Usando óxido de utério como ferramenta não invasiva e não letal para avaliar composição corporal e consumo de água em mamíferos

Usando este protocolo, óxido de deutério, ou D2O, um isótopo nãoradiotivo e estável da água, pode ser usado para estimar a composição corporal e o consumo de água. Esta técnica não é invasiva e, portanto, pode ser usada para avaliar a composição corporal em espécies ameaçadas de extinção, bem como em seres humanos e espécies domésticas. Uma aplicação única da técnica de diluição de óxido de deutério é a capacidade de medir o consumo de água de animais selvagens de alcance livre com altas taxas de recaptura ou de animais socialmente alojados.

Embora a anestesia não seja necessária, pode ser mais fácil para aqueles que não estão familiarizados com a injeções subcutâneas sedarem os animais antes de entregar o óxido de deutério. Demonstrando o procedimento com Sarah Hooper e eu estarão Amanda Eshelman e Ashley Cowan, estudantes de veterinária, e Alicia Roistacher, uma estudante de pós-graduação do meu laboratório. Para fazer uma solução de estoque de 50 mililitros de nove gramas por litro de óxido de deutério saliado, primeiro pesar 450 miligramas de cloreto de sódio de grau farmacêutico, e registrar a quantidade exata em quatro locais decimais.

Transfira todo o sal para um béquer esterilizado de 100 mililitros e meça 50 gramas de óxido de óxido de 99,8% de deutério em um cilindro estéril e graduado. Registre a quantidade exata de óxido de deutério para quatro locais decimais, e transfira o óxido de deutério para o béquer estéril de cloreto de sódio. Em seguida, conecte uma agulha de 20 bitolas a um filtro de disco não estéril e não estéril com poros de submicron equipado com um barril de seringa de 10 mililitros, e insira a agulha no septo de um frasco estéril, vazio, de 100 mililitros.

Conecte um tubo de vácuo a uma agulha de calibre 22 e insira a agulha no septo do frasco de 100 mililitros. Em seguida, carregue 10 mililitros de cloreto de sódio de resistência isomótica no barril de seringa, e lentamente ligue o vácuo até que a solução de óxido de deutério comece a filtrar lentamente no frasco. Continue despejando a solução de estoque de óxido de deutério no barril de seringa até que todo o volume de 50 mililitros tenha sido filtrado.

Depois de confirmar a falta de resposta ao aperto do dedo do dedo em um morcego anestesiado, use uma almofada de preparação de álcool para limpar o uropatagium sobre a veia interfemoral, e permitir que a membrana da cauda desinfetada seque. Aplique uma fina camada de geleia de petróleo sobre a veia interfemoral, e use uma agulha de calibre 29 para perfurar a porção dorsal da veia interfemoral. Em seguida, use tubos capilares de heparina de sódio de plástico para coletar 100 microliters de sangue.

Para garantir uma mistura adequada de todo o sangue com a heparina de sódio, role suavemente cada tubo após a coleta de sangue antes de rotular. Depois de determinar a massa de óxido de deutério em gramas para injetar, carregue uma seringa de insulina equipada com uma agulha de calibre 29 com o volume apropriado de óxido de deutério. Pesar a seringa e agulha de insulina carregada de deutério, registrando o peso em quatro locais decimais, e injetar todo o volume de óxido de deutério subcutâneamente sobre a região dorsal do quadril do morcego anestesiado.

Recomendamos o uso de uma balança de precisão com um escudo de rascunho antiestático e para ter certeza de puxar para trás no êmbolo para garantir pressão negativa antes da injeção. Imediatamente após a injeção, pese a seringa de insulina e agulha agora vazias, e regise o peso em quatro casas decimais. Dentro de 30 minutos após a coleta de sangue, use uma centrífuga hematócrito para girar cada tubo capilar a 10.000 vezes g por cinco minutos.

Usando uma tesoura afiada, corte o tubo capilar de plástico entre todo o sangue e o plasma, e use uma pipeta de 200 microliter para expelir o plasma diretamente em um tubo de armazenamento rotulado de 500 microliter. Após o período de equilíbrio, colete e armazene outros 100 microliters de sangue da veia interfemoral como apenas demonstrado. Para análise de espectrofotometria FTIR, defina a temperatura de um banho de areia para 60 graus Celsius para facilitar a destilação, e adicione 50 microliters de cada amostra de plasma e padrão em tampas de microcentrifuge cônicas individuais de 1,5 mililitro.

Mantendo a tampa de microcentrifuge de cabeça para baixo, enrosque o tubo de microcentrifutura cônica de 1,5 mililitro na tampa e coloque o tubo invertido em contato com a areia no banho de areia por um mínimo de 12 horas. Na manhã seguinte, coloque uma nova tampa limpa em cada tubo, e pulso os tubos de microcentrifuuge por 10 segundos em um microcentrifuuge. Instale uma célula de transmissão líquida no espectrômetro FTIR e encha a célula com metanol.

Conecte a porta de injeção e encha lentamente a célula com água de fundo, removendo cuidadosamente a seringa de metanol para reduzir o risco de bolhas de ar. Anexar tubos à porta de saída para permitir a remoção das amostras após a análise e abrir o software do espectrômetro FTIR. Defina os parâmetros de acordo com a tabela e colete uma amostra de fundo usando a água diluída, filtrada de 0,22 micrômetros.

Injete 40 microliters de um padrão de óxido de uterium zero por milhão de óxido de deutério, e regissira e salve o espectro como um arquivo de valores separados por ímã. Depois de injetar e salvar os espectros de todos os padrões para criar uma curva padrão, injete 40 microliters de cada amostra destilada na célula de transmissão líquida e salve o espectro. Com um tempo de equilíbrio conhecido, a água total do corpo, a massa magra do corpo e a massa de gordura corporal para morcegos marrons grandes e grandes morcegos marrons podem ser determinados.

Uma massa de gordura corporal negativa pode ser calculada devido a uma ou mais das seguintes razões: não receber toda a dose de óxido de deutério, tornar-se toróide durante a fase de equilíbrio, ter massas de gordura anormalmente grandes e massas magras mínimas, ou ter menos de três a 5% de gordura corporal, conforme determinado pela absorptiometria de raios-X duplo. Aqui, mostra-se uma porcentagem representativa da gordura corporal determinada pela técnica de diluição do óxido de deutério em comparação com a absorptiometria de raios-X duplo. As duas técnicas estão bem correlacionadas, com a massa de gordura corporal mostrando fortes correlações entre a gordura corporal e o peso corporal e com a técnica de diluição de óxido de deuterium não consistentemente sobre ou subestimando a massa de gordura corporal.

O método de diluição de óxido de deutério foi previamente validado em gatos, e a técnica foi adaptada para permitir a medição do consumo diário de água de gatos socialmente alojados durante cada bloco dietético do experimento. Lembre-se que esta técnica deve ser realizada apenas em animais saudáveis e que você deve pesar, registrar e entregar com precisão a dose completa de óxido de deutério para cada animal. Um método secundário para determinar a composição corporal, como análise completa da carcaça ou DEXA, pode ser concluído para validar a técnica de óxido de deutério.

Essa técnica nos permitiu identificar um gato socialmente alojado que consumia quantidades anormalmente altas de água sem separar cada gato para medir seus consumos de água.