Name: Ensaios de explosão oxidativa desencadeada por padrão e inibição do crescimento de plântulas em Arabidopsis Arabidopsis thaliana (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-21T13:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 11 s
Description: Aprenda ensaios de explosão oxidativa e inibição do crescimento de plântulas em Arabidopsis thaliana para avaliar respostas imunes. Estes métodos rápidos e confiáveis permitem comparar genótipos vegetais.

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O trabalho em nosso laboratório é financiado através do programa de descoberta de recursos naturais e engenharia de pesquisa do Canadá (NSERC), a Fundação Canadense para a inovação John R. Evans Leader ' s Fund, e da Queen ' s University. KS e é são apoiados por tandem Ontario bolsas de pós-graduação e NSERC Canadá bolsas de pós-graduação para estudantes de mestrado (CGS-M).

1. detecção de ROS estourou em discos de folhas de Arabidopsis após Elicitação imunológica
<ol><li>Crescimento e manutenção de plantas.<ol>
<li>Para sincronizar a germinação, estratifique as sementes de Arabidopsis suspendendo aproximadamente 50 sementes em 1 ml de agar estéril 0,1% [w/v] e armazene a 4 ° c (sem luz) por 3-4 dias. Nota: estratifique um controle de fundo de tipo selvagem (por exemplo, Col-0) e genótipos com saídas imunes altas e baixas (por exemplo, cpk28-1 e bak1-5, respectivamente) para servir como controles internos.</li>
		<li>Semear sementes no solo e germinar padrão de curto-dia condições (22 ° c, 10 h luz, 150 mE/m2/s intensidade de luz, e 65-70% umidade relativa).</li>
		<li>Após aproximadamente 7 dias, use fórceps para transplantar seedlings individuais aos potenciômetros novos, separados por pelo menos 4 cm para permitir o desenvolvimento cheio da roseta. Transplante 6-12 mudas por genótipo e retorno às condições padrão de curto-dia. Regularmente água e fertilizar plantas (1 g/L de 20-20-20 fertilizante a cada 2 semanas).</li>
	</ol></li>
	<li>Colete discos foliares em placas 96-well para a recuperação durante a noite.<ol>
<li>Em 4-5 semanas após a germinação (Figura 1a), use um perfurador afiado da biópsia de 4 milímetros para remover um disco da folha por a planta, evitando a meados de-veia e sendo cuidadoso limitar o ferimento (Figura 1b). Coloque os discos foliares em uma placa de luminômetro 96-well não utilizada contendo 100 μL de ddH2o com o lado adaxial voltado para cima para evitar a dessecação22 (Figura 1C). Se a avaliação de vários elicitors, remover 1 folha de disco da mesma folha para cada tratamento elicitores. Nota: folhas de amostra que são totalmente expandidas, terceira a quinta da parte superior da roseta, e aproximadamente o mesmo tamanho e idade para limitar a variabilidade. Se possível, corte discos de folhas ao meio usando uma lâmina de barbear antes da recuperação durante a noite, pois isso aumenta a área de superfície exposta à solução de elicitores23.</li>
		<li>Recupere durante a noite na temperatura ambiente para evitar a interferência de ROS produzidos por ferimento durante a coleta de discos foliares. Cubra as placas com uma tampa para evitar a evaporação.</li>
	</ol></li>
	<li>Realize o tratamento de elicitores e meça a produção de ROS.<ol>
<li>Programe o leitor de placas antes de adicionar a solução de reação, pois isso reduzirá o tempo entre o início do burst de ROS e as primeiras medições gravadas. Use um software comercial que seja apropriado para o leitor da placa. No nosso caso (consulte o Sumário), clique em configuraçõese selecione o cartucho LUM96 e o tipo de leitura cinética . Clique na categoria área de leitura e arraste para selecionar um subconjunto de poços ou a chapa inteira a ser lida. a aba do Pmt e do sistema ótico , ajuste o tempo da integração a 1.000 MS. na guia timing , defina o tempo de execução total para 40-60 min e o intervalo para 2 min.</li>
		<li>Retire a água de cada poço usando uma pipeta multicanal. Nota: Não perfure discos foliares, pois isso pode provocar tensões de ferimento e resultar em saídas de ROS mais variáveis.</li>
		<li>Prepare uma solução de reacção contendo 100 μM de luminol, 10 μg/mL de HRP, e a concentração desejada de elicitores (por exemplo: elf18 a 1 nM, 10 nM, 100 nM ou 1.000 nM) em ddH2o estéril utilizando 10 ml de solução para placa de 1 96 poços. Nota: dissolva peptídeos liofilizados em H estéril2o em tubos de baixa ligação para fazer um estoque de 10 mm, Flash-Freeze no líquido N2, e armazene em-80 ° c. Quando estiver pronto para usar, diluir estoques em H2o estéril para gerar um estoque de trabalho de 100 μm e armazenar a-20 ° c.</li>
		<li>Utilize uma pipeta multicanal para dispensar 100 μL da mistura de reacção a cada poço, acrescentando a solução a todos os discos foliares do mesmo tratamento ao mesmo tempo22. Inclua uma reação de controle (sem elicitor) para cada genótipo para avaliar os níveis basais de ROS na ausência de Elicitação. Meça imediatamente a emissão clara para todos os comprimentos de onda no espectro visível usando um leitor do microplate. Nota: Prepare e aplique a solução de reacção pouca luz, pois luminol e HRP são reagentes sensíveis à luz. Manter os reagentes no gelo ou a-20 ° c, excepto em utilização.</li>
		<li>Meça a emissão clara com um tempo da integração de 1.000 MS em intervalos de 2 minutos durante um período de 40-60 minutos em um leitor da microplaca a fim capturar o estouro oxidativo dinâmico (Figura 1D). Nota: Use um tempo de integração mais longo para melhorar a sensibilidade do ensaio11, ao assegurar-se de que todas as amostras em uma placa 96-well possam ser medidas dentro de um intervalo.</li>
	</ol></li>
	<li>Interpretação de dados.<ol>
<li>Para cada genótipo, use um aplicativo de planilha para calcular a contagem média de fótons e o erro padrão em cada ponto de tempo e exiba a produção de ROS em função do tempo usando um gráfico de dispersão. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59437/59437eq1.jpg"> Onde t = cada ponto de tempo
</li>
		<li>Alternativamente, somar as contagens de fótons para cada disco de folha e apresentar a média desses valores para cada genótipo usando um gráfico de barras com barra de erro padrão ou uma caixa e plotagem de Whisker. <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/59437/59437eq2.jpg">
</li>
	</ol></li>
</ol>2. ensaio de inibição do crescimento de plântulas
<ol><li>Esterilizar sementes e semear em placas de Murashige e Skoog (MS).<ol>
<li>Prepare meio estéril de meia-força (0,5 x) MS (2,16 g/L) contendo 0,8% de agar [w/v]. Despeje a mídia em placas (90 x 15 mm) em uma capa de fluxo laminar.</li>
		<li>Esterilizar aproximadamente 100 sementes em um tubo de microcentrífuga por lavagem com 1 mL de etanol a 70% por 2 min e remover por aspiração. Adicionar 1 mL de 40% lixívia e suavemente rocha por 17 minutos à temperatura ambiente. Remova a lixívia por aspiração e lave três vezes em 1 mL de água estéril durante 5 min. ressuscitem em 1 mL de agar estéril de 0,1%. Nota: Alternativamente, use um protocolo de esterilização de sementes de gás cloro24.</li>
		<li>Semeie aproximadamente 100 sementes por o genótipo em placas do ágar do MS usando uma pipeta e um selo com fita do micropore em uma capa do fluxo laminar. Nota: Evite colocar sementes em estreita proximidade, pois isso tornará as mudas de transplante difíceis mais tarde.</li>
		<li>Estratifique as sementes colocando as placas a 4 ° c (sem luz) durante 3-4 dias para sincronizar a germinação (Figura 2a).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transplante de mudas em 48-well placas contendo peptídeos imunológicos elicitores.<ol>
<li>Após a estratificação, mova as placas para a luz em condições de dia curto (22 ° c, 10 h de luz, 150 mE/m2/s de intensidade de luz e 65-70% de umidade relativa) para 3-4 dias para permitir a germinação.</li>
		<li>Em uma capa de fluxo laminar, prepare diluições de peptídeo de elicitores (0 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM e 1.000 nM) em meios líquidos estéreis de 0,5 x MS contendo 1% de sacarose [w/v], usando 25 mL de MS para cada placa de 48 poços. Prepare as placas pipetando 500 μL de meio líquido MS ou meio MS contendo peptídeos por poço. Se disponível, use um pipetador da repetição para a preparação da placa para agilizar o processo. Nota: para cada genótipo, cultivar mudas em MS sem elicitores para dar conta de quaisquer diferenças inerentes ao crescimento das mudas.</li>
		<li>Usando fórceps estéril cuidadosamente transplantar um seedling a cada poço do mesmo tamanho e idade, assegurando que não há nenhum dano à muda ou à ruptura à raiz e que a raiz está submersa nos meios. Para cada genótipo, transplantar um mínimo de 6-8 mudas em cada diluição peptídica (Figura 2b). Nota: mudas de transplante aos 4 dias após a germinação, pois as raízes curtas são mais fáceis de manipular, e as mudas mais velhas podem produzir resultados menos ideais.</li>
		<li>Sele as placas com fita do micropore e mova-se para trás à luz circunstâncias padrão do short-dia (22 ° c, luz de 10 h, 150 mim/m2/s intensidade de luz, e umidade relativa de 65-70%). Permitir que as mudas cresçam por 8-12 dias.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Determine a inibição do crescimento percentual.<ol>
<li>Retire cuidadosamente as mudas de 48-well placas e seque por dabbing na toalha de papel. Pesar mudas em uma escala analítica e valores de registro. Se disponível, use uma escala analítica equipada com saída USB para gravar valores de peso fresco em uma planilha. Antes de pesar as mudas, tire uma foto para exibir visualmente a inibição do crescimento (Figura 2C).</li>
		<li>Determine a inibição do crescimento percentual de mudas tratadas com elicitor em comparação com as mudas cultivadas apenas em MS (Figura 2D) da seguinte forma: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/59437/59437eq3.jpg">
</li>
		<li>Plotar dados usando um gráfico de barra com barras de erro padrão ou usando uma plotagem de caixa e Whisker para exibir melhor a variância inter-experimental.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Este trabalho descreve dois métodos para a avaliação de respostas imunes desencadeadas por padrão em Arabidopsis, oferecendo abordagens quantitativas para avaliar a produção imune sem o uso de equipamentos especializados. Em combinação, ROS e SGI acionados por padrão podem ser usados para avaliar respostas precoces e tardias à percepção de micródios, respectivamente.
A maior limitação do ensaio de explosão oxidativa é a variabilidade. Por razões que não são completamente compreendidas...

Para perceber e se defender contra patógenos, as plantas evoluíram com receptores de reconhecimento de padrões ligados à membrana (PRRs) que detectam moléculas microbianas conservadas fora da célula conhecida como padrões moleculares associados a micróbios (MAMPs)1. A ligação de mamps a seus PRRS cognato inicia a sinalização imune quinase-negociada proteína tendo por resultado a resistência de doença do largo-espectro2. Uma das primeiras respostas após a ativação do PRR é a fosforilação e a ativação de proteínas integrais de membrana plasmática respiratória BURST OXIDASE HOMOLOG (RBOH) que catalisam a produção de espécies reativas de oxigênio extracelular (ROS)3 , 4. Ros desempenham um papel importante no estabelecimento de resistência à doença, atuando tanto como mensageiros secundários para propagar a sinalização imune, bem como agentes antimicrobianos diretos5. A primeira observação de um surto oxidativo imune-eliciado foi descrita usando tubérculos de batata de CV. Rishiri após a inoculação de Phytophthora infestans 6. A produção de Eros foi avaliada em diversas espécies vegetais utilizando discos foliares7, culturas de suspensão celular8e protoplastos6. Descrito aqui é um método simples para a produção de ROS desencadeados por padrão em discos foliares de Arabidopsis Arabidopsis thaliana (Arabidopsis).
Como resposta à percepção MAMP, as proteínas ativadas de RbOH catalisam a produção de radicais de superóxido (o2-), radicais hidroxilo (• Oh) e oxigênio singlet (1o2) que são convertidos em peróxido de hidrogênio (H2o 2) no espaço extracelular9. H2o2 pode ser quantificado por quimioluminescência à base de luminol na presença do agente oxidante peroxidase de rábano (HRP)10. HRP oxida H2O2 gerando um íon hidróxido (Oh−) e gás de oxigênio (O2) que reagem com luminol para produzir um intermediário instável que libera um fóton de luz10. A emissão de fótons pode ser quantificada como unidades de luz relativa (RLUs) usando um leitor de microplacas ou Imager capaz de detectar luminescência, que se tornaram peças padrão de equipamentos na maioria dos laboratórios moleculares. Medindo a luz produzida sobre um intervalo de 40-60 minutos, um estouro oxidativo transiente pode ser detectado tão cedo quanto 2-5 minutos após o tratamento do elicitores, atingindo o pico em 10-20 minutos, e retornando aos níveis básicos após ~ 60 minutos11. A luz cumulativa produzida sobre este curso do tempo pode ser usada como uma medida da força imune que corresponde à ativação de proteínas de RBOH12. Convenientemente, este ensaio não exige o equipamento especializado ou a preparação incômoda da amostra.
Pico logo após a detecção da MAMP, a explosão oxidativa é considerada uma resposta imune precoce, juntamente com a ativação do MAPK e a produção de etileno5. As respostas imunes posteriores incluem reprogramação transcricional, fechamento estomático e deposição de calose2,5. A exposição prolongada aos MAMPs ativa continuamente a sinalização imune energeticamente dispendiosa, resultando na inibição do crescimento vegetal, indicativo de um trade-off entre o desenvolvimento e a imunidade13. A inibição do crescimento de plântulas desencadeada por padrão (SGI) é amplamente utilizada para avaliar a produção imune em Arabidopsis e tem sido parte integrante da identificação de vários componentes-chave da sinalização imune, incluindo PRRS 14,15 ,16. Conseqüentemente, este papel apresenta adicionalmente um ensaio para o SGI Pattern-desencadeado em Arabidopsis, por meio de que as plântulas são crescidas em placas do multi-poço que contêm meios ou meios padrão suplementados com um elicitores imune por 8-12 dias e pesaram então utilizando uma escala analítica.
Para demonstrar como os ensaios ROS e SGI podem ser usados para monitorar a sinalização mediada por PRR, três genótipos que representam diferentes saídas imunes foram escolhidos: (1) o tipo selvagem de adesão de Arabidopsis Columbia (Col-0), (2) o dominante-negativo bak1-5 mutante em que o coreceptor multi-funcional de PRR brassinosteroid insensivel 1-associado quinase 1 (BAK1) é não-funcional na sinalização imune17,18, e (3) o mutante cpk28-1 recessive, que não possui o proteínas reguladoras proteína quinase dependente de cálcio 28 (CPK28) e monitores intensificados respostas imunes-desencadeadas19,20. Os ensaios ROS e SGI são apresentados em resposta a um epítopo de peptídeo elf18 produzido sinteticamente de fator de alongamento bacteriano tu (EF-tu), reconhecido em Arabidopsis pelo receptor PRR EF-tu (EFR)15. Estes protocolos podem ser usados com outros indutores imunes tais como a proteína da motilidade bacteriana flagelina14 ou proteínas endógenas do elicitor da planta (atpeps)16, entretanto, deve-se notar que a responsividade da planta difere dependendo do elicitores21. Juntos, os ensaios ROS e SGI podem ser utilizados para a avaliação rápida e quantitativa das respostas mediadas pelo PRR precoce e tardia.

<table><tbody><tr><td>20-20-20 Fertilizante</td><td>Plant Prod</td><td>10529</td><td>Misture 1g/L em água e aplique nas plantas a cada 2 semanas para um crescimento ideal.</td></tr><tr><td>Punção de biópsia de 4 mm</td><td>Medical Mart</td><td>232-33-34-P</td><td>Um conjunto de brocas de cortiça com uma área de superfície de 0,125 cm^2 também pode ser usado.</td></tr><tr><td>Placas estéreis de 48 poços com tampa</td><td>Balança analítica Sigma-Aldrich</td><td>CLS3548</td><td></td></tr><tr><td>com suíte de tração</td><td>VWR</td><td>VWR-225AC</td><td>Qualquer balança analítica padrão pode ser usada para ensaios de inibição de crescimento, no entanto, uma saída direta de computador é ideal.</td></tr><tr><td>Pipeta Multicanal Mecânica BioHit mLine 12 (30-300 uL)</td><td>Sartorius</td><td>725240</td><td>Qualquer pipeta multicanal pode ser usada, assim como uma única pipetadora, se necessário.</td></tr><tr><td>elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG)</td><td>EZ Biolab</td><td>cp7211</td><td>Armazene 10 mM de peptídeo estoque a -80C em tubos de baixa ligação a proteínas. Quando descongelado, armazene 100 uM de estoque de giro a -20C.</td></tr><tr><td>Fórceps</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-327379</td><td></td></tr><tr><td>Peroxidase de Rábano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6782</td><td>Dissolver em água pura. Armazene a -20C e longe da luz.</td></tr><tr><td>Luminol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8511</td><td>dissolver em DMSO. Armazene a -20C e longe da luz.</td></tr><tr><td>Murisage e Skoog Basal Salts</td><td>Cedarlane Labs</td><td>MSP09-100LT</td><td>Loja a 4C.</td></tr><tr><td>Soil</td><td>SunGrow Horticulture</td><td>Sunshine Mix #1</td><td>Outros tipos de solo também podem ser usados para cultivar Arabidopsis. Misture com água ao encher panelas.</td></tr><tr><td>Leitor de microplacas multimodo SpectraMax Paradigm com módulo LUM</td><td>Dispositivos moleculares</td><td>Deve solicitar um orçamento</td><td>Qualquer leitor de placas capaz de detectar luminescência pode ser usado para esses ensaios.</td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389-1KG</td><td>Armazenar em temperatura ambiente.</td></tr><tr><td>Placas de Poliestireno Branco de 96 Poços</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-589</td><td></td></tr></tbody></table>

ensaios de explosão oxidativa desencadeada por padrão e inibição do crescimento de plântulas em arabidopsis arabidopsis thaliana

Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

As plantas evoluíram um sistema imunológico robusto para perceber patógenos e proteger contra a doença. Este papel descreve dois ensaios que podem ser usados para medir a força da ativação imune no Arabidopsis thaliana de Arabidopsis que segue o tratamento com moléculas do elicitores. Apresentado em primeiro lugar é um método para capturar o estouro oxidativo rápido-induzido e dinâmico, que pode ser monitorado usando um ensaio luminol-baseado. O segundo apresentado é um método que descreve como medir a inibição imune-induzida do crescimento de plântulas. Estes protocolos são rápidos e de confiança, não exigem o treinamento ou o equipamento especializado, e são amplamente utilizados compreender a base genética da imunidade da planta.

Mutantes cpk28-119,25 e bak1-517,18 plantas foram utilizadas para demonstrar os desfechos esperados para genótipos com respostas imunes altas e baixas, respectivamente, em burst oxidativo e SGI ensaios em relação a um controle de fundo de tipo selvagem (Col-0). Para avaliar os efeitos dose-dependentes, uma série de diluição do peptide 10-fold (1-1000 nanô...

Este trabalho descreve dois métodos para quantificar as respostas de defesa em Arabidopsis Arabidopsis thaliana após a exposição aos elicitors imunes: o estouro oxidativo transiente, e a inibição do crescimento de plântulas.

Ensaios de explosão oxidativa desencadeada por padrão e inibição do crescimento de plântulas em Arabidopsis Arabidopsis thaliana

Plants have evolved a robust immune system to perceive pathogens and protect against disease. This paper describes two assays that can be used to measure ...

Estes ensaios podem ser usados para avaliar e comparar saídas imunológicas de diferentes genótipos vegetais. A principal vantagem dessas técnicas é que elas são rápidas, confiáveis e usam equipamentos de laboratório comuns. Para o ensaio de inibição do crescimento, as mudas do mesmo tamanho e idade devem ser transplantadas e totalmente borradas secas antes de pesar para limitar a variação.Em quatro a cinco semanas após a germinação, use um soco de biópsia de quatro milímetros para remover um disco de folha por planta arabidopse, evitando a midveina e tomando cuidado para limitar a ferida. Colete os discos em poços individuais de uma placa luminômetro nãoutilada contendo 100 microliters de água duplamente destilada por poço, lado adaxial para cima, para evitar a dessecação. Se avaliar vários elicitors, remova um segundo disco de folha da mesma folha para cada tratamento elicitor e cubra a placa com a tampa para permitir que os discos da folha se recuperem durante a noite à temperatura ambiente.Na manhã seguinte, defina os parâmetros do leitor de microplapes para um tempo de integração de 1.000 milissegundos em intervalos de dois minutos durante um período de 40 a 60 minutos para capturar a explosão oxidativa dinâmica. Em seguida, use uma pipeta multicanal para substituir a água em cada poço por 100 microliters de solução de reação recém-preparada, incluindo um controle, nenhuma reação elicitor para cada genótipo para avaliar os níveis de espécies de oxigênio de reação basal na ausência de provocação. Em seguida, meça imediatamente a emissão de luz para todos os comprimentos de onda no espectro visível no leitor de microplaca.Aos quatro dias pós-germinação, carregue cada poço de uma placa de 48 poços com 500 microliters de MS médio suplementado com uma diluição de peptídeo elicitor. Em seguida, use fórceps estéreis para transplantar cuidadosamente seis a oito mudas do mesmo tamanho, idade e genótipo para cada diluição de peptídeos, tomando cuidado para que não haja danos à muda ou quebra da raiz e que a raiz esteja submersa em meio. Quando todas as mudas tiverem sido banhadas, sele as placas com fita micropora e coloque as plantas em condições padrão de curto-dia por oito a 12 dias.Para determinar a inibição percentual de crescimento, tire uma foto para registrar visualmente a inibição do crescimento antes de remover cuidadosamente as mudas de cada poço. Em seguida, descarar as raízes em uma toalha de papel para secar, e pesar cada muda em uma escala analítica. Neste experimento representativo, plantas mutantes com sinalização imune hiperativa demonstraram uma maior explosão oxidativa acumulada e média em comparação com plantas arabidopsis do tipo selvagem, enquanto plantas mutantes com sinalização imunológica prejudicada apresentaram uma explosão oxidativa reduzida em concentrações entre 10 e 1.000 nanomolar.Diferenças esperadas na inibição do crescimento das mudas também podem ser discernidas entre todos os genótipos cultivados em 100 e 1.000 concentrações de peptídeos nanomolares. Quando cultivados na diluição de peptídeos nanomolar de 1.000, os mutantes com sinalização imunológica hiperativa eram notavelmente menores do que as plantas do tipo selvagem cultivadas sob as mesmas condições, enquanto os mutantes com sinalização imunológica prejudicada exibiam uma fraca inibição do crescimento em relação às plantas do tipo selvagem. Esses métodos fornecem evidências de respostas imunes precoces e tardias.Várias outras técnicas, incluindo ensaios de quinase MAP, expressão genética induzida por patógenos e ensaios de infecção, podem ser usadas para delinear essas vias. Estas técnicas foram modificadas para uso em telas de grande escala, que identificaram com sucesso proteínas receptoras de patógenos e vários outros componentes de sinalização.

pattern-triggered-oxidative-burst-seedling-growth-inhibition-assays

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Uma célula de ensaio de morte com base em plantas para PTI Nicotiana benthamiana é descrito.

Ensaio para Pathogen-Associated Padrão Molecular (PAMP) Triggered-Imunidade (PTI) em Plantas

Uma busca fundamentais em biologia celular é definir os mecanismos subjacentes à identidade dos organelos que tornam as células eucarióticas. Aqui é proposto um método para identificar os genes responsáveis ​​pela integridade morfológica e funcional de organelas vegetais utilizando microscopia de fluorescência e as ferramentas a próxima geração de sequenciação.

Microscopia de fluorescência de Triagem e seqüenciamento da próxima geração: Ferramentas úteis para a identificação de genes envolvidos na integridade das Organelas

Source: Liu, X., et al. Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates a method to assess the bacterial load in Arabidopsis thaliana leaves infected with Pseudomonas syringae. Leaf discs from infected leaves are homogenized, serially diluted, and plated onto nutrient-rich agar to promote bacterial colony formation. Colony counts are then used to...

Assessing Pseudomonas syringae Infection Load in Arabidopsis thaliana Leaves

Este vídeo demonstra um ensaio para medir a explosão oxidativa em folhas de Arabidopsis após a elicitação imunológica. Os discos foliares, cortados das folhas das plantas, são incubados com peptídeos bacterianos que funcionam como padrões moleculares associados a micróbios ou MAMPs. Após a detecção dos MAMPs, as células vegetais induzem a produção de ROS extracelular, que é detectada usando um ensaio de quimioluminescência.

Um ensaio para detectar explosão oxidativa em discos de folhas de Arabidopsis após elicitação imune

Este vídeo demonstra o ensaio de inibição do crescimento de plântulas na planta Arabidopsis thaliana. O impacto do aumento da concentração de peptídeo imune elicitor no crescimento das mudas é determinado.

Medindo a inibição induzida imunologicamente do crescimento de mudas

A quantificação do crescimento de patógenos é uma ferramenta poderosa para caracterizar várias respostas imunes de Arabidopsis thaliana (doravante: Arabidopsis). O método descrito aqui apresenta um ensaio otimizado de infiltração de seringa para quantificar a Pseudomonas syringae pv. maculicola ES4326 crescimento em folhas adultas de Arabidopsis.

Bacteriana Folha Infiltração Ensaio para Belas Caracterização das respostas de defesa da planta usando o<em&gt; Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae</em&gt; Patossistema

O objetivo deste estudo foi determinar os efeitos da esterilização de água sanitária e cloro gás na germinação de sementes de uma gama de Arabidopsis genótipos cultivados na mídia estéril. Protocolos de esterilização otimizada foram desenvolvidos para impedir o crescimento de contaminantes microbianos, proporcionando a sobrevivência satisfatória da semente.

Método padronizado para a esterilização da elevado-produção de sementes de Arabidopsis

É fornecido um protocolo de alta produtividade para a esterilização superficial de sementes arabidopsisthaliana (Arabidopsis), otimizando as etapas de manuseio líquido com um simples dispositivo de sucção construído com uma bomba de vácuo. Centenas de amostras de sementes podem ser esterilizadas em um dia.

Método de alta produtividade, robusto e altamente flexível para esterilização superficial de sementes arabidopsis

Aqui, descrevemos uma ferramenta avançada projetada para o monitoramento da biossíntese de clorofila durante os estágios iniciais da desetiolação de plântulas de Arabidopsis . A nova metodologia fornece imagens não invasivas de fluorescência da clorofila em tempo real com alta resolução espacial e temporal.

Ensaio Não Invasivo para Determinação da Cinética de Biossíntese de Clorofila durante os Estágios Iniciais da Desetiolação de Arabidopsis

Aqui, apresentamos um método simples para observação direta e medida automatizada das respostas estomáticas à invasão bacteriana em Arabidopsis thaliana. Esse método utiliza um dispositivo portátil de imagem estomática, juntamente com um pipeline de análise de imagem projetado para imagens foliares capturadas pelo dispositivo.

Observação Direta e Mensuração Automatizada das Respostas Estomáticas a Pseudomonas syringae pv. tomate DC3000 em Arabidopsis thaliana

Esse protocolo descreve uma abordagem de alto rendimento para avaliar vazamento de íons da planta, atividade da peroxidase e produção de calosas na mesma amostra.

Avaliação das Respostas Foliares a Metabólitos Secundários Microbianos Usando um Formato de Alta Produção

Aprenda ensaios de explosão oxidativa e inibição do crescimento de plântulas em Arabidopsis thaliana para avaliar respostas imunes. Estes métodos rápidos e confiáveis permitem comparar genótipos vegetais.

Ensaios de explosão oxidativa desencadeada por padrão e inibição do crescimento de plântulas em Arabidopsis Arabidopsis thaliana (Vídeo) | JoVE Journal

Ensaios de explosão oxidativa desencadeada por padrão e inibição do crescimento de plântulas em Arabidopsis Arabidopsis thaliana

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