Tecnologia CRISPR/Cas9 na restauração da expressão de distrofina em progenitores musculares derivados de iPSC

Duchenne é uma distrofia muscular que causa exaustão prematura de células progenitoras musculares. É uma das distrofias musculares mais severas. Para promover uma regeneração muscular funcional, usamos a edição de genes mediados pelo CRISPR/Cas9 para restaurar a expressão da distrofina em células progenitoras musculares derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas.

A edição do gene CRISPR-Cas9 tem o potencial de restaurar a expressão genética da distrofina. Células progenitoras musculares derivadas do iPSC podem repor o poro de células-tronco, reparar danos e evitar complicações adicionais no DMD sem causar uma resposta imune. Diferentes agentes das células iPS em células progenitoras miogênicas reduziram o risco de re-gênese tumoral em células iPS.

Várias terapias que combinam células progenitoras músculos pluripotentes pluripotentes auto-autólogos com correção genética mediada por CRISPR-Cas9 estão prometendo estratégias de tratamento de distrofia muscular de Duchenne. Essa tecnologia pode ser usada para tratar muitas doenças congênitas editando geneticamente células-tronco autólogas, incluindo doenças cardíacas, cerebrais e sanguíneas. Mostramos que a demonstração dessa abordagem pode proporcionar aos leitores experiência no manuseio de reprogramação celular e edição de genes, o que continua sendo um desafio.

Sob um microscópio invertido, examine as colônias de células-tronco embrionárias de camundongos infectados. Marque as colônias no fundo do prato com o marcador de objeto auto-inking. Aplique anéis de clonagem untadas para cobrir as colônias de células marcadas.

Adicione 100 microliters de 0,05% Trypsin-EDTA a cada anel de clonagem e coloque a placa em uma incubadora a 37 graus Celsius por cinco minutos. Em seguida, transfira as células digeridas com pontas de pipeta de 100 microliteres para placas de cultura de 48 poços contendo 250 mililitros de meio de crescimento MES. Incubar as células na incubadora 37 Graus Celsius com 5% de dióxido de carbono e 85% de umidade.

Quando lerem 70% de confluência, selecione os poços com células bem cultivadas e adicione 250 mililitros de solução TVP para digerir por 30 minutos. Em seguida, transfira a cultura celular de cada poço para um prato de seis centímetros. Repita a aplicação de anéis de clonagem e incubação por várias vezes até que clones uniformes em forma de dormitório sejam obtidos.

Agora, digerir os iPSCs do mouse preparados adicionando um mililitro de solução TVP. Transfira a cultura celular para uma placa de 24 poços revestida com Fibronectina e Gelatina e incubar a 37 graus Celsius com dióxido de carbono de 5%. Depois que as células atingirem 50% de confluência, mude para 500 microliters de meio de cultura fresca contendo oito microgramas por mililitro Polybrene.

Em seguida, adicione 100 microliters da solução de partícula lentiviral aos iPSCs do mouse. Incubar as células por três dias a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Em seguida, determine a concentração mínima de Blasticidin e Hygromiccin B que está em meia taxa de morte dentro de 24 horas.

Adicione a mídia de 2,5 microgramas por mililitro Blasticidin e 100 microgramas por mililitro Hygromycin B nas células, espere por três dias e selecione as células que permanecem aderentes como células infectadas por estada. Digerir os iPSCs de mouse selecionados com 0,5 mililitros de solução TVP, cada um bem em uma nova placa de 24 poços, e incubar células por 30 minutos a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Em seguida, pipeta os iPSCs em células únicas e conte as células com uma câmara de contagem de células.

Selecione cerca de 150 células únicas digeridas e dilua com mes médio em prato de 10 centímetros, cultura a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Após cerca de 10 dias, sob um microscópio invertido, use 10 dicas de pipeta estéril microliter para escolher colônias únicas e transferir cada colônia para 50 microlitros de solução TVP em uma placa de 96 poços. Digerir a 37 graus Celsius por 30 minutos.

A clonagem manual confiável é fundamental para o sucesso da colheita de células-tronco pluripotentes induzidas pelo CRISPR/Cas9. Em seguida, transfira e divida as células digeridas de cada poço em outras duas placas de cultura de 96 poços. Incubar a 37 graus Celsius até 70% confluente.

Com as colônias de células com 70% de confluência, remova o meio na placa de 96 poços. Adicione 25 microliters de reagente Lysis contendo 1% de solução Proteinase K para cada poço e transfira o lysate para outra placa PCR de 96 poços. Sele a placa PCR com vedações adesivas e incubar a placa em um cicloviário térmico a 55 graus Celsius por 30 minutos e, em seguida, a 95 graus Celsius por 45 minutos para lise as células e desnaturar o Proteinase K.Então, em um tubo PCR, adicione dois microliters do lysate, 10 microliters de 2x DNA Polymerase Premix, 7 microliters de água livre de DNase , e um microliter de primers DMD Exon23.

Inicie a reação do PCR de acordo com o manuscrito. Em seguida, carregue a reação do PCR fornecida com 2,2 microliters de tampão de carga em um gel de 2%agarose. Execute o gel a 100 a 150 volts por 30 minutos e inspecione o gel sob luz UV.

Neste protocolo, dois guias RNAs que flanqueiam o mutante Exon23 foram projetados. Depois de quebras duplas mediadas por Cas9 e finalização não homólogo, o mutante Exon23 foi excluído, permitindo a produção truncada, mas funcional de Distrofina. Para evitar o vazamento da solução Trypsin, precisamos aplicar graxa uniformemente na parte inferior dos anéis.

A combinação de edição de genomas CRISPR/Cas9 com um sistema de ativação myoD afixado fornece uma estratégia segura, viável e eficaz para transplante autólogo em pacientes com distrofia muscular de Duchenne com células progenitoras basais de recuperação genética.