Processamento de fluido de lavagem broncoalveolar e sangue pareado para macrófago alveolar e CD4+ T-Cell immunophenotyping e avaliação do reservatório de HIV

O HIV é incurável devido à sua persistência em reservatórios celulares e anatômicos. Este método permite uma avaliação do reservatório de HIV de células imunes isoladas dos pulmões. Esta técnica permite o isolamento de células T mucosas pulmonares e macrófagos alveolares do fluido BAL para uma avaliação fenotípica ou virológica como reservatórios celulares do HIV.

Compreender a biologia dos macrófagos alveolares e células T CD4 positivos e sua contribuição para o reservatório do HIV pode levar a importantes insights sobre os desafios enfrentados pela cura do HIV. O isolamento dos macrófagos primários da BAL pode ser aplicado em várias outras áreas de pesquisa, incluindo doenças pulmonares inflamatórias ou infecciosas, como asma e tuberculose. Depois de obter o fluido BAL de um paciente humano de acordo com os protocolos padrão, vórtice do fluido no tubo de coleta original antes de transferir a amostra para um tubo de 50 mililitros dentro de um armário de biossegurança.

Se o fluido parecer muito turvo ou contaminado por tecido filamentoso, filtre a amostra através de um filtro de malha de nylon de 70 micrômetros em um novo tubo de 50 mililitros. Após a centrifugação, transfira o supernante para um novo tubo de 50 mililitros e use uma ponta de pipeta para quebrar suavemente a pelota contendo as células bal inteiras. Resuspenja a pelota em um mililitro de RPMI 1640 médio e adicione um mililitro do supernatante reservado de cada um dos 10 tubos de microcentrifuuge de 1,5 mililitro.

Adicione alíquotas de 10 mililitros do supernatante restante em tubos cônicos de 15 mililitros e coloque todas as amostras supernacas no armazenamento de menos 80 graus Celsius. Diluir a suspensão da célula de pelotização em 10 mililitros de meio para cada 25 mililitros de amostra original e coletar as células BAL por centrifugação. Em seguida, resuspende a pelota em um mililitro de médio suplementado com soro bovino 10% fetal, ou FBS, para contagem.

Para a triagem de células mononucleares de sangue inteiros e periféricos, adicione cinco vezes 10 às cinco células a cada um dos dois tubos de poliestireno de fundo redondo de cinco mililitros por subconjunto para os controles de compensação não manchados e manchados de viabilidade e adicione o resto de cada amostra subconjunta em um tubo de cinco mililitros por amostra. Colete as células por centrifugação e resuspenja as pelotas de controle em 100 microliters de PBS por tubo no gelo até que sejam usadas. Resuspenja as pelotas das células para classificação em 250 microliters de uma em 20 diluição do tampão de bloqueio do receptor Fc por uma hora a quatro graus Celsius para bloquear qualquer ligação não específica.

No final da incubação de bloqueio, adicione o coquetel de anticorpos apropriado de interesse para uma incubação adicional de uma hora a quatro graus Celsius. No final da incubação primária de anticorpos, adicione um mililitro de PBS a cada tubo para centrifugação e resuspenja as pelotas em 250 microliters de tampão de classificação no gelo protegidos da luz até a classificação. Para preparar os controles de compensação, adicione três gotas cada uma das contas de compensação anti-camundongos imunoglobulina kappa e as contas de compensação de controle negativo por um mililitro de PBS a um tubo de microcentrifuuge e transfira 100 microliters da solução de contas para cada amostra a ser usada para compensação.

Adicione um microliter de cada anticorpo no coquetel a cada tubo separado contendo contas e adicione um microliter de mancha de viabilidade a cada tubo de controle de compensação de manchas de viabilidade. Após 20 minutos a quatro graus Celsius protegidos da luz, lave as amostras com um mililitro de PBS por tubo e resuspenja as pelotas em 250 microliters de PBS fresco por tubo. Carregue a amostra de controle de células BAL inteiras no íctómetro de fluxo e configure a matriz de compensação.

Em seguida, carregue o tubo de amostra e classifique as células sob baixa pressão, gating para excluir ruído, para incluir células vivas e CD45 positivas, e para excluir os dobradores. Dentro da maior população mieloide, classifique as células CD206 e CD169 duplamente positivas como macrófagos alveolares. Dentro da população menor de linfócitos, isole as células CD3 positivas e classifique as populações cd4 e CD8 single-positive.

Para classificar a amostra de células mononucleares de sangue periférico, portão para excluir o ruído e dobras e incluir as células cd45-positivas ao vivo como demonstrado. Depois de gating em CD3, portal as células CD3-negativos, CD14-positivo para classificação dos monócitos single-positivos e portão das células CD3-positivo, CD4 e CD8 positivo para classificação de ambas as populações single-positivas. Ao contar a amostra de BAL inteiro, diferentes tipos de células podem ser visualizados, incluindo macrófagos maiores e redondos e linfócitos menores e redondos.

Macrófagos são o tipo celular mais abundante no fluido BAL, representando aproximadamente 85% das células em pulmões não fumantes. Essas células são enriquecidas em fumantes a ponto de parecerem quase exclusivas e tendem a ser aumentadas em cerca de 40% em comparação com os macrófagos observados em não fumantes. Os marcadores utilizados para a triagem de macrófagos alveolares de amostras de fluido BAL foram escolhidos com base em fenótipos descritos anteriormente de macrófagos alveolares, como o receptor de sisão CD206 que está presente em células fagocíticas e no receptor de sialoadhesina CD169.

Após seu isolamento, macrófagos alveolares e outros tipos de células podem ser usados para imunofenofoteping por citometria de fluxo, ensaios funcionais imunológicos ou quantificação de reservatório por PCR ultrasensível. Esta técnica proporciona acesso a macrófagos residentes em tecidos altamente puros, que historicamente têm sido difíceis de alcançar, permitindo o exame anteriormente inatingível da população de células imunes significativas.