Estratégias não invasivas para manipulação crônica da atividade neuronal controlada por DREADD

DREADDs são a abordagem quimiógena mais popular para controle remoto da atividade neuronal. Aqui oferecemos novas alternativas para controle dreadd repetitivo ou crônico, com foco em métodos de entrega CNO menos invasivos. Descrevemos duas estratégias para a entrega prolongada de CNO em camundongos por colírios repetitivos, ou cronicamente através da água potável do animal.

Os protocolos descritos aqui são exemplos de opções crônicas e não invasivas para a entrega de CNO que podem ser adaptadas a uma variedade de desenhos experimentais, incluindo diferentes variantes dreadd, tecidos ou mesmo espécies. Uma questão fundamental para um parto de CNO é o estresse e a dor de um animal. Esses protocolos minimizam esse problema e são fáceis de executar e se adaptar a diferentes configurações experimentais.

Antes de realizar a cirurgia, limpe e esterilize o quadro estereotax e todos os instrumentos necessários. Quando o quadro estiver pronto, confirme a falta de resposta para beliscar o dedo do dedo em um rato macho tipo macho de fundo misto anestesiado, raspar a parte superior da cabeça e fixar a cabeça do mouse no quadro. Em seguida, aplique lubrificante protetor ocular nos olhos e, finalmente, limpe a pele exposta com iodo povidone sequencial e esfoliantes de 70% de etanol.

Use um bisturi estéril para expor o crânio e calibrar a estrutura até o ponto de bregma. Perfurar em uma coordenada mediallateral de 2,9 milímetros, e uma coordenada posterior anterior de menos 2,7 milímetros para atingir o hipocampo. Quando o cérebro for exposto, use um micro injetor e puxe pipetas microcapilares para injetar unilateralmente 90 nanoliters do vírus adenoassociado no hipocampo a uma profundidade ventral dorsal de menos três milímetros.

Em seguida, feche a incisão com suturas de nylon, e remova o animal da moldura para administração de analgesia. Para a entrega repetitiva de CNO, a partir de quatro semanas após a injeção, aclimatar os animais ao manuseio, esmagando cada rato três minutos por dia durante três a quatro dias antes da administração dos colírios. Quando os camundongos se acostumarem com o manuseio, pese cada rato para determinar a quantidade apropriada de CNO a ser entregue para alcançar um miligrama de CNO por quilograma de concentração de peso corporal.

Duas horas antes de apagar as luzes durante a fase inativa, carregue de um a três microlitadores da solução CNO preparada em uma micropipette P10 e imobilize o mouse através de scruffing. Expela lentamente a solução até que uma gota estável se forme na ponta da pipeta e leve cuidadosamente a gota perto da córnea até que a solução seja entregue sem tocar na ponta da pipeta no olho do mouse. Em seguida, devolva o rato para sua gaiola doméstica antes de aplicar o colírio CNO aos olhos do próximo animal.

Nos casos em que o CNO precisa ser entregue durante a fase ativa do mouse, certifique-se da presença de uma luz vermelha fraca para o manuseio adequado de animais e a entrega de CNO. Para o tratamento crônico de CNO, começando quatro semanas após a injeção e três dias antes de iniciar o tratamento, substitua as garrafas de água regulares por garrafas pequenas paradas com bicos de borracha e cobertas com papel alumínio contendo 10 mililitros de água regular. Fixar nas gaiolas com fita adesiva para permitir que os ratos se aclimatar às garrafas.

Meça o consumo diário de água para cada rato e pese cada rato. Teste uma série de concentrações de CNO para determinar a dose que exibe a eficácia máxima com a concentração mínima de CNO. Em seguida, encha cada pequena garrafa com oito mililitros de água regular mais a quantidade necessária de CNO.

Para tratamento CNO restrito, começando quatro semanas após a injeção e três dias antes de iniciar o tratamento, coloque uma pequena garrafa contendo 10 mililitros de água mais 1% de sacarose na gaiola longe da garrafa de água original durante a última porção da fase ativa do animal. Ao final da exposição, remova a água mais as soluções de sacarose de cada gaiola e meça o consumo de água de sacarose para cada animal. Para entrega CNO, encha as garrafas com cinco mililitros de água mais 1% de sacarose e um miligrama por quilograma de CNO.

Coloque a garrafa na mesma posição do período de aclimatação da água açucarada durante a última porção da fase ativa, removendo as garrafas e medindo a quantidade de água, sacarose e CNO consumida conforme demonstrado. No final do experimento, colhia o cérebro animal tratado em fixação fresca. Após 9 a 12 horas, crioprotetor o tecido cerebral em uma solução de 30% de sacarose.

Quando o cérebro afundar, sele a amostra em um criostat. Quando todas as seções cerebrais tiverem sido obtidas e a ligação inespecífica bloqueada, incubar as amostras de tecido com uma solução de anticorpos anti-c-Fos a quatro graus Celsius durante a noite com agitação constante. Na manhã seguinte, lave as amostras com três lavagens de cinco minutos em PBS fresco por lavagem antes de incubar as amostras com um anticorpo secundário conjugado fluorescência apropriado.

Após uma hora em temperatura ambiente e agitação constante protegida da luz, obtenha imagens digitais das seções de tecido rotulados por microcroscopia confocal de fluorescência. Depois de carregar as imagens no ImageJ, delineie medir as áreas de células positivas infectadas por Adeno e quantificar o número de células C falsas positivas nesta região para obter o número de células ativadas por área. A entrega repetitiva de CNO usando colírios provoca uma indução robusta da expressão de cFos na maioria dos neurônios infectados demonstrando que a eficácia do parto de CNO é sustentada durante a exposição repetitiva.

Além disso, observa-se uma indução significativa de cFos em amostras coletadas duas horas após o tratamento com CNO em comparação com amostras obtidas seis horas após a exposição ao CNO, indicando que as alterações induzidas pelo CNO são dependentes do tempo. O consumo diário de água mais CNO não é significativamente diferente em relação ao volume total de água consumida regularmente. Da mesma forma, a quantidade de água mais 1% de sacarose consumida durante a noite não é afetada pela adição de CNO, nem diferenças no consumo diário de água mais CNO, e água mais sacarose mais CNO observada durante um período experimental de cinco dias.

Semelhante à aplicação de colírios CNO, uma indução robusta de cFos é observada após duas, mas não seis horas de acesso à água potável CNO. Além disso, há um claro limiar de eficácia para cNO, uma vez que uma dose CNO baixa não provoca ativação de cFos em comparação com um controle salino, enquanto doses mais altas induzem uma indução de cFos robusta e semelhante. Recomendamos a realização de uma análise de resposta de dose para definir a menor dose de CNO que não reduz significativamente a ativação neuronal, e considerando o uso de clozapina como um ligante.

Aqui demonstramos usando a indução de cFos mediada por CNO como resultado da ativação neuronal. No entanto, esses protocolos podem ser facilmente adotados para análise eletrofisiológica ou testes comportamentais. A tecnologia DREADD é uma poderosa ferramenta para controle remoto da atividade neuronal e projeta estratégias alternativas para a entrega de CNO.

Aumentaremos o espectro de opções para configurações experimentais e possíveis intervenções clínicas.