Um método sem enzimas para isolamento e expansão de células-tronco mesenchymal derivadas do adiposo humano
16 de dezembro de 2019
Este protocolo fornece um método livre de enzimas para isolar as células-tronco mesenquímicas de abdominoplastia e amostras lipoaspirate usando um método explant. A ausência de enzimas duras ou etapas de centrífuga fornece células-tronco clinicamente relevantes que podem ser usadas para estudos in vitro ou transferidas de volta para a clínica.
Este protocolo fornece uma maneira simples e econômica de isolar ASCs sem o uso de enzimas duras ou etapas de centrifugação, que podem alterar o fenótipo e o comportamento das células. A falta de passos severos produz células menos manipuladas do que aquelas isoladas usando enzimas e centrifugação, minimizando questões sobre se observações experimentais são um artefato do método de isolamento. Este método de explant pode gerar ASCs relevantes clínicos para serem introduzidos em um paciente para tratar uma variedade de doenças ou expandir na vida para aplicações de pesquisa.
É difícil explicar completamente o método de picar em palavras. A demonstração visual pode servir a outros cientistas os problemas de aprender a quebrar o tecido eles mesmos. Métodos similares de explant podem ser usados para isolar outras populações de MSCs, como os de tecidos umbilicais.
Para picadinho das amostras de tecido de abdominoplastia, primeiro transfira o tecido para a tampa de uma placa estéril de 100 milímetros. Em seguida, use uma agulha estéril para segurar um pedaço de tecido no lugar e use um bisturi estéril para cortar o tecido em pedaços de menos de um milímetro. Transfira o tecido para um tubo fresco e inverta ou agite a amostra de cinco a seis vezes para garantir a mistura de todas as camadas.
Em seguida, com uma espátula estéril, transfira de 2,5 a cinco mililitros de tecido para uma placa de cultura de tecido de plasma de gás a vácuo de 100 milímetros. Meça o volume da amostra derramando em um tubo de centrífuga fresco. Em seguida, adicione um volume equivalente de mídia de cultura tecidual à placa e gire suavemente a placa para misturar o conteúdo.
Incubar a placa a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono até que um número suficiente de células sejam vistas na base da placa. Uma vez que um número suficiente de células são notadas na placa ou após sete dias, o que for mais cedo, remova todos os pedaços restantes de tecido. Em seguida, cultura os ASCs na mídia de cultura tecidual até atingir 70% de confluência ou até que os aglomerados se tornem densos, momento em que as células devem ser passagemdas.
Enxágue suavemente a placa com salina tamponada de fosfato 1X. Para tentar experimentar as células aderentes, aspire a solução salina tamponada de fosfato, adicione um mililitro de trippsina suplementado com 0,25% EDTA em cada placa e incubar a 37 graus Celsius por cinco minutos. Adicione uma pequena quantidade de mídia à placa para desativar a trippsina.
Em seguida, pipeta suavemente a trippsina de mídia do topo da placa para baixo, perdendo quaisquer células fracamente ligadas da placa. Para semear as células, primeiro adicione mídia à placa. Em seguida, adicione as células de forma dropwise e, em seguida, gire a placa para garantir uma distribuição uniforme através da placa.
Após três passagens, prossiga para os ensaios de citometria e diferenciação. Após três passagens, foram encontradas asCs isoladas de amostras de lipoaspirato e abdominoplastia com morfologia e fenótipo de MSC, semelhantes aos ASCs isolados após uma digestão enzimática. Como outros MSCs, as ASCs isoladas de explanta são negativas para CD45 e positivas para CD73, CD90 e CD105.
Ao picar o tecido, a área de superfície de cada peça deve ser suficientemente grande para que as ASCs migrem para fora do tecido. Estas são células-tronco fundamentais que podem ser usadas para uma ampla gama de aplicações. Os ASCs isolados podem ser usados para qualquer aplicação a jusante, in vivo ou in vitro.
Visão Geral
Este protocolo descreve um método livre de enzimas para o isolamento de células-tronco derivadas de adipócitos (ASCs) de amostras de abdominoplastia e lipoaspirado utilizando uma técnica de explante. Esta abordagem minimiza a manipulação celular, assegurando células-tronco clinicamente relevantes adequadas para diversas aplicações.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia de Células-Tronco
- Medicina Regenerativa
- Técnicas de Isolamento Celular
Antecedentes
- Métodos tradicionais para o isolamento de ASCs frequentemente envolvem enzimas fortes e centrifugação.
- Esses métodos podem alterar o fenótipo e o comportamento celular.
- O método de explante oferece uma alternativa mais suave.
- Demonstrações visuais podem auxiliar na compreensão do processo de picagem do tecido.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método simples e econômico para o isolamento de ASCs.
- Reduzir o risco de artefatos nas observações experimentais causados por técnicas de isolamento agressivas.
- Gerar ASCs clinicamente relevantes para aplicações terapêuticas.
Métodos Utilizados
- O tecido de abdominoplastia picado é cultivado em uma placa de cultura de tecidos.
- As células são incubadas a 37 °C em um ambiente com CO2.
- Após crescimento celular suficiente, os fragmentos de tecido remanescentes são removidos.
- As células são subcultivadas e caracterizadas quanto aos marcadores de células-tronco.
Resultados Principais
- Os ASCs isolados exibem morfologia e fenótipo semelhantes aos obtidos por digestão enzimática.
- Os ASCs isolados por explante são negativos para CD45 e positivos para CD73, CD90 e CD105.
- O método produz células menos manipuladas, aumentando a confiabilidade experimental.
- Os ASCs podem ser utilizados em diversas aplicações posteriores, tanto in vivo quanto in vitro.
Conclusões
- O método de explante é uma alternativa viável para o isolamento de ASCs.
- Essa técnica preserva as características celulares melhor do que os métodos tradicionais.
- As ASCs isoladas possuem ampla potencialidade para aplicações em pesquisa e clínicas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este método de isolamento livre de enzimas aborda um desafio fundamental na medicina regenerativa: obter células-tronco mesenquimais relevantes clinicamente sem introduzir artefatos decorrentes de processamentos enzimáticos ou mecânicos agressivos. Ao preservar o fenótipo e a função celulares nativos, a abordagem aumenta a confiança preditiva em aplicações posteriores, como modelagem de doenças e triagem terapêutica. O método sustenta fluxos de trabalho de descoberta precoce nos quais a redução de riscos biológicos e a validação de alvos dependem de fontes celulares confiáveis e minimamente manipuladas.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas utilizando células-tronco derivadas de adipócitos com multipotência e perfis de marcadores de superfície preservados.
- Valor Operacional: Reduz a variabilidade nos resultados experimentais ao eliminar alterações fenotípicas induzidas por enzimas.
- Valor Preditivo: Apoia a redução de riscos biológicos mediante a geração de células menos manipuladas para ensaios de validação de alvos.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Produz células-tronco derivadas de adipócitos adequadas para ensaios in vitro padronizados que exigem fenótipos mesenquimais consistentes.
- Valor Operacional: Facilita a prontidão para ensaios por meio da expansão baseada em explantes que mantém a positividade para CD73, CD90 e CD105.
- Escalabilidade: Permite a produção reprodutível de células para triagem de compostos e estudos mecanicistas.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Fornece uma fonte celular clinicamente relevante alinhada com aplicações em medicina regenerativa.
- Modelo Pré-clínico: Permite a geração de células-tronco derivadas de tecido adiposo para sistemas relevantes a doenças, sem exposição a enzimas xenogênicas.
- Redução Mecanística de Riscos: Diminui preocupações sobre artefatos de isolamento que possam afetar avaliações da diferenciação ou da função imunomoduladora.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método insere-se no continuum de descoberta, desde o isolamento inicial de células-tronco até a validação pré-clínica, apoiando fluxos de trabalho nos quais a integridade da fonte celular impacta a confiabilidade dos dados e as decisões de prosseguir ou não prosseguir.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses ao fornecer células-tronco derivadas de adipócitos com morfologia e fenótipo semelhantes aos nativos.
- Triagem: Fornece células padronizadas e prontas para expansão em plataformas de ensaio que exigem características de células estromais mesenquimais.
- Análises: Permite ensaios de citometria de fluxo e diferenciação após três passagens para confirmar a identidade das células-tronco.
- Pesquisa Translacional: Conecta o isolamento ao potencial terapêutico por meio da preservação de propriedades celulares clinicamente relevantes.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável e livre de enzimas para a produção de células-tronco derivadas de adipócitos em diversos projetos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva ao minimizar artefatos induzidos pelo isolamento em experimentos com células-tronco.
- Valor Operacional: Oferece um protocolo simples e econômico, sem dependência de enzimas caras ou centrifugação.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avançar ou não avançar por meio de maior confiança nos resultados de ensaios baseados em células.
- Impacto no Portfólio: Apoia o avanço ajustado ao risco ao fornecer células-tronco mesenquimais confiáveis para avaliação pré-clínica.
Considerações sobre a Implementação
- Requer técnica asséptica e equipamentos básicos de cultura de tecidos para a minceração mecânica e cultura de explantes.
- Depende de instrumentos estéreis, incluindo bisturis, agulhas e espátulas, para o preparo do tecido.
- Necessita de condições padronizadas de incubação a 37°C com 5% de CO2 para crescimento celular ideal.
- Envolve passagem manual com base na confluência ou densidade de agregados após a remoção inicial do tecido.
- Baseia-se em citometria de fluxo e ensaios de diferenciação para confirmação fenotípica após o isolamento.
