Name: Avaliação do Risco e Prevalência de Câncer Colorretal por Detecção de Integridade do DNA das fezes (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-08T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Aprenda a detectar lesões neoplásicas colorretais de forma não invasiva usando o kit FL-DNA. Este método melhora a precisão dos exames de rastreamento existentes e aumenta a adesão dos pacientes.

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Os autores não têm reconhecimentos.

Os pacientes foram recrutados no Istituto Scientifico Romagnolo por lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) de Meldola (FC, Itália) entre 2013 e 2015. Os pacientes inscritos estavam no protocolo IRSTB002, aprovado pelo Comitê de Ética do IRST - IRCCS AVR (25/10/2012, ver. 1). Todos os métodos foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos pertinentes. O consentimento informado por escrito foi obtido de todos os pacientes.
1. Extração de DNA de fezes
<ol><li>Use um kit para preparar amostras de fezes (ver Tabela de Materiais). Selecione e trate o material fecal realizando a extração de acordo com as instruções do fabricante. Amplie o DNA purificado diretamente ou armazene a -20 °C para análise posterior.</li>
</ol>2. Preparação de controle positivo, padrões, DNA de pico e amostras clínicas
<ol><li>Elaboração de normas e amostras<ol>
<li>Para preparar o controle positivo, padrões, DNA de pico e todas as amostras clínicas, centrífugue uma alíquota de controle positivo, padrões e DNA de pico, em seguida, resuspend cada reagente adicionando a quantidade correta de água fornecida (veja abaixo). Então, cuidadosamente vórtice o controle positivo, padrão, e pico-in DNA, em seguida, centrífuga para 10 s. Para obter uma ressuspensão completa dos reagentes secos, armazene os reagentes líquidos à temperatura ambiente (RT) por 30 minutos antes do uso.<ol>
<li>O controle positivo é o DNA humano em um formato seco. Resuspenque cada alíquota com 750 μL de água.</li>
			<li>O DNA de espigão é o DNA do salmão(Oncorhynchus keta),que é usado como um controle interno exógeno para verificar a possível presença de inibidores em amostras de DNA extraídas de fezes. Resuspenque cada alíquota com 100 μL de água.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Para preparar a curva padrão, produza quatro diluições de 1:5 a partir da solução de estoque. Os pontos padrão devem ser 10 ng/reação, 2 ng/reação, 0,4 ng/reação e 0,08 ng/reação.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparação do DNA de 1x<ol>
<li>Prepare o controle de DNA logo antes do uso.</li>
		<li>Prepare o controle de DNA de 1x spike-in misturando 5 μL de pico FL-DNa com 20 μL de água estéril. O número de amostras de controle de DNA de 1x será preparado de acordo com o número de amostras a serem analisadas, além do controle positivo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparação de amostras<ol>
<li>Misture 75 μL das amostras (amostras clínicas ou controle positivo) com 25 μL de DNA de 1x, produzindo um volume total de 100 μL.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Amplificação e determinação do valor FL-DNA utilizando qPCR Easy PGX
NOTA: Misturas completas de amplificação contendo primers e sondas específicas visando o DNA humano e o controle interno são fornecidas em formato liofilizado em 8 tiras de poço para FL-DNA Mix A e FL-DNA Mix B. Padrões, controles positivos e negativos, e as amostras devem ser amplificadas com ambas as misturas liofilizadas. As amostras clínicas só devem ser amplificadas em duplicata com ambas as misturas liofilizadas.
<ol><li>Consulte a Tabela de Materiais para instrumentos e software operacional qPCR.<ol>
<li>Abra o software operacional e configure a placa e o perfil térmico:<ol>
<li>Configure a placa como mostrado na Tabela 1.<ol>
<li>Defina o tipo de poço para todas as oito posições na coluna 1 como Padrão.</li>
				<li>Defina o tipo de poço para os poços A2 e B2 como NTC.</li>
				<li>Defina o tipo de poço para C2 e D2 (os controles positivos) como Desconhecido.</li>
				<li>Defina o tipo de poço para todas as outras posições como Desconhecido.
</li>
				<li>Selecione todas as 96 posições e adicione os Corantes FAM e HEX. Clique em Sincronizar placa.</li>
			</ol>
</li>
			<li>Defina o perfil térmico de acordo com a Tabela 2.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Centrifugar o número necessário de tiras para 10 s para trazer o conteúdo para o fundo do tubo.</li>
		<li>Remova suavemente as vedações das tiras, prestando atenção para reter o conteúdo e adicione às respectivas tiras: controle negativo: 20 μL de água; amostra: 20 μL de DNA; curva padrão: 20 μL de padrão 1, 2, 3 ou 4; controle positivo: 20 μL de controle positivo.</li>
		<li>Feche cuidadosamente todas as tiras usando as tampas ópticas planas de 8 tiras e vórtice por alguns segundos.</li>
		<li>Centrifugar as tiras por 10 s e carregá-las no instrumento. Então, comece a corrida.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Análise de dados
NOTA: A análise dos dados pode ser realizada automaticamente ou manualmente, dependendo do software (ver Tabela de Materiais).
<ol><li>No final da corrida, selecione as colunas A, C, E, G para "FAM: FL-DNA-A" e"HEX: IC", e colunas B, D, F, H para "FAM: FL-DNA-B" e"HEX: IC".</li>
	<li>Definir o seguinte para o Valor de Partida das Quantidades Padrão: 10 ng/reação para poços A1 e B1, 2 ng/reação para C1 e D1, 0,4 ng/reação para E1 e F1, e 0,08 ng/reação para G1 e H1.</li>
	<li>Definir valores de fluorescência limiar para 150 tanto para canais FAM (FL-DNA A e FL-DNA B) quanto HEX (IC).</li>
	<li>Na tabela de resultadosda caixa, clique em Opções de Coluna | Selecione Todos | Ok para obter os resultados em ambos os canais com seus respectivos valores Cq (⁄R) e R. NOTA: Esses valores são fornecidos pelo software de instrumento PCR em tempo real. ΔR corresponde ao valor de fluorescência normalizado ao último ciclo de amplificação.</li>
	<li>Na tabela de resultados da caixa, clique com o botão direito do mouse na tabela para abrir o menu de contexto e clique em Enviar para Excel para exportar os dados brutos.</li>
	<li>Verifique os valores das normas para verificar a adequação da curva padrão.</li>
	<li>Para cada mistura FL-DNA, verifique a coluna R2 ["R² (⁄R)" e eficiência ["Eficiência (%)" coluna] valores. Se estiverem em uma faixa aceitável, é possível prosseguir com a análise de acordo com as instruções do fabricante(Tabela 3).</li>
	<li>Se os resultados do canal FAM não estiverem na faixa esperada, omita um ponto da curva padrão e reanalise a corrida.</li>
	<li>Determinar os valores dos controles negativos e positivos com a seguinte fórmula, considerando os valores "No Cq" como zero: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59426/59426eq1.jpg"> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/59426/59426eq2.jpg">
</li>
	<li>Compare os valores obtidos com os informados na Tabela 4.</li>
	<li>Se os controles de reação estiverem na faixa de valores esperados, proceda com a análise das amostras. NOTA: Verifique se os valores do Cq obtidos são gerados a partir de uma reação de amplificação real (curva de fluorescência sigmoidal) e não de um artefato (curva de fluorescência linear).</li>
	<li>Para analisar a adequação da amostra para cada mistura FL-DNA, compare os valores de Cq do canal HEX. Se o valor for ≥16, proceda com a análise das amostras. Se o valor for &lt;16 ou não houver Cq, é provável que seja devido a um erro de dispensação do Pico DE DNA FL. Portanto, não é possível analisar as amostras.</li>
	<li>Calcule a média dos valores do Cq no canal "HEX" do controle positivo usando a seguinte fórmula: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/59426/59426eq3.jpg">
</li>
	<li>Calcule a média dos valores do Cq no canal "HEX" da amostra replica-se usando a seguinte fórmula: <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/59426/59426eq4.jpg">
</li>
	<li>Calcule os valores de CqHEX de acordo com a seguinte fórmula: <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/59426/59426eq5.jpg">
</li>
	<li>Compare os valores de CqHEX das amostras com os relatados na Tabela 5.</li>
	<li>Para cada mix (Mix A e Mix B), compare os valores de Cq do canal FAM com os relatados na Tabela 6.
</li>
	<li>Para determinar o valor FL-DNA de cada amostra adequada, utilize a seguinte fórmula, considerando os valores "No Cq" como zero: <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/59426/59426eq6.jpg"> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/59426/59426eq2.jpg"> NOTA: O risco e prevalência de câncer colorretal é uma função das avaliações do iFOBT e fl-DNA de acordo com os resultados do nomograma fagan obtidos por Rengucci et al.12 (Tabela 7).</li>
</ol>

<ol><li>Fearon, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Genetics+of+Colorectal+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Molecular Genetics of Colorectal Cancer.</a> Annual Review of Pathology. 6, 479-507 (2011).</li>
<li>Sears, C. L., Garrett, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbes%2C+Microbiota%2C+and+Colon+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+and+Microbe%22%5BJournal%5D)">Microbes, Microbiota, and Colon Cancer.</a> Cell Host and Microbe. 15, 317-328 (2014).</li>
<li>SEER Stat Fact Sheets: Colon and Rectum Cancer. National Cancer Institute. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://seer.cancer.gov/statfacts/html/colorect.html">http://seer.cancer.gov/statfacts/html/colorect.html</a> (2019).</li>
<li>Levin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+and+Surveillance+for+the+Early+Detection+of+Colorectal+Cancer+and+Adenomatous+Polyps%2C+2008%3A+A+Joint+Guideline+From+the+American+Cancer+Society%2C+the+US+Multi-Society+Task+Force+on+Colorectal+Cancer%2C+and+the+American+College+of+Radiology%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Screening and Surveillance for the Early Detection of Colorectal Cancer and Adenomatous Polyps, 2008: A Joint Guideline From the American Cancer Society, the US Multi-Society Task Force on Colorectal Cancer, and the American College of Radiology.</a> Gastroenterology. 134, 1570-1595 (2008).</li>
<li>Bosch, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+tests+for+colorectal+cancer+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Colorectal+Cancer%22%5BJournal%5D)">Molecular tests for colorectal cancer screening.</a> Clinical Colorectal Cancer. 10, 8-23 (2011).</li>
<li>Ahlquist, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+detection+of+colorectal+neoplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Molecular detection of colorectal neoplasia.</a> Gastroenterology. 138, 2127-2139 (2010).</li>
<li>Calistri, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fecal+multiple+molecular+tests+to+detect+colorectal+cancer+in+stool%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Fecal multiple molecular tests to detect colorectal cancer in stool.</a> Clinical Gastroenterology and Hepatology. 1, 377-383 (2003).</li>
<li>Calistri, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+colorectal+cancer+by+a+quantitative+fluorescence+determination+of+DNA+amplification+in+stool%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Detection of colorectal cancer by a quantitative fluorescence determination of DNA amplification in stool.</a> Neoplasia. 6, 536-540 (2004).</li>
<li>Calistri, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+fluorescence+determination+of+long-fragment+DNA+in+stool+as+a+marker+for+the+early+detection+of+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Oncology%22%5BJournal%5D)">Quantitative fluorescence determination of long-fragment DNA in stool as a marker for the early detection of colorectal cancer.</a> Cellular Oncology. 31, 11-17 (2009).</li>
<li>Calistri, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fecal+DNA+for+noninvasive+diagnosis+of+colorectal+cancer+in+immunochemical+fecal+occult+blood+test-positive+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Epidemiology+Biomarkers+and+Prevention%22%5BJournal%5D)">Fecal DNA for noninvasive diagnosis of colorectal cancer in immunochemical fecal occult blood test-positive individuals.</a> Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention. 19, 2647-2654 (2010).</li>
<li>De Maio, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+and+stool+nucleic+acid+analysis+for+colorectal+cancer+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Circulating and stool nucleic acid analysis for colorectal cancer diagnosis.</a> World Journal of Gastroenterology. 20, 957-967 (2014).</li>
<li>Rengucci, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+stool+DNA+integrity+method+for+early+colorectal+cancer+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Epidemiology+Biomarkers+and+Prevention%22%5BJournal%5D)">Improved stool DNA integrity method for early colorectal cancer diagnosis.</a> Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention. 23, 2553-2560 (2014).</li>
</ol>

Maura Menghi é funcionária em tempo integral da Diatech Pharmacogenetics srl.

Estudos anteriores demonstraram que a análise da integridade do DNA das fezes extraídas por abordagens manuais e semiautomáticas pode representar uma ferramenta alternativa para a detecção precoce das lesões colorretais7,,8,,9,,10,,11,,12. Testes de triagem molecular e não invasivo foram desenvolvidos ao longo dos anos para a...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/59426/evaluation-colorectal-cancer-risk-prevalence-stool-dna-integrity">Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection</a>. An&#160;affiliation&#160;was&#160;updated.
The first&#160;affiliation was updated from:
Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST)
to:
Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, Meldola, Italy

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/59426/evaluation-colorectal-cancer-risk-prevalence-stool-dna-integrity">Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection</a>. An&#160;affiliation&#160;was&#160;updated.

Erratum: Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection

O câncer colorretal (CRC) deriva de um processo de várias etapas em que o epitélio saudável lentamente se desenvolve em adenomas ou pólipos, que progridem em carcinomas malignos ao longo do tempo1,,2. Apesar da alta taxa de incidência do CRC, observou-se tendência de queda no percentual de óbitos na última década3. De fato, as ferramentas de diagnóstico precoce adotadas em programas de triagem levaram à detecção e remoção precoce de adenomas pré-neoplásicos ou pólipos4. No entanto, devido aos diferentes limites técnicos, nenhum desses métodos é o ideal. De fato, para melhorar a sensibilidade e a especificidade, muitos testes de DNA de fezes foram propostos sozinhos ou em combinação com os testes de diagnóstico de rotina atuais5,6.
Tipicamente, a mucosa saudável se lança nos colonos apoptóticos do fluxo fecal, enquanto a mucosa doente esfolia colonos não apoptóticos. Fragmentos de 200 bp ou mais de comprimento caracterizam DNA não apoptótico. Este DNA é chamado de DNA longo (L-DNA) e tornou-se um biomarcador utilizado para o diagnóstico precoce do CRC. O L-DNA pode ser isolado da amostra de fezes e quantificado por qPCR usando um kit de DNA FL-DNA in vitrodiagnóstico 7,8,9,,10,,11,12.
O teste consiste em dois ensaios para a detecção de fragmentos de DNA FL variando de 138 bp a 339 bp. Cada ensaio permite a amplificação do FL-DNA (FAM) bem como o DNA de spike-in (HEX). Para garantir a amplificação ideal de todos os fragmentos, o teste foi dividido em dois ensaios (chamados "A" e "B"). O ensaio A detecta duas regiões do exon 14 do gene APC (NM_001127511) e um fragmento de exon 7 do gene TP53 (NM_001276760). O ensaio B detecta um fragmento de exon 14 do gene APC (NM_001127511) e duas regiões dos gônons 5 e 8 do gene TP53 (NM_001276760). Os ensaios não distinguem entre as regiões detectadas. O DNA de pico corresponde ao DNA do salmão Oncorhynchus keta e permite verificar que o procedimento foi feito corretamente e verifica a possível presença de inibidores, o que pode produzir resultados falsos negativos. A concentração fl-DNA é avaliada por quantificação absoluta usando o método de curva padrão e é expressa como ng/reação.
O método FL-DNA é um teste de DNA de fezes não invasivo e barato que, combinado com o exame de sangue oculto fecal à base imunoquímica (iFOBT), é atualmente usado em programas de triagem de CRC e permite melhores previsões de LESÕES de Adenomas de CRC e/ou de alto risco12.

<table><tbody><tr><td>Tubos de polipropileno de 1,5 mL e 2 mL com trava de torção (livre de DNase, RNase, DNA, PCR sem inibidores)</td><td></td><td></td> <td>Consumíveis necessários para extração de DNA e PCR em tempo real</td></tr><tr><td>Etanol absoluto (qualidade do grau analítico)</td><td></td><td></td> <td>Reagente necessário para extração de DNA</td></tr><tr><td>Centrífuga de bancada</td><td></td><td></td><td>Velocidade máxima de 20000 x g. Instrumento necessário para extração de DNA</td></tr><tr><td>Software de análise EasyPGX versão 2.0.0</td><td>Diatech Pharmacogenetics</td><td>RT800-SW</td><td>Software de análise&nbsp;</td></tr><tr><td>Centrífuga/vórtice EasyPGX 8-well strips</td><td>Diatech Pharmacogenetics</td><td>RT803</td><td>Instrumento recomendado para o ensaio de PCR em tempo real</td></tr><tr><td>EasyPGX qPCR instrument 96&nbsp;</td><td>Diatech Pharmacogenetics</td><td>RT800-96</td><td>Instrumento recomendado para o ensaio de PCR em tempo real</td></tr><tr><td>EasyPGX pronto FL-DNA</td><td>Diatech Pharmacogenetics</td><td>RT029</td><td>Kit necessário para o ensaio de PCR em tempo real</td></tr><tr><td>Micropipetas (volumes de 1 a 1.000 &micro; L)</td><td></td><td></td><td>Consumíveis necessários para extração de DNA e PCR em tempo real</td></tr><tr>Luvas <td></td><td></td><td>descartáveis sem pó</td><td>Consumíveis necessários para extração de DNA e PCR em tempo real</td></tr><tr><td>QIAamp Fezes de DNA rápidas</td><td>Qiagen</td><td>51604</td><td>Kit recomendado para a extração e purificação de DNA de fezes</td></tr><tr><td>Pontas de filtro estéreis sem DNase, RNase (volumes de 1 a 1.000 &micro; L)</td><td></td><td></td> <td>Consumíveis necessários para extração de DNA e PCR em tempo real</td></tr><tr><td>Bloco térmico, por exemplo, bloco seco EasyPGX</td><td>Diatech Pharmacogenetics</td><td>RT801</td><td>Instrumento necessário para extração de DNA</td></tr><tr><td>Vórtice, por exemplo, centrífuga/vórtice EasyPGX 1,5 ml&nbsp;</td>Instrumento <td>RT802</td> da <td>Diatech Pharmacogenetics</td><td>necessário para extração de DNA</td></tr></tbody></table>

avaliação do risco e prevalência de câncer colorretal por detecção de integridade do dna das fezes

Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection

Hoje em dia, o DNA das fezes pode ser isolado e analisado por vários métodos. Os longos fragmentos de DNA nas fezes podem ser detectados por um ensaio qPCR, que fornece uma probabilidade confiável da presença de lesões colorretais pré-neoplásicas ou neoplásicas. Este método, chamado DNA longo fluorescência (FL-DNA), é um procedimento rápido e não invasivo que é uma melhoria no sistema de prevenção primário. Este método baseia-se na avaliação da integridade do DNA fecal por amplificação quantitativa de alvos específicos do DNA genômico. Em particular, a avaliação de fragmentos de DNA com mais de 200 bp permite a detecção de pacientes com lesões colorretais com especificidade muito alta. No entanto, este sistema e todos os testes de DNA de fezes disponíveis atualmente apresentam algumas questões gerais que precisam ser abordadas (por exemplo, a frequência em que os testes devem ser realizados e o número ideal de amostras de fezes coletadas em cada ponto de tempo para cada indivíduo). No entanto, a principal vantagem do FL-DNA é a possibilidade de usá-lo em associação com um teste atualmente utilizado no programa de triagem de CRC, conhecido como o exame de sangue oculto fecal à base imunoquímica (iFOBT). De fato, ambos os testes podem ser realizados na mesma amostra, reduzindo custos e obtendo uma melhor previsão da eventual presença de lesões colorretais.

O fluxo de trabalho deste protocolo é mostrado na Figura 1. O fluxo de trabalho fornece duas etapas de controle e ações diferentes de acordo com os resultados desta etapa. Em primeiro lugar, se uma amostra apresenta controles inadequados, a amplificação deve ser repetida. Em segundo lugar, se a amplificação for inibida, a amostra deve ser reprocessada desde o início ou classificada como não valiosa.
A Figura 2 mostra as curvas de fluorescência produzidas por a...

O kit de DNA de DIAGNÓSTICO apresentado é um método de economia de tempo e fácil de usar para determinar a probabilidade confiável da presença de lesões de câncer colorretal.

Avaliação do Risco e Prevalência de Câncer Colorretal por Detecção de Integridade do DNA das fezes

Nowadays, stool DNA can be isolated and analyzed by several methods. The long fragments of DNA in stool can be detected by a qPCR assay, which provides a ...

Este método permite detectar, por uma abordagem não invasiva, paciente com lesão neoplásica colorretal. Em particular, este teste permite, em associação com os testes atualmente utilizados no programa de rastreamento de câncer colorretal, prever melhor a presença de câncer ou maior risco de lesões anormais. Para iniciar este protocolo, centrifugar uma alíquota de cada controle positivo, DNAs padrão e DNA spike-in, em um formato seco por 10 segundos em uma mini centrífuga.Resuspene o controle positivo com 750 microliters de água. Resuspend o DNA de espigão, usado como controle interno exógeno, para testar a presença de inibidores, com 100 microlitres de água. Para a curva padrão, resuspenque o padrão seco com 100 microliters de água e faça quatro diluições de 1:5 a partir da solução de estoque.Em seguida, cuidadosamente vórtice os reagentes por 15 segundos, e centrífuga em uma mini centrífuga por 10 segundos. Para uma ressuspensão completa, armazene os reagentes líquidos à temperatura ambiente por 30 minutos antes de usar. Para preparar o controle de DNA de 1x, misture cinco microliters de pico de DNA FL com 45 microliters de água estéril.Para as amostras, misture 75 microlitadores de cada amostra com 50 microliters de 1x de DNA, produzindo um volume total de 125 microliters. Primeiro, abra o software operacional qPCR. Para configurar a placa, defina o Tipo de Poço para todas as oito posições na coluna um, como Padrão.Defina o Tipo de Poço para os poços A2 e B2 como NTC. Defina o Tipo de Poço para os controles positivos, C2 e D2, como Desconhecido. E definir o Tipo de Poço para todas as outras posições como Desconhecido.Selecione todas as 96 posições. Adicione os corantes, FAM e HEX e clique em Placa de Sincronização. Em seguida, defina o Perfil Térmico, conforme fornecido.Prepare o número desejado de tiras de 8 poços contendo misturas de amplificação totalmente liofilizadas, com primers e sondas específicas visando o DNA humano, e o controle interno. Para levar o conteúdo para o fundo dos tubos, centrifugar as tiras por 10 segundos. Remova suavemente as vedações das tiras, certificando-se de não perder nenhuma pelota.Em seguida, adicione 25 microliters de água aos poços de controle negativos. 25 microliters de DNA amostral para amostra de poços e 25 microliters de DNA de controle positivo para os poços de controle positivo. Para a curva padrão, adicione 25 microliters de padrão 1, 2, 3 e 4 em cada poço dedicado.Use tampas ópticas planas de 8 tiras para fechar cuidadosamente todas as tiras e vórtices por alguns segundos. Centrifugar as tiras por 10 segundos, carregá-las no instrumento e iniciar a corrida. No final da corrida, para FAM FL-DNA A e HEX IC, selecione colunas, A, C, E e G.Para FAM FL-DNA B e HEX IC, selecione colunas, B, D, F e H.Para as quantidades padrão de início, defina 10 nanogramas por reação para poços A1 e B1, dois nanogramas por reação para C1 e D1, ponto quatro nanogramas por reação para E1 e F1 , ponto zero oito nanogramas por reação para G1 e H1. Em seguida, tanto para os canais FAM quanto HEX, definir os valores de fluorescência limiar para 150.Na tabela de resultados da caixa, clique em Opções de Coluna, então, Selecione Tudo e, em seguida, Ok, para obter os resultados em ambos os canais com seus respectivos valores de Cq e delta R, que são fornecidos pelo software de instrumento qPCR em tempo real. O Delta R corresponde ao valor de fluorescência normalizado ao último ciclo de amplificação. Na tabela de resultados da caixa, clique com o botão direito do mouse na tabela para abrir o menu de contexto.Clique em Enviar para Excel para exportar os dados brutos. E, em seguida, carregar o arquivo Excel no software de análise dedicado para cálculo automatizado da quantidade DE DNA FL. A partir da combinação de valores iFOBT e FL-DNA estimam para cada paciente, o risco de câncer colorretal.Curvas de fluorescência de uma amostra positiva adequada mostram o sinal amostral no canal HEX, que é o controle interno, dentro da faixa aceitável. O sinal positivo está acima do limiar no canal FAM, que mostra a amplificação dos genes alvo. As curvas de fluorescência de uma amostra negativa adequada mostram o sinal amostral dentro da faixa aceitável no canal HEX.O sinal de controle negativo está abaixo do limiar no canal FAM. Por outro lado, as curvas de uma amostra não adequada mostram o sinal de amostra que não está dentro do intervalo aceitável no canal HEX. Provavelmente devido a uma possível inibição.Portanto, esta amostra deve ser repetida, a partir da extração. A tabela de saída de análise de software mostra dados tanto para o Mix A quanto para o Mix B em termos de concentração de DNA FL para controles de reação, amostras clínicas e resultados de controle de qualidade de execução. A amostra número quatro não tem resultados porque não passou pelo controle de qualidade.Deve ser repetido e reanalisado. Por favor, tenha cuidado quando resuspended o DNA para spike-in no controle para a curva padrão. E ao distribuir diferentes DNAs para tiras de 8 poços, bem como durante a detecção molecular na seção de análise de resultados.Este método deve ser realizado em combinação com o teste iFOBT para permitir uma melhor avaliação das lesões neoplásicas colorretais, devendo ser realizado com a mesma amostra fecal.

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Expressão reduzida / ausente de PMS2 e / ou ERCC1 em criptas inteiro é um evento freqüente dentro de 10 centímetros em cada lado do adenocarcinomas do cólon, provavelmente a base de um defeito de campo com alta mutabilidade ea progressão para o câncer. Deficiência em Ku86 ou CCOI é muito menos freqüente nesses defeitos de campo.

PMS2 deficiente, ERCC1, Ku86, CCOI Defeitos em campo durante a progressão para cancro do cólon

Nós descrevemos um procedimento para a desagregação de câncer colorretal (CRC) para produzir células viáveis ​​única, que são, então, capturado em microarrays de anticorpos personalizado reconhecer antígenos de superfície (CRC DotScan microarray). Sub-populações de células vinculada ao microarray pode ser perfilado por multiplexação de fluorescência usando anticorpos monoclonais marcados com corantes fluorescentes.

Câncer Colorretal Profiling proteína de superfície celular Usando um Microarray de anticorpos e Multiplexação de fluorescência

Este vídeo descreve o protocolo de isolamento de DNA de amostras de fezes de camundongos portadores de tumor de cólon. O DNA extraído é amplificado usando PCR e o produto é posteriormente limpo usando uma abordagem baseada em esferas magnéticas. Este método pode ser usado para determinar o efeito do enriquecimento ambiental na microbiota do cólon e na mortalidade animal.

Isolamento de DNA microbiano de fezes: estudando o efeito do enriquecimento ambiental na diversidade do microbioma em modelo de tumor murino

Relatamos melhorias significativas para a medição reprodutível de mutações somáticas de células-tronco colônicas após a exposição de camundongos a potenciais agentes prejudiciais ao DNA.

Quantificação de mutações de células-tronco do cólon

Um método para analisar a integridade do DNA na fração sobrenadante livre de células de amostras de urina é proposto. O método é adequado para a detecção precoce de neoplasias urológicas e provou ser preciso para o diagnóstico precoce do câncer de bexiga.

Análise integridade do DNA de células-Free em amostras de urina

Enriquecimento ambiental (EE) é um ambiente de alojamento dos animais que é usado para revelar os mecanismos que fundamentam as conexões entre o estilo de vida, estresse e doença. Este protocolo descreve um procedimento que utiliza um modelo do rato da tumorigênese cólon e EE para definir especificamente alterações na microbiota biodiversidade que pode afetar a mortalidade de animais.

Um método para definir os efeitos do enriquecimento ambiental sobre a biodiversidade de Microbiome cólon em um modelo de Tumor de cólon de Mouse

Digital cadeia da polimerase (PCR) é uma ferramenta útil para a detecção de alta sensibilidade de variantes de nucleotídeo único e as variantes números de cópia do DNA. Aqui, demonstramos considerações-chave para variantes raras no genoma humano usando PCR digital com o formato de microplaqueta-em-um-tubo de medição.

Ensaio de reação em cadeia de polimerase digital para a variação genética em paciente esporádicos polipose adenomatosa familiar usando o formato de microplaqueta-em-um-tubo

Apresentado aqui é um protocolo para descobrir os genes condutores superexpressos mantendo as células-tronco de câncer estabelecidas derivadas de células HT29 colorretais. RNAseq com bioinformática disponível foi realizado para investigar e tela redes de expressão genética para elucidar um mecanismo potencial envolvido na sobrevivência de células tumorais direcionadas.

Descoberta de genes driver em tumores de câncer derivados de HT29 derivados do câncer colorretal

Apresentamos um protocolo flexível para gerar metagenomas de fração de tamanho viral (viromes) de alta qualidade a partir de amostras de fezes humanas. Originalmente desenvolvido para virômica do solo, aqui esse protocolo foi aplicado com sucesso a amostras de fezes, permitindo uma caracterização robusta da virosfera intestinal humana.

Metagenômica da fração do tamanho viral do DNA para amostras de fezes humanas

Descrevemos o estabelecimento de tumores colorretais ortotópicos através da injeção de células tumorais ou organoides no ceco de camundongos e o subsequente isolamento de células tumorais circulantes (CTCs) deste modelo.

Isolamento de células tumorais circulantes em um modelo de rato ortotópico de câncer colorretal

Aprenda a detectar lesões neoplásicas colorretais de forma não invasiva usando o kit FL-DNA. Este método melhora a precisão dos exames de rastreamento existentes e aumenta a adesão dos pacientes.

Avaliação do Risco e Prevalência de Câncer Colorretal por Detecção de Integridade do DNA das fezes

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