupos experimentais3.

<table><tbody><tr><td>(&plusmn;)-&ácido alfa;-lipóico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1395</td><td>Ácido alfa-lipóico</td></tr><tr><td>Albumina, soro bovino, baixo teor de ácidos graxos</td><td>MP Biomedicals, LLC</td><td>199899</td><td>FAF BSA</td></tr><tr><td>BD seringa de 10mL TB</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>309659</td><td>seringa de 10 mL</td></tr><tr><td>BD Agulha PrecisionGlide</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>305109</td><td>agulha de calibre 27 1/2</td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio di-hidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7902</td><td>CaCl2-2H2O</td></tr><tr><td>Ácido cítrico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2404</td><td>Citrato</td></tr><tr><td>D-(+)-Glicose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6152</td><td></td></tr><tr><td>Glicose Fosfato</td><td></td><td></td> dissódico <td>Na2HPO4</td></tr><tr><td>Easy Grip Placa de Petri</td><td>Falcon Corning</td><td>351008</td><td>placa de 35 mm</td></tr><tr><td>Edetato Dissódico</td><td>Avantor</td><td>8994-01</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura Bonn Extra Fina</td> EDTA <td>Fine Science Tools</td><td>14084-08</td><td>Reta, Afiada/Afiada, não serrilhada, tesoura de ponta de 13mm</td></tr><tr><td>Soro Bovino Fetal</td><td>Atlanta biologicals</td><td>S10250</td><td>FBS</td></tr><tr><td>Solução de Reagente de Gentamicina</td><td>gibco</td><td>15710-064</td><td>Gentamicin</td></tr><tr><td>GlutaMAX-I (100X)</td><td>gibco</td><td>35050-061</td><td>Glutamax</td></tr><tr><td>Gold Seal Micro Slides</td><td>Gold Seal</td><td>3039</td><td>25 x 75mm</td></tr><tr><td>slides Gonadotrofina, Do Soro de Éguas Grávidas</td><td>Sigma</td><td>G4877</td><td>eCG</td></tr><tr><td>hCG NHPP recombinante</td><td></td><td>AFP8456A</td><td>hCG</td></tr><tr><td>Hialuronidase, Tipo IV-S: De Testículos Bovinos</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3884</td><td>Hyaluronidase</td></tr><tr><td>Estilo Joalheiro Fórceps</td><td>Integra</td><td>17-305X</td><td>Pinças 4-3/8", Estilo 5F, Reta, Micro Fine Jaw</td></tr><tr><td>L-(+)-Lactic Acid, ácido livre&nbsp;</td><td>MP Biomedicals, LLC</td><td>190228</td><td>L-Lactato</td></tr><tr><td>Sulfato de magnésio heptahidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2773</td><td>MgSO4-7H2O</td></tr><tr><td>MEM Aminoácidos não essenciais</td><td>Corning&nbsp;</td><td>25-025-Cl</td><td>NEAA</td></tr><tr><td>Vidro de Cobertura do Microscópio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542-C</td><td>25 x 25x 0,15 mm lamínulas</td></tr><tr><td>de cobertura Mm-Nanog-O2-C2 RNAscope Sonda</td> Advanced <td>Cell Diagnostics</td><td>501891-C2</td><td>Sonda Nanog</td></tr><tr><td>Mm-Pou5f1-O1-C3 RNAscope Probe</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>501611-C3</td><td>Pou5f1 Sonda</td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3183</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>Paraformaldeído</td></tr><tr><td>PES 0,22 um Membrana - filtros estéreis</td><td>Millex-GP</td><td>SLGP033RS</td><td>0,22 um</td></tr><tr><td>Polivinilpirrolidona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0930</td><td>PVP</td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60128</td><td>KCl</td></tr><tr><td>Fosfato de potássio monobásico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60218</td><td>KH2PO4</td></tr><tr><td>Prolongar o reagente antidesvanecimento Gold</td><td>invitrogen</td><td>P36934</td><td>Reagente antidesvanecimento sem DAPI</td></tr><tr><td>RNAscope DAPI</td><td>Advanced Cell</td><td>Diagnostics 320858</td><td>DAPI</td></tr><tr><td>RNAscope FL AMP 1</td> Advanced <td>Cell Diagnostics</td><td>320852</td><td>Amplifier 1</td></tr><tr><td>RNAscope FL AMP 2</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>320853</td><td>Amplifier 2</td></tr><tr><td>RNAscope FL AMP 3</td><td>Advanced Amplificador</td><td>de 320854</td> de Diagnóstico Celular <td>3</td></tr><tr><td>RNAscope FL AMP 4 ALT A</td> Amplificador <td>de 320855</td> de <td>Diagnóstico Avançado</td> de <td>Células 4 ALT A</td></tr><tr><td>RNAscope FL AMP 4 ALT B</td> Amplificador <td>de 320856</td> de <td>Diagnóstico Avançado</td> de <td>Células 4 ALT B</td></tr><tr><td>RNAscope FL AMP 4 ALT C</td> Amplificador <td>de 320857</td> de <td>Diagnóstico Avançado</td> de <td>Células 4 ALT C</td></tr><tr><td>RNAscope Kit de Reagentes de Detecção Multiplex Fluorescente</td><td>Diagnóstico Celular Avançado</td><td>320851</td><td>Kit de Reagentes FISH</td></tr><tr><td>Sonda RNAscope Sonda de Controle Negativo 3-plex</td><td>Diagnóstico Celular Avançado</td><td>320871</td><td></td></tr><tr><td>Sonda RNAscope de Controle Negativo Controle Positivo 3-plex</td><td>Diagnóstico Celular Avançado</td><td>320881</td><td>Controle Positivo</td></tr><tr><td>RNAscope Sonda Diluente</td><td>Celular Diagnóstico Celular Avançado</td><td>300041</td><td>Sonda Diluente</td></tr><tr><td>RNAscope Protease III</td><td>Diagnóstico Celular Avançado</td><td>322337</td><td>Protease III</td></tr><tr><td>RNAscope Protease III & Kit de Reagentes IV</td><td>Diagnóstico Celular Avançado</td><td>322340</td><td>Kit de Protease FISH</td></tr><tr><td>RNAscope Protease IV</td><td>Diagnóstico Celular Avançado</td><td>322336</td><td>Agulha Protease IV</td></tr><tr><td>S / S com Luer Hub 30G</td><td>Component Supply Co.</td><td>NE-301PL-50</td><td>agulha romba de 30 calibres</td></tr><tr><td>Bicarbonato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6297</td><td>NaHCO3</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6191</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>Hidróxido de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>306576</td><td>NaOH</td></tr><tr><td>Piruvato de sódio, >= 99%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P5280</td><td>Solução de piruvato</td></tr><tr><td>6 Well Dish</td><td>Agtechinc</td><td>D18</td><td>prato de 6 poços</td></tr><tr><td>Taurina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8691</td><td></td></tr><tr><td>Prato de cultura de tecidos</td> taurina <td>Falcon Corning</td><td>353002</td><td>prato de 60 mm</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td>Triton X-100</td></tr></tbody></table>

uso de uma única molécula fluorescente hibridação in situ (fish-sm) para quantify e localize os mrnas em oócitos murino

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization (SM-FISH) to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

Métodos atuais rotineiramente usados para quantificar o mRNA de oócitos e embriões incluem digital polimerase transcrição reversa reação em cadeia (dPCR), quantitativo, real-time RT-PCR (RT-qPCR) e sequenciação do ARN. Quando estas técnicas são realizadas usando um único oócito ou embrião, baixo-cópia mRNAs confiável não são detectados. Para superar este problema, oócitos ou embriões podem ser agrupados para análise; no entanto, isso muitas vezes leva a alta variabilidade entre as amostras. Neste protocolo, descrevemos o uso da fluorescência hibridação in situ (FISH) usando química de DNA ramificada. Esta técnica identifica o padrão espacial dos mRNAs em células individuais. Quando a técnica está associada a encontrar o local e software de computador de rastreamento, a abundância de mRNAs na célula também pode ser quantificada. Usando esta técnica, há reduzida variabilidade dentro de um grupo experimental e menos oócitos e embriões são necessários para detectar diferenças significativas entre os grupos experimentais. Comercialmente disponível DNA ramificado SM-kits de peixes foram otimizados para detectar mRNAs em secionado tecidos ou células aderentes em slides. No entanto, oócitos efetivamente não adere aos slides e alguns reagentes do kit foram muito duras, resultando em lise do oócito. Para evitar este Lise, várias modificações foram feitas para o kit de peixe. Especificamente, buffers de permeabilização e lavagem de oócito projetados para a imunofluorescência de oócitos e embriões substituiu os buffers de proprietários. A permeabilização, lavagens e incubação com sondas e amplificador foram realizadas em placas de 6-poços e oócitos foram colocados em slides no final do protocolo utilizando meios de montagem. Essas modificações foram capazes de superar as limitações do kit comercialmente disponível, em particular, a lise do oócito. Para precisão e reproducibly contar o número dos mRNAs em oócitos individuais, utilizou-se o software de computador. Juntos, este protocolo representa uma alternativa para PCR e sequenciamento para comparar a expressão de transcritos específicos em células únicas.

Após a conclusão do protocolo, o resultado será imagens individuais de confocal z-series (Figura 4A e Figura 5), imagens costuradas (Figura 4), e contagens de mRNA (Figura 4B). Quando é executada a multiplexação, haverá também mescladas imagens mostrando o rótulo para dois diferentes mRNAs (F...

Para reproducibly contar os números dos mRNAs em oócitos individuais, fluorescência única molécula de RNA in situ hibridação (RNA-FISH) foi otimizada para células não-aderentes. Oócitos foram coletados, hibridizados com sondas específicas transcrição e quantificados usando um software de quantificação de imagem.

Uso de uma única molécula fluorescente hibridação In Situ (FISH-SM) para Quantify e Localize os mRNAs em oócitos murino

Current methods routinely used to quantify mRNA in oocytes and embryos include digital reverse-transcription polymerase chain reaction (dPCR), ...

Esta técnica permite não apenas a localização, mas também a quantitação de mRNAs candidatos nos oócitos e embriões individuais. Em comparação com outros ensaios, incluindo PCR, a conclusão da técnica resulta em dados reprodutíveis com baixa variação. Demonstrando o procedimento será Kelsey Timme, uma estudante de pós-graduação no meu laboratório.Inicie este procedimento com a preparação do material necessário e camundongos fêmeas com cinco a oito semanas de idade, conforme descrito no protocolo de texto. Limpe o mouse usando 70% de etanol. Exponha a cavidade abdominal e visualize o trato reprodutivo feminino.Segure o ovário com fórceps e remova os ligamentos uterinos e o excesso de tecido adiposo ao redor do ovário. Corte o oviduto do útero. Em seguida, coloque o par de oviduto de ovário em meio de espera quente em um prato de 35 milímetros.Remova o ovário e qualquer tecido adiposo circundante. Rasgue a ampola inchada do oviduto usando uma agulha calibre 27 de meia polegada. Empurrar o oviduto no local dos complexos de oócito de células lacrimejadas e cumulus será expulso.Usando uma pipeta bucal para transferir os oócitos ovulados para a gota de 100 microliteres contendo meio de retenção com hialuronidase. Para desalojar as células cumulus, pipeta a metafase dois complexos de células cumulus oocyte para cima e para baixo na hialuronidase contendo meio de retenção com a pipeta bucal. Uma vez desprovidos de células cumulus, use a pipeta bucal para transferir cada oócito para uma gota de lavagem contendo apenas meio de retenção.Repita isso para cada gota de lavagem. Não transfira oócitos fragmentados ou transparentes. Para realizar a coloração SM-FISH, fixe primeiro osócitos em um poço individual de uma placa de seis poços contendo 500 microliters de tampão de fixação.Submergir 20 oócitos ou menos no poço. Incubar os oócitos no tampão de fixação por 20 minutos em temperatura ambiente. Depois de lavar os oócitos como descrito no protocolo de texto, incubar oócitos em tampão de permeablização por 30 minutos à temperatura ambiente.Após outra lavagem, transfira os oócitos para 80 microliters de protease pré-diluída três tampão por 30 minutos em temperatura ambiente. Diluir os conjuntos sondados aquecidos para Nanog, Pou5f1 e DapB de um a 50 em diluente da sonda. Incubar oócitos em 80 microliters da sonda específica da transcrição por duas horas a 40 graus Celsius.Quando os oócitos estão na sonda e os buffers AMP, eles tendem a flutuar. É essencial que você submerse os oócitos empurrando-os suavemente para dentro do buffer. Transfira os oócitos para 500 microliters de tampão de lavagem e incubar por 10 minutos em temperatura ambiente.Agora, incubar oócitos sequencialmente em tampões de amplificação. Primeiro, incubar oócitos em 80 microliters de AMP1 por 30 minutos a 40 graus Celsius. Em seguida, transfira os oócitos para 500 microliters de tampão de lavagem por 10 minutos em temperatura ambiente.Em seguida, incubar oócitos em 80 microliters de AMP2 por 15 minutos a 40 graus Celsius. Depois de lavar os oócitos como antes, incubar os oócitos em 80 microliters de AMP3 por 30 minutos a 40 graus Celsius seguido de uma lavagem final. Por fim, adicione oócitos a 80 microliters de AMP4FL por 15 minutos a 40 graus Celsius.Pipeta 12 microliters de meio de montagem anti-fade no centro de um slide sem adicionar bolhas ao reagente. Transfira oócitos com o mínimo de tampão de lavagem possível para o meio de montagem. Por fim, aplique um recibo de cobertura.Imagem dos oócitos tridimensionais usando microscopia confocal passo Z e salve as imagens conforme descrito no protocolo de texto. Arraste arquivos ND2 para Fiji e escolha Hyperstack. Clique na guia Imagem, selecione Cores e clique em Canais divididos para separar os canais fluorescentes do arquivo ND2.Gerar arquivos TIFF individuais para cada fatia Z dos oócitos em cada canal fluorescente. Para isso, clique na guia Imagem, selecione Pilhas e clique em Pilha para Imagens. Em seguida, clique na guia Imagem, selecione Digite e clique em Cor RGB para converter cada fatia Z em uma imagem de cor RGB individual.Salve cada imagem convertida como um arquivo TIFF. Coloque imagens de um único oócito para cada canal fluorescente em uma nova pasta para evitar confusão durante a costura. Depois de normalizar os arquivos conforme descrito no protocolo de texto, clique na guia Plugins, selecione Costurar e clique em Coleta de grade.Selecione Imagens Sequenciais no menu suspenso e clique em Ok. Navegue pelo diretório e selecione a pasta contendo todas as imagens da fatia Z para um oócito individual em um comprimento de onda. Clique em Ok.Mova o controle deslizante na parte inferior da imagem costurada para o canal de cores apropriado para o comprimento de onda usado. Crie a imagem final costurada RGB clicando em Imagem, selecionando Tipo e clicando em Cor RGB. Converta a imagem costurada em uma imagem máxima projetada de 32 bits.Para isso, clique em Imagem, selecione Digite e clique em 32 bits. Salve esta imagem como um novo arquivo TIFF. Abra a imagem costurada de 32 bits em um programa de localização e rastreamento de pontos.Selecione a dropdown localize e clique em Localize, que calculará o número de pontos encontrados na imagem. Mostrado aqui é a quantificação de mRNAs usando o localizador de manchas e rastreamento. A seta azul aponta para um sinal positivo acima do limiar.A seta branca mostra um ponto fluorescente abaixo do limiar e, portanto, não contado. As contagens de mRNA foram posteriormente analisadas por meio de uma ferramenta padrão de análise de dados. Imagens representativas da imagem da série Z média são mostradas para Pouf51 e Nanog.A coloração da DAPI de cromossomos alinhados no fuso metafásico dois é mostrada em branco. Os dados coletados neste protocolo mostraram 775 transcrições de Pouf51 e 113 transcrições de Nanog em metafase dois oócitos. É importante ressaltar que não foram detectadas manchas nos oócitos que são rotuladas com sonda DapB, que serviu como controle negativo.Ao usar células não aderentes, é importante identificar empiricamente a melhor diluição do tampão protease do kit SM-FISH. A detecção de mRNA foi testada usando uma curva de titulação de concentrações tampão de protease diluídas e várias diluídas em 1xPBS. A diluição protease utilizada neste protocolo foi de um a oito, pois apresentou a menor variação na expressão fluorescente média de Pouf51 mRNA em dois oócitos metafásico.A imuno-fluorescência simultânea de uma proteína-alvo pode ser realizada a fim de co-localizar o mRNA com uma proteína de ligação de RNA. A co-localização dos mRNAs com as proteínas de ligação RNA permite que os pesquisadores determinem mecanismos que regulam o armazenamento, a tradução e a degradação do mRNA dentro de um oócito ou embrião.

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Uso de uma única molécula fluorescente hibridação In Situ (FISH-SM) para Quantify e Localize os mRNAs em oócitos murino

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