Name: Procedimento de funcionamento padrão para a vigilância do Lyssavirus da população do bastão em Formosa (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-27T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 s
Description: Aprenda o procedimento de vigilância do Lyssavirus em morcegos de Taiwan usando testes de anticorpos fluorescentes e RT-PCR. Este protocolo padronizado auxilia pesquisadores em doenças zoonóticas.

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Agradecemos a Tien-Cheng Li, Yi-Tang Lin, Chia-jung Tsai e Ya-LAN li por sua assistência durante este estudo. Este estudo foi apoiado por Grant no. 107AS-8.7.1-BQ-B2 (1) do Bureau de inspeção e quarentena de saúde animal e vegetal, Conselho de agricultura, executivo Yuan, Taiwan.

1. precauções de segurança ao manusear lissavírus
<ol><li>Assegure-se de que todos os trabalhadores laboratoriais que manuseiam espécimes de morcego recebam profilaxia antirrábica17. Monitore os níveis de anticorpos da raiva dos trabalhadores de antemão e reexamine-os a cada 6 meses17. A vacinação antirrábica de seguimento é necessária para aqueles cujos níveis de anticorpos são inferiores a 0,5 UI/mL17.</li>
	<li>Dependendo dos regulamentos de biossegurança do país em que o laboratório está localizado, assegure-se de que os seguintes procedimentos sejam realizados em laboratórios de nível de biossegurança adequados (por exemplo, laboratórios BSL-2 em Taiwan e em laboratórios BSL-3 na Austrália), e que trabalhadores são atualmente qualificados e usam equipamento de proteção pessoal adequado18. Nota: a vacinação contra a raiva fornece pouca ou nenhuma proteção contra os lissavírus pertencentes aos fitógrupos II e III18. Os trabalhadores devem ser informados de que vários patógenos zoonóticos foram identificados em morcegos19 e devem manipular amostras condições adequadas de laboratório de nível de biossegurança com equipamento de proteção pessoal adequado.</li>
</ol>2. coleta de amostra
<ol><li>Use encontrado morcegos fracos ou doentes ou carcaças. Nota: morcegos fracos ou doentes são entregues à sociedade de conservação de morcego de Taipei para cuidados veterinários ou pesquisa, enquanto as carcaças são submetidas diretamente ao Instituto de pesquisa em saúde animal. Nenhum morcego saudável foi eutanasiado neste programa de vigilância.</li>
	<li>Ter um ecologista morcego identificar espécies de morcegos através de características morfológicas20.</li>
	<li>Executar o DNA código barras da espécie de morcego quando o lyssavirus positivo é diagnosticado, usando procedimentos publicados anteriormente21.</li>
	<li>Submeter uma ficha informativa de cada carcaça de morcego (local de recolha, espécie, sinais clínicos, etc.).</li>
</ol>3. necropsia de espécimes de morcego
<ol><li>Prepare materiais.<ol>
<li>Prepare uma placa de dissecção limpa e coloque uma almofada absorvente estéril para necropsia.</li>
		<li>Prepare tubos de coleta para coletar órgãos de morcegos.</li>
		<li>Prepare pinças descartáveis e bipels para necropsia. Troque as ferramentas entre a necropsia de cada morcego. Prepare bolas de algodão umedecidas com etanol a 70% para a limpeza de pinças e bipéis durante a amostragem.</li>
		<li>Prepare duas lâminas de microscópio para a FAT. Colete espécimes frescos e corrigi-los em solução de formalina para exame histopatológico.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Examine todos os orifícios externos antes da necropsia. Fotografe as características externas do morcego, especialmente a cabeça, orelhas e asas, para diferenciação de espécies.</li>
	<li>Colete uma amostra de swab oral. Coloque o bastão em decúbito ventral no tabuleiro e fixar a cabeça do morcego com pinças. Corte a pele ao longo da linha média da Calvaria com um bisturi e puxe a pele para os lados laterais. Corte o crânio ao longo da linha média da Calvaria com um bisturi e abra-o com uma pinça para expor o tecido cerebral.</li>
	<li>Retire o tecido cerebral do crânio e coloque-o sobre um depressor de língua estéril, e fazer manchas de impressão do tecido cerebral (ver passo 4,2). Colete um pequeno pedaço de tecido cerebral fresco e corrigi-lo em formalina para exame histopatológico. Contenha o tecido cerebral remanescente em um tubo para extração de ácido nucleico.</li>
	<li>Limpe pinças e bisturi com bolas de algodão umedecidas com etanol a 70% para remover os tecidos retidos entre a coleta de amostras.</li>
	<li>Coloque o bastão no tabuleiro em decúbito dorsal e corrigi-lo na placa com agulhas em ambos os lados da axila e calcanhar da cauda.</li>
	<li>Incise a pele ao longo da linha média do corpo da mandíbula ao ânus. Levante e separe a pele e os tecidos musculares subjacentes com pinças. Colete as glândulas salivares, que estão perto do osso mandibular.</li>
	<li>Levante ligeiramente o esterno com pinças e corte o esterno e a parede abdominal ao longo da linha média com um bisturi. Corte as clavículas com um bisturi. Fixar as gaiolas de costela esquerda e direita para a placa com agulhas para abrir a cavidade torácica.</li>
	<li>Registre as lesões brutas e o grau de mudança post-mortem.</li>
	<li>Retire os tecidos viscerais (i.e., coração, pulmões, fígado, rins, intestinos) da carcaça usando pinças e um bisturi. Colete os espécimes viscerais conforme necessário para futuras pesquisas. Observação: a coleção de amostras duplicadas é recomendada. Um deve ser coletado para o diagnóstico molecular, e o outro deve ser congelado em-80 ° c com ou sem meio de transporte viral para a cultura viral22.</li>
</ol>4. teste de anticorpo fluorescente direto (FAT)
<ol><li>Faça esfregaços de impressão do tecido cerebral para a FAT. Execute o Fat como descrito anteriormente18,23 com as seguintes modificações.</li>
	<li>Separe suavemente o tecido cerebral do tecido nervoso conectado com pinças e transfira o tecido cerebral para um depressor de língua estéril. Corte a seção transversal do cérebro, incluindo o tronco cerebral e cerebelo18,23. Faça manchas de impressão do tecido cerebral, tocando levemente a superfície cortada do tecido cerebral, e pressione o slide no tecido da lente para remover o excesso de tecido.</li>
	<li>Fixar as lâminas com acetona a-20 ° c durante 30 min. seque as lâminas testadas e os controlos positivos e negativos antes de se manchar com o conjugado.</li>
	<li>Usando cada um dos dois comercialmente disponíveis FITC-conjugated anti-raiva anticorpos para coloração de antígeno de lissavirus é altamente recomendado23. Determine a concentração de trabalho do conjugado comercial antes da primeira coloração. Soltar os conjugados diluídos através de um filtro de seringa de 0,45 μM nas lâminas e incubar as lâminas a 37 ° c durante 30 min dentro de uma câmara húmida.</li>
	<li>Drenar o excesso de conjugado das lâminas e lavar as lâminas com tampão fosfato salina (PBS) após a incubação.</li>
	<li>Solte uma pequena quantidade de 10% de glicerol nas lâminas e cubra com lâminas de cobertura.</li>
	<li>Examine as lâminas com um microscópio fluorescente.</li>
</ol>5. extração de ácido nucleico
<ol><li>Adicione o volume apropriado de MEM-10 (meio essencial mínimo suplementado com o soro bovino fetal de 10%) ao tecido de cérebro (10% w/v).</li>
	<li>Homogeneate o tecido cerebral com um grânulo de aço de 5 milímetros em um instrumento do homogeneizador e centrifugue em 825 x g por 10 minutos.</li>
	<li>Extraia o ácido nucleico, cujo volume final é de 50 μL, dentro de 200 μL do sobrenadante utilizando o kit de extração de ácido nucleico total disponível comercialmente com instrumento.</li>
</ol>6. RT-PCR e análise filogenética
Nota: vários conjuntos de primers foram publicados para detectar todos os lyssavirus conhecidos ou lyssavirus específicos. O protocolo descrito aqui é um exemplo que nosso laboratório usa e pode não caber todas as necessidades experimentais. Selecione primers adequados de acordo com as necessidades laboratoriais.
<ol><li>Prepare o reagente RT-PCR de uma etapa da seguinte forma: Adicionar 5 μL de ácido nucleico extraído à mistura de reacção contendo 2,5 μL de tampão de reacção 10x, 0,5 μL de primers para a frente e para trás (10 μM de cada), 4 μL de dNTP de 1,25 mM, 0,3 μL de inibidor de RNase (40 U/μL) , 0,3 μL de transcriptase reversa (10 U/μL), 0,4 μL de DNA polimerase (5 U/μL) e 11,5 μL de água tratada com DEPC. Nota: o conjunto primário utilizado neste protocolo é JW12 (5 '-ATGTAACACCYCTACAATG-3 ') e N165-146 (5 '-GCAGGGTAYTTRTACTCATA-3 ')24. Modificar a preparação de reagentes e condições de ciclismo de acordo com os conjuntos de primer utilizados.</li>
	<li>Realize a ciclagem as seguintes condições: incubação a 42 ° c por 40 min; desnaturação inicial a 94 ° c por 10 min; 35 ciclos de 94 ° c para 30 s, 55 ° c para 30 s e 72 ° c para 30 s; e finalmente, mais extensão em 72 ° c por 10 min.</li>
	<li>Use um ou mais conjuntos de primer para aumentar a sensibilidade diagnóstica.<ol>
<li>Use N113F (5 '-gtaggatgctatatggg-3 ') e N304R (5 '-ttgacgaagatcttgctcat-3 ')25,26 para preparar o reagente de RT-PCR de um passo da seguinte forma: Adicionar 5 μL de ácido nucleico extraído a uma mistura de reacção contendo 5 μL de tampão 10x, 5 μL de primers de avanço e reverso (4 μM de cada), 5 μL de dNTP de 1,25 mM, 0,5 μL de inibidor de RNase (40 U/μL), 0,2 μL de transcriptase reversa (10 U/μL), 1 μL de DNA polimerase (5 U/μL) e 23,3 μL de água tratada com DEPC.</li>
		<li>Realize a ciclagem as seguintes condições: incubação a 42 ° c por 40 min; desnaturação inicial a 95 ° c por 5 min; 35 ciclos de 95 ° c por 1 min, 55 ° c por 1 min e 20 s, e 72 ° c por 1 min; e finalmente, mais extensão em 72 ° c por 10 min. Nota: dependendo das necessidades laboratoriais, escolha primers adequados para o diagnóstico. N113F foi originalmente projetado para a amplificação do vírus da raiva, mas pode não funcionar bem para outros lyssavirus. O conjunto de N113F e N304R funciona bem para o vírus da raiva (variante de texugo de Taiwan) e o lyssavirus de morcego de Taiwan. Será mais fácil obter sequências inteiras de nucleoproteínas usando o conjunto de primers JW12 e N304R se o lyssavirus for amplificado por ambos os dois conjuntos de primer acima.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analise o produto do PCR na electroforese do gel do agarose de 2% e visualize pela iluminação da luz UV.</li>
	<li>Sequencia o produto do PCR pelo serviço de sequenciamento comercial.</li>
	<li>Insira ou carregue a sequência na página da Web da ferramenta de pesquisa de alinhamento local básica nucleotídeo (BLAST). Selecione o "outros (NR etc.)" banco de dados e entrar no organismo como lyssavirus. Selecione o algoritmo MegaBlast e execute o BLAST.</li>
</ol>7. isolamento de vírus
Nota: execute o isolamento de vírus quando 1) a FAT ou 2) o RT-PCR indica positividade.
<ol><li>Homogeneize o espécime do cérebro em uma suspensão de 10% (w/v) em MEM-10. Centrifugador a 825 x g durante 10 min.</li>
	<li>Inocular 200 μL de sobrenadante com uma suspensão de 3 x 106 Mna (rato neuroblastoma) células em 1 ml de mem-10 para 1 h a 37 ° c com 1% Co2. Transfira a suspensão do homogeneato de células cerebrais para um balão de 25 cm2 e adicione 6 ml de mem-10.</li>
	<li>Cultive 1 mL da suspensão de células de homogeneatos cerebrais em uma corrediça de vidro revestida com Teflon de 4 poços com 6 mm de diâmetro ao mesmo tempo.</li>
	<li>Após 3 – 4 dias de incubação a 37 ° c com 1% de CO2, fixar as células na corrediça de 4 poços com 100% de acetona (v/v).</li>
	<li>Manchar as lâminas com dois anticorpos anti-raiva conjugados FITC seguindo os passos 4.4 – 4.7. As células estão infectadas quando as inclusões intracitoplasmicas são investigadas. Registre a porcentagem de células infectadas.</li>
	<li>Executar tripsinização e subcultura da cultura de célula inoculada quando as lâminas são manchadas como negativas:<ol>
<li>Retire o meio e enxague o balão com 5 mL de PBS.</li>
		<li>Adicione 1 mL de tripsina ao balão e bata firmemente no fundo do balão.</li>
		<li>Adicionar 6 mL de MEM-10 e ressuspender as células.</li>
		<li>Coloque a suspensão celular em um novo balão de tecido (6 mL) e em uma corrediça de 4 poços (1 mL).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Repita os passos 7.4 – 7.6 até 100% de infectividade ser atingida.</li>
	<li>Colete o sobrenadante após 24 h de incubação.</li>
</ol>

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<li>Robardet, E., Picard-Meyer, E., Andrieu, S., Servat, A., Cliquet, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+interlaboratory+trials+on+rabies+diagnosis%3A+an+overview+of+results+and+variation+in+reference+diagnosis+techniques+%28fluorescent+antibody+test%2C+rabies+tissue+culture+infection+test%2C+mouse+inoculation+test%29+and+molecular+biology+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">International interlaboratory trials on rabies diagnosis: an overview of results and variation in reference diagnosis techniques (fluorescent antibody test, rabies tissue culture infection test, mouse inoculation test) and molecular biology techniques.</a> Journal of Virological Methods. 177 (1), 15-25 (2011).</li>
</ol>

Nenhum conflito de interesses é declarado.

Este procedimento de funcionamento padrão do laboratório (SOP) fornece um processo de série para testar amostras do bastão para a presença de antígenos do lyssavirus em Formosa. Os passos principais incluem o emprego de FAT e RT-PCR. A seleção de amostras apropriadas e o isolamento bem-sucedido do vírus também são importantes. Adicionalmente, alguma solução de problemas foi conduzida durante a monitoração de lyssavirus do bastão. A diferença principal era os animais do alvo. Inicialmente (2008 – 2009), os animais-alvo da...

Vírus dentro do gênero lyssavirus são patógenos zoonóticos. Há pelo menos sete espécies de lyssavirus associadas a casos humanos1. Além das 16 espécies deste gênero1,2,3, Taiwan bat lyssavirus (twblv)4 e Kotalahti bat lyssavirus5 foram recentemente identificados em morcegos, mas seus status taxonômicos ainda não ser determinado.
Os morcegos são os hospedeiros naturais da maioria dos lissavírus, com exceção de Mokola lyssavirus e Ikoma lyssavirus, que ainda não foram identificados em nenhum morcego1,2,3,6. A informação sobre os lyssavirus em morcegos asiáticos ainda é limitada. Dois lyssavirus não caracterizados em morcegos asiáticos (um na Índia e outro na Tailândia)7,8foram relatados . Um caso humano da raiva associou com uma mordida de bastão em China foi relatado em 2002, mas o diagnóstico foi feito somente pela observação clínica9. Em Ásia Central, o lyssavirus de Aravan foi identificado no morcego rato-eared menor (Myotis blythi) em quirguistão em 1991, e o lyssavirus de Khujand foi identificado no morcego whiskered (Myotis mystacinus) em tajikistan em 200110. Em Ásia Sul, o lyssavirus do bastão de Gomes foi identificado na raposa Indian do vôo (medius de Pteropus) em Sri Lanka em 20153. No sudeste asiático, vários estudos sorológicos sobre morcegos nas Filipinas, Tailândia, Bangladesh, Camboja e Vietnã mostraram soroprevalência variável11,12,13,14, quinze anos. Embora o lyssavirus de Irkut fosse identificado no bastão tubo-cheirado maior (leucogaster de Murina) na província de Jilin, China em 201216, as espécies exatas e as posições de lyssavirus em populações asiáticas orientais do bastão permanecem desconhecidas.
Para avaliar a presença de lyssavirus em populações de morcegos taiwaneses, iniciou-se um programa de vigilância empregando tanto a FAT direta como a RT-PCR. O lyssavirus do bastão de Formosa foi identificado em dois casos do pipistrelle japonês (ABRAMUS de Pipistrellus)4 em 2016 – 2017. No artigo atual, um procedimento de funcionamento padrão do laboratório é introduzido para a fiscalização do Lyssavirus da população do bastão em Formosa. O fluxograma do diagnóstico do lyssavirus do bastão em nosso laboratório é apresentado em Figura 1.

<table><tbody><tr><td>2,5% Tripsina (10x)</td><td>Gibco</td><td>15090046</td><td>Tripsina</td></tr><tr><td>25 cm2 frasco</td><td>Greiner bio-one</td><td>690160</td><td></td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Honeywell</td><td>32201-1L</td><td></td></tr><tr><td>Agarose I</td><td>VWR Ciências da Vida</td><td>97062-250</td><td></td></tr><tr><td>Álcool</td><td>NIHON SHIYAKU REAGENT</td><td>NS-32294</td><td></td></tr><tr><td>AMV Transcriptase reversa</td> Antibiótico-Antimicótico <td>Promega</td><td>M5101</td><td></td></tr><tr><td>(100X)&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td>MEM-10</td></tr><tr><td>Lâmina</td><td>Braun</td><td>BA215</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de quimiolumineância</td><td>TOP BIO CO.</td><td>Tubo de coleta MGIS-21-C2-1M</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Qiagen</td><td>990381</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de coleta</td><td>SSI</td><td>2341-SO</td><td></td></tr><tr><td>Cobrir a corrediça</td><td>Muto Pure chemical Co., LTD.</td><td>24505</td><td></td></tr><tr><td>analisador de DNA</td><td>Applied Biosystems</td><td>3700XL</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino fetal</td><td>Gibco</td><td>10437028</td><td>MEM-10</td></tr><tr><td>FITC Anti-Rábicos Globulina Monoclonal</td><td>Fujirebio Diagnostic Inc.</td><td>800-092</td><td>Anticorpos anti-rábicos conjugados com FITC: reagente B</td></tr><tr><td>Lâmina de vidro com revestimento de Teflon de quatro poços</td> Sistema de eletroforese em gel <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>30-86H-WHITE</td><td></td></tr> Major <tr><td></td><td>Science</td><td>MJ-105-R</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (1x)</td><td>Gibco</td><td>14175095</td><td>Incubadora de tripsina</td></tr><tr><td></td><td>ASTEC</td><td>SCA-165DS</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio invertido</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina 200 mM (100x)</td><td>Gibco</td><td>A2916801</td><td>MEM-10</td></tr><tr><td>LIGHT DIAGNOSTICS Reagente anti-rábico FAT EMD</td><td>Millipore Corporation</td><td>5100</td><td>Anticorpos anti-rábicos conjugados com FITC: reagente A</td></tr><tr><td>MagNA Pure Compact Instrument</td><td>Roche</td><td>03731146001</td><td></td></tr><tr><td>MagNA Pure Compact NA Isolation Kit 1</td><td>Roche</td><td>03730964001</td><td></td></tr><tr><td>MEM (10x)</td> <td>Gibco</td><td>11430030</td><td>MEM-10</td></tr><tr><td>MEM NEAA (100x)</td> <td>Gibco</td><td>11140050</td><td>MEM-10</td></tr><tr><td>MEM solução vitamínica</td><td>Gibco</td><td>11120052</td><td>MEM-10</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Merck</td><td>1.06329.0500</td><td>MEM-10</td></tr><tr><td>Agulha</td><td>Terumo</td><td>NN * 2332R9</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Medicago</td><td>09-8912-100</td><td></td></tr><tr><td>Síntese de primers</td><td>Mission Biotech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNasin ribonuclease inhibitor</td><td>Promega</td><td>N2111</td><td></td></tr><tr><td>Serviço de sequenciamento</td><td>Mission Biotech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slide</td><td>Thermo Scientific</td><td>AA00008032E00MNT10</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate (100 mM)</td><td>Gibco</td><td>11360070</td><td>MEM-10</td></tr><tr><td>Stainless Steel Beads</td><td>QIAGEN</td><td>69989</td><td></td></tr><tr><td>Almofada absorvente estéril</td><td>3M</td><td>1604T-2</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de seringa</td><td>Nalgene</td><td>171-0045</td><td></td></tr><tr><td>Taq polimerase</td><td>JMR Holdings</td><td>JMR-801</td><td></td></tr><tr><td>Termociclador</td><td>Applied Biosystems</td><td>2720</td><td></td></tr><tr><td>TissueLyser II</td><td>QIAGEN</td><td>85300</td><td></td></tr><tr><td>Abaixador de língua</td><td>HONJER CO., LTD.</td><td></td><td></td>122246</tr><tr><td>Pinça</td><td>Tennyson instrumento médico desenvolvimento CO., LTD.</td><td>A0601</td><td></td></tr><tr><td>Tartarato de Tilosina</td><td>Sigma</td><td>T6271-10G</td><td>MEM-10</td></tr></tbody></table>

procedimento de funcionamento padrão para a vigilância do lyssavirus da população do bastão em formosa

Standard Operating Procedure for Lyssavirus Surveillance of the Bat Population in Taiwan

Vírus dentro do gênero lyssavirus são patógenos zoonóticos, e pelo menos sete espécies de lyssavirus estão associadas a casos humanos. Porque os morcegos são reservatórios naturais da maioria dos lissavírus, um programa de vigilância de lyssavirus de morcegos tem sido conduzido em Taiwan desde 2008 para entender a ecologia desses vírus em morcegos. Neste programa, organizações não-governamentais de conservação de morcegos e centros de controle de doenças animais locais cooperaram para coletar morcegos mortos ou morcegos morrendo de fraqueza ou doença. Os tecidos cerebrais dos morcegos foram obtidos por necropsia e submetidos ao teste de anticorpo fluorescente direto (FAT) e reação em cadeia da polimerase reversa (RT-PCR) para detecção de antígenos de lyssavirus e ácidos nucleicos. Para a FAT, recomenda-se pelo menos dois conjugados de diagnóstico de raiva diferentes. Para o RT-PCR, dois conjuntos de primers (JW12/N165-146, N113F/N304R) são usados para amplificar uma sequência parcial do gene da nucleoproteína do lyssavirus. Este programa de vigilância monitora os lissavírus e outros agentes zoonóticos em morcegos. O lyssavirus do bastão de Formosa é encontrado em dois casos do pipistrelle japonês (ABRAMUS de Pipistrellus) em 2016 – 2017. Esses achados devem informar o público, os profissionais de saúde e os cientistas sobre os potenciais riscos de contato com morcegos e outros animais selvagens.

De 2014 a maio de 2017, foram coletadas 332 carcaças de morcegos de 13 espécies para vigilância. Dois positivos testados. No primeiro caso de morcego, a impressão cerebral testou negativamente usando a FAT com um dos anticorpos antirrábico FITC-conjugados comerciais (Figura 2), enquanto o RT-PCRs empregando cada um dos dois conjuntos de primer (JW12/N165-146, N113F/N304R) rendeu resultados positivos (Figura 3). Uma seqüência de 428 BP do amplicon (amplificada co...

Este protocolo introduz um procedimento de funcionamento padrão do laboratório para o teste diagnóstico de antígenos do lyssavirus nos bastões em Formosa.

Procedimento de funcionamento padrão para a vigilância do Lyssavirus da população do bastão em Formosa

Viruses within the genus Lyssavirus are zoonotic pathogens, and at least seven lyssavirus species are associated with human cases. Because bats are ...

Lyssavirus é um zoológico-não-tic patógenos. Para avaliar a presença de Lyssavirus em populações de morcegos taiwaneses, iniciamos um programa de vigilância. E identificou com sucesso quatro Lyssaviruses de 2016 a 2018.Este protocolo é uma introdução passo-a-passo para a vigilância vi-al Lyssavirus em Taiwan. Esperamos que seja útil para pesquisas interessadas na vigilância vi-al Lyssavirus. É importante conectar o símbolo tac-barril correto.Um morcego morto ou moribundo é mais adequado do que um morcego vivo para vigilância do Lyssavirus. Dependendo das normas de biosegurança do país onde está localizado o laboratório; realize os seguintes procedimentos em um laboratório adequado de nível de bio-segurança. E garantir que os pesquisadores estejam qualificados e usem equipamentos de proteção individual adequados.Após a coleta de morcegos ou carcaças fracas ou doentes, um ecologista de morcegos identificou a espécie morcego pelas características morfológicas do espécime. Envie uma folha de informações ao laboratório, incluindo o local de coleta, espécies, sinais clínicos e outros dados relevantes com cada amostra de morcego. Antes de iniciar a necroscopia, examine todos os orifícios externos e fotografe as características externas dos morcegos, especialmente a cabeça, orelhas e asas para diferenciação de espécies.Para coletar uma amostra de cotonete oral coloque o morcego em recumbência ventral em uma placa de dissecção estéril e fixar a cabeça com pinças. Use um bisturi para cortar a pele ao longo da linha média da região da panturrilha; e puxe a pele para os lados laterais, para fazer uma incisão no crânio ao longo da linha média da área da panturrilha. Abra o crânio com pinças para expor o tecido cerebral e use a pinça para separar suavemente o tecido cerebral do tecido nervoso conectado.Corte a seção transversal do cérebro, incluindo o tronco cerebral e o cerebelo, e toque levemente a superfície cortada do tecido cerebral com lâminas de vidro para causar impressões de difamação. Pressione o slide no tecido da lente para remover o excesso de tecido e fixar as lâminas de impressão de difamação em menos 20 graus celsius acetona por 30 minutos. Então conserte um pequeno pedaço de tecido cerebral fresco, em formalina, para exame histopatológico.E coloque o resto do tecido em emi-em 10 para extração de ácido nucleico. Em seguida, incisar a pele do coletor ao ânus ao longo da linha média do corpo, e usar a pinça para levantar e separar a pele e sublinhar tecidos musculares; para permitir a coleta das glândulas salivares, localizadas perto do osso mandibular. Levantar ligeiramente o esterno com a pinça, use o bisturi para cortar o esterno e a parede abdominal ao longo da linha média e cortar as clavículas.Use agulhas para fixar as caixas torácicas esquerda e direita na placa de dissecção, para abrir a cavidade torácica. E gravar as legiões brutas e o grau de mudança pós-morte. Em seguida, use a pinça e o bisturi para remover os tecidos viscerais conforme apropriado para a análise planejada a jusante.Para realizar um teste de anticorpos fluorescentes diretos no final da fixação, seque os slides de impressão de difamação e selecione pelo menos dois anticorpos antirrábicas conjugados para a análise. Filtre um anticorpo em cada slide através de um filtro de 0,45 micrômetro. E incubar os slides por 30 minutos a 37 graus celsius em uma câmara úmida.No final da incubação, drene o excesso de conjugado e lave os slides com PBS. Em seguida, use um pequeno volume de 10% de glicerol para montar deslizamentos de cobertura nos slides e imagem dos slides por microscopia de fluorescência. Quando o teste de anticorpos fluorescentes ou a análise RT-PCR indicar positividade, homogeneize a amostra cerebral na suspensão de 10% em emi-en 10 e sedimente os tecidos fleu-rry por centrifugação.Inocular 200 microlitadores do super-nat-en com três vezes 10 a 6 células neuroblastomas do rato e um mililitro de emi-en 10 por uma hora a 37 graus celsius e 1% de dióxido de carbono. E transfira a suspensão de células homogêneas cerebrais para um frasco quadrado de 25 centímetros, contendo seis mililitros de emi-en 10 frescos. Em um mililitro de suspensão de células homogêneas cerebrais em um deslizamento de vidro revestido de Teflon de quatro poços, com um diâmetro de seis milímetros e colocar o slide a 37 graus celsius e 1% de dióxido de carbono por três a quatro dias.Após fixação com 100% de acetona, colorir os slides com os mesmos anticorpos antirraiva conjugados de fluorescência, como usado para o teste de anticorpos de fluorescência. E visualize os slides por microscopia fluorescente para determinar o número de inclusões intracida-plas-mic. Depois de tentarpsinizar e subculturar a cultura celular inoculada de acordo com os protocolos padrão, devolva a cultura fria à incubadora de cultura celular por mais três a quatro dias com a repetição da contagem do número de células infectadas como apenas demonstrado até que uma infectividade de 100% seja alcançada.De janeiro de 2014 a maio de 2017, foram coletadas 332 carcaças de morcegos de 13 espécies para vigilância. Nesta análise representativa de dois casos positivos de morcegos, a impressão cerebral testada negativamente usando o teste de anticorpos fluorescentes com um dos anticorpos antirraiva conjugados comerciais, fit-sy, enquanto o RT-PCR empregando cada um dos dois conjuntos de primer diferentes, produziu resultados positivos. A sujeição da sequência ampli-con obtida para a consulta de explosão no banco de dados do banco Gen revelou que a sequência era semelhante aos Lyssaviruses com identidades inferiores a 79% que suportam as identidades dos Lyssaviruses detectados.Dois Lyssaviruses foram posteriormente isolados com sucesso dos dois cérebros, confirmados pelo teste de anticorpos de fluorescência e sequenciamento. O passo chave para determinar a positividade do Lyssavirus são o teste de anticorpos de fluorescência e a análise de RCP. O uso de dois ou mais anticorpos antirrábica nos conjuntos de primer é altamente recomendado.Além do Lyssavirus, outros patógenos de morcego não-ical do zoológico podem ser monitorados usando métodos diagnósticos fechados. Os dados podem então ser usados para informar o público sobre evitar contato com morcegos. Quanto mais pudermos estudar o Lyssavirus morcego, mais seremos capazes de entender sua evolução e impacto na saúde pública.

standard-operating-procedure-for-lyssavirus-surveillance-bat

Research

JoVE Journal

Environment

Ambiente

Aqui, apresentamos os protocolos para identificar imunomoduladores 1) vírus-codificado que promovem a replicação de arbovírus e fatores do hospedeiro 2) eucariota que restringem a replicação de arbovírus. Esses métodos baseados em fluorescência e luminescência permitem aos investigadores para rapidamente obter leituras quantitativas de replicação de arbovírus em simplistas ensaios com baixa relação sinal-ruído.

Arbovírus infecções como ferramentas de triagem para a identificação de fatores Antiviral Viral de imunomoduladores e Host

Um Pan-lyssavirus Nested transcrição reversa da polimerase em cadeia foi desenvolvida para detectar especificamente todos os lissavírus conhecidos. A validação utilizando amostras cerebrais da raiva de diferentes espécies animais mostrou que este método tem sensibilidade e especificidade equivalentes ao teste padrão-ouro de anticorpos fluorescentes e pode ser utilizado para o diagnóstico rotineiro da raiva.

Avaliação de uma reação em cadeia da polimerase de transcrição reversa universal aninhada para a detecção de lissavírus

Este é um protocolo para a preparação óptima do tecido para análises genomic, transcriptomic, e proteômica dos bastões capturados no selvagem. Inclui protocolos para captura e dissecção de morcegos, preservação tecidual e cultivo celular de tecido morcego.

Coleção de tecidos de morcegos para análises de Omics e cultura de células primárias

Este RT-PCR tempo real usando a tintura intercalando de dsDNA é apropriado diagnosticar infecções do lyssavirus. O método começa com o RNA extraído da raiva suspeita de amostras ante mortem ou post-mortem, detalhando a preparação da mistura mestra, adição de RNA, configuração da máquina em tempo real e interpretação correta dos resultados.

Tempo real RT-PCR do Pan-lyssavirus para o diagnóstico da raiva

Apresentamos um protocolo completo para o diagnóstico pós-morte da raiva animal em condições de campo usando um teste de diagnóstico imunocromatográfico rápido (RIDT), desde a amostragem da biópsia cerebral até a interpretação final. Também descrevemos outras aplicações usando o dispositivo para análise molecular e genotipagem viral.

Teste de diagnóstico imunocromatográfico rápido pós-morte de campo para configurações limitadas de recursos com outras aplicações moleculares

Este protocolo demonstra o ensaio de reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa em tempo real (RT-PCR) pan-lyssavirus LN34 desde a coleta do tecido até a interpretação dos resultados, incluindo atualizações nas sequências e formulações de primers para melhorar o desempenho do ensaio para alguns lyssavirus e lagomorfos não anti-rábicos. Também demonstramos a configuração do ensaio para um formato multiplexado LN34 de poço único (LN34M).

Diagnóstico post-mortem de raiva em animais pelo ensaio de reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa em tempo real LN34 atualizado e multiplexado

Uma abordagem foi desenvolvida para identificar condições ideais de concentração viral para amostras de água de pequeno volume usando picos de adenovírus humano. As técnicas descritas aqui são usadas para identificar parâmetros de concentração para outros alvos virais e aplicadas à experimentação de concentração viral em larga escala.

Um Procedimento volume pequeno para Concentração Viral da Água

É necessário um cuidado especial com o uso de "técnicas limpas" para coletar e processar adequadamente amostras de água para estudos de traços de metais em ambientes aquáticos. É apresentado um protocolo para procedimentos de amostragem, processamento e análise com o objetivo de obter dados confiáveis de monitoramento ambiental e resultados com alta sensibilidade para estudos detalhados de metais traços.

Limpo Amostragem e Análise do Rio e Estuarina Waters de Estudos de metal de rastreamento

Plâncton e partículas em suspensão desempenham um papel importante nos ciclos biogeoquímicos no oceano. Aqui, nós fornecemos um método ultra-limpo, baixo stress para a recolha de vários tamanhos de partículas e plâncton no mar com a capacidade de lidar com grandes volumes de água do mar.

Um aparelho ultra limpo Multicamado para coleta de plâncton marinho tamanho fracionado e partículas em suspensão

Apresentamos um protocolo para a síntese de açúcares C5 (xilose e arabinose) de uma renovável biomassa lignocelulósica não comestíveis (ou seja, juta), com a presença de Brønsted líquidos iônicos ácidos (bolas) como catalisador na água. O catalisador de bolas exibiu o melhor desempenho catalítico convencionais catalisadores ácidos minerais (H2SO4 e HCl).

Um novo método para a análise de Pentosan presentes na biomassa de juta e sua conversão em monômeros de açúcar usando ácido líquido iônico

Aprenda o procedimento de vigilância do Lyssavirus em morcegos de Taiwan usando testes de anticorpos fluorescentes e RT-PCR. Este protocolo padronizado auxilia pesquisadores em doenças zoonóticas.

Procedimento de funcionamento padrão para a vigilância do Lyssavirus da população do bastão em Formosa

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