Procedimento de funcionamento padrão para a vigilância do Lyssavirus da população do bastão em Formosa
27 de agosto de 2019
Este protocolo introduz um procedimento de funcionamento padrão do laboratório para o teste diagnóstico de antígenos do lyssavirus nos bastões em Formosa.
Lyssavirus é um zoológico-não-tic patógenos. Para avaliar a presença de Lyssavirus em populações de morcegos taiwaneses, iniciamos um programa de vigilância. E identificou com sucesso quatro Lyssaviruses de 2016 a 2018.
Este protocolo é uma introdução passo-a-passo para a vigilância vi-al Lyssavirus em Taiwan. Esperamos que seja útil para pesquisas interessadas na vigilância vi-al Lyssavirus. É importante conectar o símbolo tac-barril correto.
Um morcego morto ou moribundo é mais adequado do que um morcego vivo para vigilância do Lyssavirus. Dependendo das normas de biosegurança do país onde está localizado o laboratório; realize os seguintes procedimentos em um laboratório adequado de nível de bio-segurança. E garantir que os pesquisadores estejam qualificados e usem equipamentos de proteção individual adequados.
Após a coleta de morcegos ou carcaças fracas ou doentes, um ecologista de morcegos identificou a espécie morcego pelas características morfológicas do espécime. Envie uma folha de informações ao laboratório, incluindo o local de coleta, espécies, sinais clínicos e outros dados relevantes com cada amostra de morcego. Antes de iniciar a necroscopia, examine todos os orifícios externos e fotografe as características externas dos morcegos, especialmente a cabeça, orelhas e asas para diferenciação de espécies.
Para coletar uma amostra de cotonete oral coloque o morcego em recumbência ventral em uma placa de dissecção estéril e fixar a cabeça com pinças. Use um bisturi para cortar a pele ao longo da linha média da região da panturrilha; e puxe a pele para os lados laterais, para fazer uma incisão no crânio ao longo da linha média da área da panturrilha. Abra o crânio com pinças para expor o tecido cerebral e use a pinça para separar suavemente o tecido cerebral do tecido nervoso conectado.
Corte a seção transversal do cérebro, incluindo o tronco cerebral e o cerebelo, e toque levemente a superfície cortada do tecido cerebral com lâminas de vidro para causar impressões de difamação. Pressione o slide no tecido da lente para remover o excesso de tecido e fixar as lâminas de impressão de difamação em menos 20 graus celsius acetona por 30 minutos. Então conserte um pequeno pedaço de tecido cerebral fresco, em formalina, para exame histopatológico.
E coloque o resto do tecido em emi-em 10 para extração de ácido nucleico. Em seguida, incisar a pele do coletor ao ânus ao longo da linha média do corpo, e usar a pinça para levantar e separar a pele e sublinhar tecidos musculares; para permitir a coleta das glândulas salivares, localizadas perto do osso mandibular. Levantar ligeiramente o esterno com a pinça, use o bisturi para cortar o esterno e a parede abdominal ao longo da linha média e cortar as clavículas.
Use agulhas para fixar as caixas torácicas esquerda e direita na placa de dissecção, para abrir a cavidade torácica. E gravar as legiões brutas e o grau de mudança pós-morte. Em seguida, use a pinça e o bisturi para remover os tecidos viscerais conforme apropriado para a análise planejada a jusante.
Para realizar um teste de anticorpos fluorescentes diretos no final da fixação, seque os slides de impressão de difamação e selecione pelo menos dois anticorpos antirrábicas conjugados para a análise. Filtre um anticorpo em cada slide através de um filtro de 0,45 micrômetro. E incubar os slides por 30 minutos a 37 graus celsius em uma câmara úmida.
No final da incubação, drene o excesso de conjugado e lave os slides com PBS. Em seguida, use um pequeno volume de 10% de glicerol para montar deslizamentos de cobertura nos slides e imagem dos slides por microscopia de fluorescência. Quando o teste de anticorpos fluorescentes ou a análise RT-PCR indicar positividade, homogeneize a amostra cerebral na suspensão de 10% em emi-en 10 e sedimente os tecidos fleu-rry por centrifugação.
Inocular 200 microlitadores do super-nat-en com três vezes 10 a 6 células neuroblastomas do rato e um mililitro de emi-en 10 por uma hora a 37 graus celsius e 1% de dióxido de carbono. E transfira a suspensão de células homogêneas cerebrais para um frasco quadrado de 25 centímetros, contendo seis mililitros de emi-en 10 frescos. Em um mililitro de suspensão de células homogêneas cerebrais em um deslizamento de vidro revestido de Teflon de quatro poços, com um diâmetro de seis milímetros e colocar o slide a 37 graus celsius e 1% de dióxido de carbono por três a quatro dias.
Após fixação com 100% de acetona, colorir os slides com os mesmos anticorpos antirraiva conjugados de fluorescência, como usado para o teste de anticorpos de fluorescência. E visualize os slides por microscopia fluorescente para determinar o número de inclusões intracida-plas-mic. Depois de tentarpsinizar e subculturar a cultura celular inoculada de acordo com os protocolos padrão, devolva a cultura fria à incubadora de cultura celular por mais três a quatro dias com a repetição da contagem do número de células infectadas como apenas demonstrado até que uma infectividade de 100% seja alcançada.
De janeiro de 2014 a maio de 2017, foram coletadas 332 carcaças de morcegos de 13 espécies para vigilância. Nesta análise representativa de dois casos positivos de morcegos, a impressão cerebral testada negativamente usando o teste de anticorpos fluorescentes com um dos anticorpos antirraiva conjugados comerciais, fit-sy, enquanto o RT-PCR empregando cada um dos dois conjuntos de primer diferentes, produziu resultados positivos. A sujeição da sequência ampli-con obtida para a consulta de explosão no banco de dados do banco Gen revelou que a sequência era semelhante aos Lyssaviruses com identidades inferiores a 79% que suportam as identidades dos Lyssaviruses detectados.
Dois Lyssaviruses foram posteriormente isolados com sucesso dos dois cérebros, confirmados pelo teste de anticorpos de fluorescência e sequenciamento. O passo chave para determinar a positividade do Lyssavirus são o teste de anticorpos de fluorescência e a análise de RCP. O uso de dois ou mais anticorpos antirrábica nos conjuntos de primer é altamente recomendado.
Além do Lyssavirus, outros patógenos de morcego não-ical do zoológico podem ser monitorados usando métodos diagnósticos fechados. Os dados podem então ser usados para informar o público sobre evitar contato com morcegos. Quanto mais pudermos estudar o Lyssavirus morcego, mais seremos capazes de entender sua evolução e impacto na saúde pública.
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Visão geral
Este protocolo apresenta um procedimento operacional padrão para testes diagnósticos de antígenos de lyssavirus em morcegos em Taiwan. Foi desenvolvido para auxiliar pesquisadores a realizar vigilância virológica de Lyssavirus de forma eficaz.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Virologia
- Doenças zoonóticas
- Vigilância em vida selvagem
Contexto
- Lyssavirus é um patógeno zoonótico.
- Programas de vigilância são essenciais para o monitoramento de populações de morcegos.
- Quatro Lyssavírus foram identificados em morcegos de Taiwan entre 2016 e 2018.
- Este protocolo tem como objetivo padronizar os procedimentos de teste.
Objetivo do Estudo
- Avaliar a presença de Lyssavirus em populações de morcegos em Taiwan.
- Fornecer um guia passo a passo para pesquisadores.
- Aprimorar a compreensão da transmissão de doenças zoonóticas.
Métodos Utilizados
- Coleta de amostras de morcegos.
- Teste diagnóstico para antígenos de lyssavírus.
- Análise e interpretação de dados.
- Implementação de protocolos de vigilância.
Resultados Principais
- Identificação de quatro vírus distintos do gênero Lyssavirus.
- Implementação bem-sucedida do programa de vigilância.
- Conscientização aumentada sobre a presença de lyssavírus em morcegos.
- Estabelecimento de um procedimento operacional padrão para testes.
Conclusões
- O protocolo é um recurso valioso para pesquisadores.
- Amplia a capacidade de vigilância de lyssavírus em Taiwan.
- Contribui para a compreensão da dinâmica das doenças zoonóticas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este protocolo de vigilância permite a detecção precoce de lyssavírus zoonóticos em reservatórios silvestres, possibilitando uma avaliação proativa de riscos para a saúde pública e a preparação veterinária. Ao padronizar métodos de detecção de antígenos e ácidos nucleicos, fornece uma estrutura reprodutível para monitorar a ecologia viral em populações de morcegos. A abordagem contribui para a redução de riscos mecanicistas na validação pré-clínica de alvos, esclarecendo a presença de patógenos em sistemas relevantes para doenças.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvos
- Valor Científico: Permite investigar as interações vírus-hospedeiro em reservatórios naturais para orientar a seleção de alvos no desenvolvimento de antivirais.
- Valor Operacional: Oferece processamento padronizado de tecidos e validação por métodos duplos (FAT e RT-PCR) para reduzir as taxas de falso-negativo na triagem de patógenos.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Facilita a padronização de ensaios mediante o uso de conjugados duplos de anticorpos e conjuntos de primers validados para amplificação da nucleoproteína do lyssavirus.
- Valor Operacional: Apoia fluxos de trabalho escalonáveis de vigilância ao definir protocolos claros de necropsia, coleta de amostras e biossegurança para o manejo de espécimes de vida selvagem.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Gera dados de sequência para análise filogenética, apoiando o rastreamento evolutivo de variantes de lyssavirus relevantes para o risco de transmissão entre espécies.
- Valor Operacional: Permite o monitoramento longitudinal da prevalência viral, orientando decisões de avançar ou não avançar na priorização de pipelines antivirais com base nos níveis de ameaça ecológica.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra aos fluxos de trabalho da biologia de descoberta ao fornecer amostras biológicas validadas para ensaios virológicos e caracterização de antígenos em etapas subsequentes. Ele contribui para a prontidão em triagens por meio do preparo padronizado de tecido cerebral adequado para detecção por imunofluorescência e métodos moleculares. O protocolo gera resultados quantitativos e qualitativos (sinal de fluorescência, tamanho do amplicon, dados de sequenciamento) que permitem análises comparativas ao longo do tempo, geografia e espécies hospedeiras.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre a circulação de lyssavírus em populações de morcegos por meio da coleta sistemática de espécimes e confirmação diagnóstica.
- Triagem: Garante a reprodutibilidade dos ensaios exigindo testes duplicados de anticorpos e verificação com dois primers para detecção de ácidos nucleicos.
- Análises: Fornece resultados mensuráveis, incluindo taxas de positividade na TIF, sucesso na amplificação por RT-PCR e porcentagens de identidade de sequência para comparação em bancos de dados.
- Pesquisa Translacional: Conecta a vigilância de campo à relevância pré-clínica ao identificar cepas de lyssavírus com potencial zoonótico para caracterização adicional.
- Reutilização Institucional: Estabelece uma estrutura de vigilância transferível, aplicável a outras regiões suscetíveis a lyssavírus ou a programas de monitoramento de vida selvagem com potencial zoonótico.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva em modelos de risco zoonótico por meio de dados empíricos de detecção de lyssavírus em reservatórios silvestres.
- Valor Operacional: Promove a padronização entre laboratórios por meio de níveis definidos de biossegurança, requisitos de EPI e procedimentos de manipulação de espécimes.
- Valor Estratégico: Orienta decisões de portfólio ao fornecer alerta precoce de emergência viral em interfaces de alto risco entre morcegos, humanos e animais domésticos.
- Impacto no Portfólio: Permite a alocação de recursos ajustada ao risco para candidatos a antivirais com ampla cobertura de lyssavírus, com base na diversidade de cepas derivada da vigilância.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em necropsia de morcegos, identificação de espécies e práticas laboratoriais em nível biosseguro 2 ou 3.
- Depende de equipamentos de microscopia de fluorescência, instrumentação para RT-PCR e preservação da cadeia fria para ácidos nucleicos (emi-em 10).
- Necessita de coordenação entre grupos de conservação da vida selvagem, autoridades veterinárias e laboratórios de diagnóstico para envio oportuno de espécimes.
- Deve levar em conta as variações regionais na composição das espécies de morcegos e na prevalência de cepas de lyssavirus ao adaptar os protocolos.
- Limitado pela qualidade das amostras, pois a degradação pós-morte pode afetar a integridade do antígeno e o rendimento de RNA para testes subsequentes.
