Name: Usando óxido de utério como ferramenta não invasiva e não letal para avaliar composição corporal e consumo de água em mamíferos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-20T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Aprenda a técnica de diluição com óxido de deutério para avaliar composição corporal e consumo de água em mamíferos. Este método não invasivo permite estudar espécies selvagens em perigo sem anestesia.

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Esta pesquisa foi apoiada pelo MDC Cooperative Agreement (#416), Us Forest Service Cooperative Agreement (16-JV-11242311-118), Academia Americana de Nutrição Veterinária e Waltham/Royal Canin, USA Grant (número de subvenção: 00049049), subsídio de treinamento do NIH (número de subvenção: T32OS011126) e o Programa de Estudiosos de Pesquisa Veterinária da Universidade do Missouri. Os autores agradecem a Shannon Ehlers por pré-revisar este manuscrito. Agradecemos ao Dr. Robert Backus por fornecer os padrões D2O e permitir o uso de seu laboratório.

Todos os experimentos aqui descritos foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade do Missouri e conduzidos a permissão de coleta científica do Departamento de Conservação da Vida Selvagem (MDC) do Missouri (Permit #16409 e #17649).
1. Preparação da solução de estoque estéril, isotônica, salinada D2O
<ol><li>Faça uma solução de estoque de 50 mL de 9,0 g/L salinado D2O.<ol>
<li>Pesar 450 mg de NaCl de grau farmacêutico e transferir toda a NaCl para um béquer esterilizado de 100 mL. Registre a quantidade exata de NaCl para 4 lugares decimais no caderno de laboratório.</li>
		<li>Utilizando um cilindro graduado estéril, meça 50 g de ≥ 99,8% de óxido de deutério e transfira para o béquer estéril contendo o NaCl. Registre a quantidade exata de óxido de deutério para 4 lugares decimais no caderno ou planilha do laboratório.</li>
		<li>Filtrar 10 mL de força isosmótica NaCl (9,0 g/L) através de um filtro de disco estéril não pirogênico com poros submicron (0,2 μm).</li>
		<li>Conecte uma agulha de 20 G ao filtro de disco estéril não pirogênico com poros submicron (0,2 μm) equipados com um barril de seringa de 10 mL. Insira no septo de um frasco vazio estéril de 100 mL.</li>
		<li>Conecte um tubo de vácuo a uma agulha de 22 G e insira a agulha no septo do frasco vazio estéril de 100 mL.</li>
		<li>Despeje 10 mL da solução de estoque no barril de seringa. Ligue lentamente o vácuo até que a solução de estoque D2O comece a filtrar lentamente o frasco estéril. Continue a derramar a solução de estoque D2O no barril de seringa até que todos os 50 mL sejam filtrados. NOTA: A solução de estoque pode precisar ser diluída ou concentrada dependendo da dose necessária. A dose de D2O variará com base na espécie e na sensibilidade do método analítico. Para gatos, a solução de trabalho foi usada para administrar uma dose de 0,7 g/kg D2O. A solução de estoque descrita acima minimiza a quantidade de solução NaCl introduzida subcutâneamente ao animal, ao mesmo tempo em que permite medição precisa da dose. Para pequenos mamíferos, como morcegos, essa concentração deve ser diluída a uma solução de trabalho como 0,1600 g/mL. Esta concentração permite que a dose de 0,75 g/kg D2O seja medida com precisão e administrada em aproximadamente 100 μL ou menos solução NaCl.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Preparação de solução de trabalho de ações d2O estéril, isotônica e salinada para morcegos
<ol><li>Pesar um frasco estéril vazio de 10 mL e registrar peso para 4 lugares decimais mais próximos. Escala de tare.</li>
	<li>Use uma seringa de 1,0 mL para transferir 0,65 mL da solução de estoque D2O para o frasco estéril vazio de 10 mL. Peso recorde de D2O a 4 lugares decimais. Escala de tare.</li>
	<li>Calcule o volume de D2O no frasco vazio de 10 mL. Use a seguinte equação. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59442/59442eq1.jpg"> onde W é registrado peso e D é a densidade de 99,8% D2O (1.107 g/mL).</li>
	<li>Use o volume calculado e o peso conhecido do D2O para determinar o volume de sorolo isotônico necessário para fazer ~0,1600 g/mL solução de trabalho.</li>
	<li>Insira no septo do frasco estéril de 10 mL, a agulha de 22 G (anexada ao tubo de vácuo). Insira no septo do frasco estéril de 10 mL, a agulha de 20 G (anexada a um filtro de seringa de 0,22 μm equipado com um barril de seringa de 10 mL).</li>
	<li>Despeje a massa/volume calculado de NaCl isotônico no barril de seringa e ligue o vácuo para permitir um gotejamento lento no frasco estéril de 10 mL.</li>
	<li>Registre o peso do frasco e garanta que seja criada uma solução de trabalho de ~0,1600 g/mL.</li>
</ol>3. Determinação da composição corporal de morcegos marrons grandes (Eptesicus fucsus) com D2O
NOTA: A solução de estoque de D2O utilizada no protocolo é de 0,1598 g/mL. Antes de coletar sangue, certifique-se de que a remoção de até 200 μL de sangue será ≤ 10% do volume sanguíneo total do morcego e está dentro das diretrizes estabelecidas pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais Institucionais (IACUC) para a coleta de sangue. Todos os animais devem ser presos ou abdômen empalideceu para garantir um estômago vazio. Uma refeição recente poderia alterar o peso do animal resultando em resultados confusos, uma vez que os cálculos para determinar a gordura corporal dependem da massa corporal do animal.
<ol><li>Anestesiar um grande morcego marrom.<ol>
<li>Use 5,0% de isoflurano para indução. Mantenha um plano estável de anestesia utilizando 0,5%-3,0% isoflurane.</li>
		<li>Determine a profundidade adequada da anestesia testando o reflexo da retirada do pedal (beliscando os dedos dos dedos do morcego). O morcego não deve responder à sensação e a taxa respiratória deve permanecer lenta e estável. Ajuste isoflurano conforme necessário para manter um plano estável de anestesia.</li>
		<li>Nível de isoflurano recorde, frequência cardíaca, frequência respiratória e outras informações conforme exigido pela IACUC.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pesar o grande morcego marrom e registrar o peso para 4 lugares decimais.</li>
	<li>Limpe o uropatagium (membrana traseira) sobre a veia interfmoral com uma almofada de preparação de álcool e deixe secar. Aplique uma fina camada de geleia de petróleo sobre a veia interfmoral.</li>
	<li>Use uma agulha de 29 G para perfurar a porção dorsal da veia interfmoral e coletar 100 μL de sangue usando tubos capilares de heparina de sódio plástico. Certifique-se de misturar o sangue inteiro com a heparina de sódio, rolando suavemente cada tubo após a coleta e rotular o tubo.</li>
	<li>Usando uma máquina DXA calibrada para pequenos mamíferos, obtenha três varreduras DXA do morcego10.</li>
	<li>Determine a massa (em g) de D2O para injetar multiplicando o peso do morcego em kg pela dose D2O de 0,75 g/kg. Determine o volume da dose calculada D2O (V) dividindo o peso da dose D2O pela concentração da solução de trabalho. <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/59442/59442eq2.jpg"> <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/59442/59442eq3.jpg">
</li>
	<li>Use uma seringa de insulina com uma agulha de 29 G presa para elaborar o volume de D2O calculado. Pesar o D2O, seringa de insulina e agulha. Registre para 4 lugares decimais.</li>
	<li>Injete o D2O subcutâneamente sobre a região do quadril dorsal do morcego anestesiado.</li>
	<li>Permita que o morcego se recupere da anestesia e registre o tempo de injeção.</li>
	<li>Imediatamente após a injeção, pesar a seringa de insulina agora vazia com a agulha de 29 G presa. Registre o peso para 4 lugares decimais.</li>
	<li>Determine a dose de D2O injetada subtraindo o peso pós-injeção da seringa de insulina da seringa de insulina D2O de pré-injeção. Registre para 4 lugares decimais.</li>
	<li>Dentro de 30 minutos após a coleta de sangue, use uma centrífuga hematocrita para girar cada tubo capilar por 5 minutos. Se a centrífuga hematocrita permitir múltiplas velocidades, definidas para 10.000 x g.</li>
	<li>Use uma tesoura afiada para cortar o tubo capilar plástico entre todo o sangue e o plasma. Use uma pipeta de 200 μL para expelir o plasma diretamente em um tubo de armazenamento rotulado de 500 μL.</li>
	<li>Após o período de equilíbrio, colete mais 100 μL de sangue da veia interfmoral. NOTA: O período de equilíbrio variará de acordo com as espécies e se os morcegos entrarem no torpor. Para morcegos marrons grandes, normalmente 2 h é suficiente para o período de equilíbrio.</li>
	<li>Separe o plasma em um segundo rotulado, tubo superior do parafuso de microcentrífuga de 500 μL repetindo a etapa 3.13. Guarde amostras a -20 °C ou mais frias até a análise.</li>
</ol>4. Análise de espectrofotometria infravermelha de transformação de fourier
<ol><li>Defina a temperatura de um banho de areia a 60 °C para facilitar a destilação (permitir a separação da água e D2O de outros componentes sanguíneos).</li>
	<li>Pipette 50 μL de cada amostra de plasma e padrão no interior de uma tampa de tubo de microcentrífuga cônica de 1,5 mL. Incluindo padrões contendo concentrações conhecidas de D2O como controle de qualidade. NOTA: Idealmente cada animal terá três réplicas por amostra e a média das três réplicas relatadas. Devido ao volume amostral limitado e ao volume de amostra necessário para o equipamento FT-IR utilizado pelos autores, não foram realizadas réplicas para as amostras de morcegos. Se alguma amostra contiver menos de 50 μL de plasma, pipeta a quantidade de amostra na tampa do tubo de microcentrífuga cônica e registre o volume.</li>
	<li>Mantenha a tampa de microcentrífuga de cabeça para baixo e aparafusar o tubo de microcentrífuga cônica de 1,5 mL na tampa. Coloque o tubo invertido (de cabeça para baixo) com a tampa em contato com a areia no banho de areia por um mínimo de 12 h (durante a noite).</li>
	<li>Após 12 h, retire a tampa e substitua por uma nova tampa limpa. Pulse o tubo de microcentrífuga por 10 s em uma centrífuga.</li>
	<li>Crie os seguintes padrões: 0 ppm (0 mg D2O em 1 L água destilada), 293 ppm (293 mg D2O em 1 L água destilada), 585 ppm (585 mgD2O em 1 L água destilada), 878 ppm (878 mg D2O em 1 L água destilada) e 1170 ppm D2O (1170 mg D2O em 1 L água destilada). NOTA: Os valores acima são sugeridos para uma curva padrão. Valores alternativos como 250 ppm, 500 ppm, 750 ppm, e assim por diante podem ser utilizados.</li>
	<li>Instale uma célula de transmissão líquida no espectrômetro infravermelho de transformação infravermelha (FTIR)(Tabela de Materiais). Encha a célula com metanol e conecte a porta de injeção. Lentamente encha a célula com água de fundo enquanto remove cuidadosamente a seringa de metanol para reduzir o risco de bolhas de ar. Anexar tubos à porta de saída para permitir a remoção das amostras após a análise.</li>
	<li>Prepare o software de espectrômetro FTIR (Tabela de Materiais) para análise de D2O na água. As configurações do parâmetro para o software espectrômetro utilizado neste protocolo estão listadas na Tabela 1.</li>
	<li>Colete uma amostra de fundo usando a água diluente, filtrada de 0,22 μm, destilada. Esta deve ser a mesma água usada para os padrões.</li>
	<li>Injete 40 μL do 0 ppm D2O e grave o espectro. Salve o espectro como um arquivo de valores separados (CSV) de comma.</li>
	<li>Continue injetando e salvar o espectro de todos os padrões para criar uma curva padrão.</li>
	<li>Repita o fundo e a curva padrão a cada 60-90 min.</li>
	<li>Injete 40 μL de cada amostra destilada na célula de transmissão líquida e salve o espectro. NOTA: Altere o volume de injeção das normas e as amostras destiladas com base no volume da célula de transmissão líquida. Use uma célula de transmissão líquida de volume menor se o volume de amostra estiver abaixo de 40 μL ou diluir 1:1 com água destilada de fundo.</li>
	<li>Determine a concentração de D2O de cada amostra do espectro FTIR usando um programa de planilha como descrito por Jennings et al.11 ou o software espectral. Quando as réplicas são realizadas, use a concentração média para calcular a composição corporal.</li>
</ol>5. Cálculo da composição corporal
<ol><li>Converta o enriquecimento de deutério (ppm) em concentração de átomo para cada amostra usando a seguinte equação12: <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/59442/59442eq4.jpg"> onde x é o enriquecimento de deuterium medido (ppm) da amostra e 0,0001557 é a fração mole do deutério relatada em Viena Standard Mean Ocean Water (VSMOW)13.</li>
	<li>Calcule a água total do corpo para cada amostra usando a seguinte equação4,12,14: <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/59442/59442eq5.jpg">) onde e é o enriquecimento medido (átomo%) de deutério na amostra após correção de fundo, B é a massa de injeção em g, e 0,998 é a concentração de D2O injetado. NOTA: A troca de deutério com hidrogênio labile causa uma superestimação de 2% da massa total de água corporal. A água total do corpo deve ser corrigida reduzindo a estimativa total de massa de água corporal em 2% do peso corporal.</li>
	<li>Estimar a massa sem gordura (massa magra do corpo e todos os outros componentes não gordos) de cada morcego usando a seguinte equação: <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/59442/59442eq6.jpg"> NOTA: Use o valor convencionalmente aceito de 0,732 para o teor de umidade fracionada da massa corporal magra para morcegos saudáveis, euhidratados, não lactantes. O teor de umidade fracionada de massa sem gordura pode mudar na lactação de grandes marrons com base na semana pós-parto15. Para outras espécies, use os valores publicados na literatura ou determine o teor de umidade fracionada da massa corporal magra antes de realizar cálculos da massa corporal magra.</li>
	<li>Esquete a massa de gordura corporal usando a seguinte equação: <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/59442/59442eq7.jpg">
</li>
	<li>Converta a massa de gordura corporal em g para por cento de massa de gordura corporal usando a seguinte equação: <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/59442/59442eq8.jpg">
</li>
</ol>6. Determinação da composição da água em um carnívoro (Felis catus, gato doméstico)
<ol><li>Prepare a solução de estoque como descrito na seção 1.</li>
	<li>Pesar cada gato para os 3 lugares decimais mais próximos e registrar peso. Calcule a dose de cada gato conforme descrito na etapa 3.6 usando uma dose D2O de 0,70 g/kg.</li>
	<li>Prepare cada dose conforme descrito nos passos 3.7-3.8. usando uma seringa de 3 mL ou 5 mL com uma agulha de 22 G em vez de uma seringa de insulina.</li>
	<li>Colete 500 μL de sangue inteiro e, posteriormente, administre subcutâneamente os tubos de parafuso de 0,7 g/kg D2O. Centrífuga saem de 2.000 x g por 15 min e armazene plasma em tubos de parafuso de microcentrífuga de 1,5 mL a -20°C até a análise.</li>
	<li>Colete 500 μL de sangue inteiro 4 h após a injeção. Centrífuga de sangue inteiro a 2.000 x g por 15 min e armazenar plasma em tubos superiores de microcentrífugade de 1,5 mL a -20 °C até a análise.</li>
	<li>Colete 500 μL de sangue inteiro 14 dias após a injeção. Centrífuga de sangue inteiro a 2.000 x g por 15 min e armazenar plasma em tubos superiores de microcentrífugade de 1,5 mL a -20 °C até a análise. NOTA: O número de dias entre a coleta de sangue pode ser baseado nas necessidades experimentais e no período pós-injeção em que o D2O pode ser detectado acima dos níveis de fundo. Quatorze dias foi a duração dos blocos de tratamento dietético de Hooper et al.9.</li>
	<li>Realizar análises ft-ir de acordo com a seção 4 e calcular a composição corporal de acordo com a seção 5 deste protocolo.</li>
	<li>Calcule o consumo de água em mL/dia usando as seguintes equações: <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/59442/59442eq9.jpg"> <img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/59442/59442eq10.jpg"> <img alt="Equation 11" src="/files/ftp_upload/59442/59442eq11.jpg"> onde a TBW é água corporal total, D2O inicial e D2O final são as concentrações medidas em ppm nas amostras D2O pós-injeção.</li>
</ol>

<ol><li>Schiffmann, C., Clauss, M., Hoby, S., Hatt, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+body+condition+scoring+in+zoo+animals+%E2%80%93+composite%2C+algorithm+and+overview+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Zoo+Aquarium+Research%22%5BJournal%5D)">Visual body condition scoring in zoo animals – composite, algorithm and overview approaches.</a> Journal of Zoo Aquarium Research. 5 (1), (2017).</li>
<li>Peig, J., Green, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+perspectives+for+estimating+body+condition+from+mass%2Flength+data%3A+the+scaled+mass+index+as+an+alternative+method%5BTitle%5D)+AND+%22Oikos%22%5BJournal%5D)">New perspectives for estimating body condition from mass/length data: the scaled mass index as an alternative method.</a> Oikos. 118 (12), 1883-1891 (2009).</li>
<li>Bissell, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBissell%2C+H+%22Body+Condition+Scoring+Resource+Center%22">Body Condition Scoring Resource Center</a>. , https://nagonline.net/3877/body-condition-scoring/ (2017).</li>
<li>McWilliams, S. R., Whitman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-destructive+techniques+to+assess+body+composition+of+birds%3A+a+review+and+validation+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ornithology%22%5BJournal%5D)">Non-destructive techniques to assess body composition of birds: a review and validation study.</a> Journal of Ornithology. 154 (3), 597-618 (2013).</li>
<li>Lukaski, H. C., Johnson, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple%2C+inexpensive+method+of+determining+total+body+water+using+a+tracer+dose+of+D2O+and+infrared+absorption+of+biological+fluids%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Clinical+Nutrition%22%5BJournal%5D)">A simple, inexpensive method of determining total body water using a tracer dose of D2O and infrared absorption of biological fluids.</a> American Journal of Clinical Nutrition. 41 (2), 363-370 (1985).</li>
<li>Chusyd, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adiposity+and+Reproductive+Cycling+Status+in+Zoo+African+Elephants%5BTitle%5D)+AND+%22Obesity+%28Silver+Spring%29%22%5BJournal%5D)">Adiposity and Reproductive Cycling Status in Zoo African Elephants.</a> Obesity (Silver Spring). 26 (1), 103-110 (2018).</li>
<li>Kanchuk, M. L., Backus, R. C., Calvert, C. C., Morris, J. G., Rogers, Q. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutering+Induces+Changes+in+Food+Intake+Body+Weight%2C+Plasma+Insulin+and+Leptin+Concentrations+in+Normal+and+Lipoprotein+Lipase%E2%80%93Deficient+Male+Cats%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Neutering Induces Changes in Food Intake Body Weight, Plasma Insulin and Leptin Concentrations in Normal and Lipoprotein Lipase–Deficient Male Cats.</a> The Journal of Nutrition. 132 (6), 1730S-1732S (2002).</li>
<li>Eichhorn, G., Visser, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+Comment%3A+Evaluation+of+the+Deuterium+Dilution+Method+to+Estimate+Body+Composition+in+the+Barnacle+Goose%3A+Accuracy+and+Minimum+Equilibration+Time%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+and+Biochemical+Zoology%22%5BJournal%5D)">Technical Comment: Evaluation of the Deuterium Dilution Method to Estimate Body Composition in the Barnacle Goose: Accuracy and Minimum Equilibration Time.</a> Physiological and Biochemical Zoology. 81 (4), 508-518 (2008).</li>
<li>Hooper, S. E., Backus, R., Amelon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+dietary+selenium+and+moisture+on+the+physical+activity+and+thyroid+axis+of+cats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Animal+Physiolgy+and+Animal+Nutrition+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">Effects of dietary selenium and moisture on the physical activity and thyroid axis of cats.</a> Journal of Animal Physiolgy and Animal Nutrition (Berl). 102 (2), 495-504 (2018).</li>
<li>Stevenson, K. T., van Tets, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-Energy+X-Ray+Absorptiometry+%28DXA%29+Can+Accurately+and+Nondestructively+Measure+the+Body+Composition+of+Small%2C+Free-Living+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+and+Biochemical+Zoology%22%5BJournal%5D)">Dual-Energy X-Ray Absorptiometry (DXA) Can Accurately and Nondestructively Measure the Body Composition of Small, Free-Living Rodents.</a> Physiological and Biochemical Zoology. 81 (3), 373-382 (2008).</li>
<li>Jennings, G., Bluck, L., Wright, A., Elia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+infrared+spectrophotometry+for+measuring+body+water+spaces%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The use of infrared spectrophotometry for measuring body water spaces.</a> Clinical Chemistry. 45 (7), 1077-1081 (1999).</li>
<li>Beuth, J. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Body+Composition%2C+movemement+phenology+and+habitat+use+of+common+eider+along+the+southern+new+england+coast.+Master+of+Science+in+Biological+and+Environmental+Sciences+%28MSBES%29%22">Body Composition, movemement phenology and habitat use of common eider along the southern new england coast. Master of Science in Biological and Environmental Sciences (MSBES) thesis</a>. , University of Rhode Island. (2013).</li>
<li>Coplen, T. B., Hopple, J., Peiser, H., Rieder, S. Compilation of minimum and maximum isotope ratios of selected elements in naturally occurring terrestrial materials and reagents. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCoplen%2C+TB+%22U.S.+Geological+Survey+Water-Resources+Investigations+Report+01-4222%22">U.S. Geological Survey Water-Resources Investigations Report 01-4222</a>. , (2002).</li>
<li>Karasov, W. H., Pinshow, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+lean+mass+and+in+organs+of+nutrient+assimilation+in+a+long-distance+passerine+migrant+at+a+springtime+stopover+site%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Zoology%22%5BJournal%5D)">Changes in lean mass and in organs of nutrient assimilation in a long-distance passerine migrant at a springtime stopover site.</a> Physiological Zoology. 71 (4), 435-448 (1998).</li>
<li>Hood, W. R., Oftedal, O. T., Kunz, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+in+body+composition+of+female+big+brown+bats+%28Eptesicus+fuscus.%29+during+lactation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Physiology+B%22%5BJournal%5D)">Variation in body composition of female big brown bats (Eptesicus fuscus.) during lactation.</a> Journal of Comparative Physiology B. 176 (8), 807-819 (2006).</li>
<li>Backus, R. C., Havel, P. J., Gingerich, R. L., Rogers, Q. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+serum+leptin+immunoreactivity+and+body+fat+mass+as+estimated+by+use+of+a+novel+gas-phase+Fourier+transform+infrared+spectroscopy+deuterium+dilution+method+in+cats%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Veterinary+Research%22%5BJournal%5D)">Relationship between serum leptin immunoreactivity and body fat mass as estimated by use of a novel gas-phase Fourier transform infrared spectroscopy deuterium dilution method in cats.</a> American Journal of Veterinary Research. 61 (7), 796-801 (2000).</li>
<li>Moore, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+Total+Body+Water+and+Solids+with+Isotopes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Determination of Total Body Water and Solids with Isotopes.</a> Science. 104 (2694), 157-160 (1946).</li>
<li>Voigt, C., Cruz-Neto, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVoigt%2C+C+%22Ecological+and+Behavioral+Methods+in+the+Study+of+Bats%22">Ecological and Behavioral Methods in the Study of Bats</a>. Parsons, S., Kunz, T. H. , John Hopkins University Press. Ch. 30 621-645 (2009).</li>
<li>International Atomic Energy Agency. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Assessment+of+Body+Composition+and+Total+Energy+Expenditure+in+Humans+Using+Stable+Isotope+Techniques%22">Assessment of Body Composition and Total Energy Expenditure in Humans Using Stable Isotope Techniques</a>. , (2009).</li>
<li>International Atomic Energy Agency. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Introduction+to+Body+Composition+Assessment+Using+the+Deuterium+Dilution+Technique+with+Analysis+of+Saliva+Samples+by+Fourier+Transform+Infrared+Spectrometry%22">Introduction to Body Composition Assessment Using the Deuterium Dilution Technique with Analysis of Saliva Samples by Fourier Transform Infrared Spectrometry</a>. , (2011).</li>
<li>Shimamoto, H., Komiya, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Turnover+of+Body+Water+as+an+Indicator+of+Health%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiological+Anthropology+and+Applied+Human+Science%22%5BJournal%5D)">The Turnover of Body Water as an Indicator of Health.</a> Journal of Physiological Anthropology and Applied Human Science. 19 (5), 207-212 (2000).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

O uso de óxido de deutério para determinar a TBW tem sido usado desde a década de 1940e é usado em humanos e uma variedade de espécies domésticas e da vida selvagem4,6,7. Outras técnicas não destrutivas foram desenvolvidas, incluindo análise de impedância bioelétrica (BIA), DXA e ressonância magnética quantitativa (RQ). Cada método tem vantagens e desvantagens que devem ser consideradas antes de seleciona...

Sistemas de pontuação de condições corporais e índices de condição corporal são técnicas comuns utilizadas para avaliar o estado de saúde ou aptidão de uma espécie1,2. Muitas espécies domésticas e zoológicas possuem sistemas únicos de pontuação de condição corporal (BCS) que são usados para avaliar o tecido gorduroso muscular e superficial de um animal3. No entanto, a avaliação do BCS depende do avaliador — o que significa que o BCS é uma medida objetiva ou semiquantitativa quando avaliada por um avaliador treinado. Em espécies de animais selvagens, os índices de condição corporal são comumente usados em vez de BCS e são baseados em uma proporção de massa corporal ao tamanho do corpo ou massa corporal ao antebraço2. Os índices de condição corporal são muitas vezes confundidos com os efeitos da forrageamento e podem ser confundidos pelo tamanho do corpo, bem como problemas estatísticos e inferenciais4.
Uma alternativa aos sistemas de pontuação de condições corporais e índices de condição corporal é usar um isótopo estável para determinar a composição corporal. Um isótopo estável comumente usado é o óxido de deutério (D2O), uma forma não radioativa de água na qual os átomos de hidrogênio são isótopos de deutério. O método de diluição de óxido de deutério descrito neste estudo pode ser uma técnica não subjetiva, quantitativa e repetitiva usada para estimar a composição corporal em humanos5 e uma ampla gama de espécies4,6,7. Essa técnica pode ser vantajosa para estudar a composição corporal na vida selvagem. Por exemplo, pode ser usado para avaliar mudanças longitudinalnais na composição corporal, como antes e depois de uma ação de gestão. No entanto, em algumas espécies de animais selvagens o óxido de deutério pode superestimar o teor real de água8. Portanto, ao adaptar a técnica para uma espécie, é importante validar o método comparando o método de óxido de deutério à análise de carcaças para espécies não ameaçadas de extinção. Para espécies ameaçadas e ameaçadas, um método não destrutivo, como a absorção de raios-X duplo (DXA), deve ser considerado como um método alternativo de comparação ao método destrutivo padrão-ouro da análise completa da carcaça.
Além da composição corporal, a técnica d2O de diluição pode ser usada para determinar o consumo de água de um animal individual9. Essa aplicação única de D2O pode ser usada para responder não apenas perguntas de pesquisa, mas pode ser útil para avaliar o consumo de água de animais individuais abrigados em grandes ambientes sociais.
Aqui, descrevemos a adaptação da técnica de diluição D2O para avaliar a composição corporal em um insetoivore, grandesmorcegos marrons ( Eptesicus fuscus), e para avaliar o consumo de água em um carnívoro, gatos (Felis catis).

<table><tbody><tr><td>Filtro de disco não pirogênico de 0,2 mícron</td><td>Argos Technologies</td><td>FN32S</td><td>nylon, 30mm de diâmetro, 0,22um, tubos de</td></tr><tr><td>microcentrífuga cônicos estéreis de 1,5 mL USA</td><td>Scientific</td><td>1415-9701</td><td>Tubo de microcentrífuga autônomo de 1,5 ml, natural com tampa azul</td></tr><tr><td>Frasco de vidro estéril de 10 mL para injeção</td><td>Equipamento Médico Mountainside</td><td>MS-SEV10</td><td>unidade de injeção de vidro transparente e estéril</td></tr><tr><td>Seringa de 10 mL</td><td>Becton Dickinson</td><td>305219</td><td>seringa estéril de 10 mL embalada individualmente</td></tr><tr><td>Frasco de vidro estéril de 100 mL para injeção</td><td>Mountainside Medical Equipment</td><td>AL-SV10020 unidade de</td><td>injeção de vidro transparente e estéril</td></tr><tr><td>Agulha de calibre 20</td><td>Exel</td><td>26417</td><td>agulhas hipodérmicas 20g x 1" cubo de plástico (amarelo) / bisel regular</td></tr><tr><td>agulha de calibre 22</td><td>Exel</td><td>26411</td><td>agulhas hipodérmicas 22g x 1" cubo de plástico (preto) / chanfro regular</td></tr><tr><td>óxido de deutério</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>151882-25G</td><td>99,9 átomos % D</td></tr><tr><td>isofluorano</td><td>Vetone</td><td>3060</td><td>fluriso isoflurano, USP</td></tr><tr><td>OMNIC Spectra Software</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>833-036200</td><td>FT-IR software padrão</td></tr><tr><td>vaselina vaselina</td><td></td><td>305212311006</td><td>Vaselina, 100% vaselina pura, original,</td></tr><tr><td>tubos capilares de plástico</td> protetor de pele <td>Inovador Med Tech</td><td>100050</td><td>anticoagulante heparina sódica, 50 &mu; Capacidade L, 30 mm de comprimento</td></tr><tr><td>Espectrofotômetro líquido selado SL-3 FTIR CAF2 Cell</td><td>International Crystal Laboratory</td><td>0005D-875</td><td>0,05 mm Comprimento do caminho</td></tr><tr><td>cloreto de sódio</td><td>EMD Millipore</td><td>1.37017</td><td>adequado para produção biofarmacêutica</td></tr><tr><td>Thermo Electron Nicolet 380 FT-IR Espectrômetro</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>269-169400</td><td>modelo descontinuado, modelos mais recentes disponíveis</td></tr></tbody></table>

usando óxido de utério como ferramenta não invasiva e não letal para avaliar composição corporal e consumo de água em mamíferos

Using Deuterium Oxide as a Non-Invasive, Non-Lethal Tool for Assessing Body Composition and Water Consumption in Mammals

Sistemas de pontuação de condições corporais e índices de condição corporal são técnicas comuns utilizadas para avaliar o estado de saúde ou aptidão de uma espécie. Os sistemas de pontuação de condições corporais são dependentes e têm potencial para serem altamente subjetivos. Os índices de condição corporal podem ser confundidos com forrageamento, os efeitos do peso corporal, bem como problemas estatísticos e inferenciais. Uma alternativa aos sistemas de pontuação de condição corporal e índices de condição corporal é usar um isótopo estável, como óxido de deutério para determinar a composição corporal. O método de diluição de óxido de deutério é uma técnica quantitativa repetível usada para estimar a composição corporal em humanos, vida selvagem e espécies domésticas. Além disso, a técnica de diluição de óxido de deutério pode ser usada para determinar o consumo de água de um animal individual. Aqui, descrevemos a adaptação da técnica de diluição de óxido de deutério para avaliação da composição corporal em morcegos marrons grandes (Eptesicus fuscus) e para avaliar o consumo de água em gatos (Felis catis).

A técnica de diluição de óxido de deutério pode ser usada para avaliar a composição corporal de uma variedade de espécies. Para demonstrar a adaptabilidade, estamos relatando o primeiro uso da técnica de diluição de óxido de deutério em uma espécie de morcego insetívoro norte-americano, Eptesicus fuscus,o grande morcego marrom para resultados representativos. Um platô de cronometragem foi concluído tomando amostras de sangue de injeção pré e pós-D2O como deve ser feito...

Este artigo descreve a técnica de diluição de óxido de deutério em dois mamíferos, um insetívoro e carnívoro, para determinar a água total do corpo, a massa corporal magra, a massa de gordura corporal e o consumo de água.

Usando óxido de utério como ferramenta não invasiva e não letal para avaliar composição corporal e consumo de água em mamíferos

Body condition scoring systems and body condition indices are common techniques used for assessing the health status or fitness of a species. Body ...

Usando este protocolo, óxido de deutério, ou D2O, um isótopo nãoradiotivo e estável da água, pode ser usado para estimar a composição corporal e o consumo de água. Esta técnica não é invasiva e, portanto, pode ser usada para avaliar a composição corporal em espécies ameaçadas de extinção, bem como em seres humanos e espécies domésticas. Uma aplicação única da técnica de diluição de óxido de deutério é a capacidade de medir o consumo de água de animais selvagens de alcance livre com altas taxas de recaptura ou de animais socialmente alojados.Embora a anestesia não seja necessária, pode ser mais fácil para aqueles que não estão familiarizados com a injeções subcutâneas sedarem os animais antes de entregar o óxido de deutério. Demonstrando o procedimento com Sarah Hooper e eu estarão Amanda Eshelman e Ashley Cowan, estudantes de veterinária, e Alicia Roistacher, uma estudante de pós-graduação do meu laboratório. Para fazer uma solução de estoque de 50 mililitros de nove gramas por litro de óxido de deutério saliado, primeiro pesar 450 miligramas de cloreto de sódio de grau farmacêutico, e registrar a quantidade exata em quatro locais decimais.Transfira todo o sal para um béquer esterilizado de 100 mililitros e meça 50 gramas de óxido de óxido de 99,8% de deutério em um cilindro estéril e graduado. Registre a quantidade exata de óxido de deutério para quatro locais decimais, e transfira o óxido de deutério para o béquer estéril de cloreto de sódio. Em seguida, conecte uma agulha de 20 bitolas a um filtro de disco não estéril e não estéril com poros de submicron equipado com um barril de seringa de 10 mililitros, e insira a agulha no septo de um frasco estéril, vazio, de 100 mililitros.Conecte um tubo de vácuo a uma agulha de calibre 22 e insira a agulha no septo do frasco de 100 mililitros. Em seguida, carregue 10 mililitros de cloreto de sódio de resistência isomótica no barril de seringa, e lentamente ligue o vácuo até que a solução de óxido de deutério comece a filtrar lentamente no frasco. Continue despejando a solução de estoque de óxido de deutério no barril de seringa até que todo o volume de 50 mililitros tenha sido filtrado.Depois de confirmar a falta de resposta ao aperto do dedo do dedo em um morcego anestesiado, use uma almofada de preparação de álcool para limpar o uropatagium sobre a veia interfemoral, e permitir que a membrana da cauda desinfetada seque. Aplique uma fina camada de geleia de petróleo sobre a veia interfemoral, e use uma agulha de calibre 29 para perfurar a porção dorsal da veia interfemoral. Em seguida, use tubos capilares de heparina de sódio de plástico para coletar 100 microliters de sangue.Para garantir uma mistura adequada de todo o sangue com a heparina de sódio, role suavemente cada tubo após a coleta de sangue antes de rotular. Depois de determinar a massa de óxido de deutério em gramas para injetar, carregue uma seringa de insulina equipada com uma agulha de calibre 29 com o volume apropriado de óxido de deutério. Pesar a seringa e agulha de insulina carregada de deutério, registrando o peso em quatro locais decimais, e injetar todo o volume de óxido de deutério subcutâneamente sobre a região dorsal do quadril do morcego anestesiado.Recomendamos o uso de uma balança de precisão com um escudo de rascunho antiestático e para ter certeza de puxar para trás no êmbolo para garantir pressão negativa antes da injeção. Imediatamente após a injeção, pese a seringa de insulina e agulha agora vazias, e regise o peso em quatro casas decimais. Dentro de 30 minutos após a coleta de sangue, use uma centrífuga hematócrito para girar cada tubo capilar a 10.000 vezes g por cinco minutos.Usando uma tesoura afiada, corte o tubo capilar de plástico entre todo o sangue e o plasma, e use uma pipeta de 200 microliter para expelir o plasma diretamente em um tubo de armazenamento rotulado de 500 microliter. Após o período de equilíbrio, colete e armazene outros 100 microliters de sangue da veia interfemoral como apenas demonstrado. Para análise de espectrofotometria FTIR, defina a temperatura de um banho de areia para 60 graus Celsius para facilitar a destilação, e adicione 50 microliters de cada amostra de plasma e padrão em tampas de microcentrifuge cônicas individuais de 1,5 mililitro.Mantendo a tampa de microcentrifuge de cabeça para baixo, enrosque o tubo de microcentrifutura cônica de 1,5 mililitro na tampa e coloque o tubo invertido em contato com a areia no banho de areia por um mínimo de 12 horas. Na manhã seguinte, coloque uma nova tampa limpa em cada tubo, e pulso os tubos de microcentrifuuge por 10 segundos em um microcentrifuuge. Instale uma célula de transmissão líquida no espectrômetro FTIR e encha a célula com metanol.Conecte a porta de injeção e encha lentamente a célula com água de fundo, removendo cuidadosamente a seringa de metanol para reduzir o risco de bolhas de ar. Anexar tubos à porta de saída para permitir a remoção das amostras após a análise e abrir o software do espectrômetro FTIR. Defina os parâmetros de acordo com a tabela e colete uma amostra de fundo usando a água diluída, filtrada de 0,22 micrômetros.Injete 40 microliters de um padrão de óxido de uterium zero por milhão de óxido de deutério, e regissira e salve o espectro como um arquivo de valores separados por ímã. Depois de injetar e salvar os espectros de todos os padrões para criar uma curva padrão, injete 40 microliters de cada amostra destilada na célula de transmissão líquida e salve o espectro. Com um tempo de equilíbrio conhecido, a água total do corpo, a massa magra do corpo e a massa de gordura corporal para morcegos marrons grandes e grandes morcegos marrons podem ser determinados.Uma massa de gordura corporal negativa pode ser calculada devido a uma ou mais das seguintes razões: não receber toda a dose de óxido de deutério, tornar-se toróide durante a fase de equilíbrio, ter massas de gordura anormalmente grandes e massas magras mínimas, ou ter menos de três a 5% de gordura corporal, conforme determinado pela absorptiometria de raios-X duplo. Aqui, mostra-se uma porcentagem representativa da gordura corporal determinada pela técnica de diluição do óxido de deutério em comparação com a absorptiometria de raios-X duplo. As duas técnicas estão bem correlacionadas, com a massa de gordura corporal mostrando fortes correlações entre a gordura corporal e o peso corporal e com a técnica de diluição de óxido de deuterium não consistentemente sobre ou subestimando a massa de gordura corporal.O método de diluição de óxido de deutério foi previamente validado em gatos, e a técnica foi adaptada para permitir a medição do consumo diário de água de gatos socialmente alojados durante cada bloco dietético do experimento. Lembre-se que esta técnica deve ser realizada apenas em animais saudáveis e que você deve pesar, registrar e entregar com precisão a dose completa de óxido de deutério para cada animal. Um método secundário para determinar a composição corporal, como análise completa da carcaça ou DEXA, pode ser concluído para validar a técnica de óxido de deutério.Essa técnica nos permitiu identificar um gato socialmente alojado que consumia quantidades anormalmente altas de água sem separar cada gato para medir seus consumos de água.

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Research

JoVE Journal

Environment

Ambiente

Análise de conteúdo de gordura é rotineiramente realizada em estudos utilizando modelos murinos obesidade. Métodos emergentes de pequenos animais a tomografia computadorizada ea análise estão fornecendo para longitudinal de análise de conteúdo de gordura riqueza de detalhes. Aqui passo detalhamos por procedimentos passo para a realização de pequenos animais tomografia computadorizada, análise e visualização.

Segmentação e medição de volumes de gordura em modelos de obesidade em roedores usando raios-X Tomografia Computadorizada

Fonte: Tokunou, Y., et al, Detecção eletroquímica do efeito do isótopo cinético de deutério no transporte de elétrons extracelular em Shewanella oneidensis MR-1. J. Vis. Exp. (2018)Este vídeo demonstra um método eletroquímico de célula inteira para avaliar como a transferência de prótons afeta o transporte de elétrons extracelular (EET) em bactérias eletroativas. Ao substituir prótons por deutérios usando óxido de deutério, o método mede as mudanças na corrente para revelar um efeito de isótopo...

Medindo o efeito do isótopo cinético no transporte de elétrons microbianos usando óxido de deutério

Este protocolo descreve o uso de um analisador de composição do corpo e sistema de monitoramento animal metabólico para caracterizar a composição corporal e parâmetros metabólicos em camundongos. Um modelo de obesidade induzido pelo alto teor de gordura alimentar é usado como um exemplo para a aplicação dessas técnicas.

Composição corporal e análise de enjaulamento metabólico em ratos de alta gordura Fed

Aqui nós apresentamos um protocolo de toda a célula eletroquímicos experimentos para estudar a contribuição do transporte de protões para a taxa de transporte de elétrons extracelular através do membrana externa citocromos complexos em Shewanella oneidensis MR-1.

Eletroquímico deteção de deutério cinética efeito isotópico no transporte de elétrons extracelular em Shewanella oneidensis MR-1

Aqui, nós compartilhamos métodos de medição do consumo de oxigênio mitocondrial, um definição conceito de nutricional energética e vazamento de prótons, a principal causa de ineficiência na geração mitocondrial de ATP. Estes resultados podem representam 30% da energia perdida na utilização de nutrientes para ajudar a avaliar a função mitocondrial.

Medição de consumo de oxigênio mitocondrial hepática e cinética de vazamento de protões para estimar a respiração mitocondrial no gado leiteiro de Holstein

Apresentamos um método quantitativo de baixo custo utilizando óxido de deutério e cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (GCMS) para a análise da lipogênese de novo de ácidos graxos totais em tecido adiposo marrom in vivo.

Determinação quantitativa da síntese de novos ácidos graxos em tecido adiposo marrom utilizando óxido de deutério

Apresentamos um protocolo para visualizar diretamente as atividades metabólicas em células reguladas por aminoácidos usando microscopia Raman estimulada de espalhamento Raman estimulado com óxido de deutério (água pesada D2O) (DO-SRS), que é integrada à microscopia de fluorescência por excitação de dois fótons (2PEF).

Imagem Química Bioortogonal do Metabolismo Celular Regulado por Aminoácidos Aromáticos

Aqui, apresentamos uma compilação de ensaios para medir diretamente a função mitocondrial em células de mamíferos, independentemente de sua capacidade de consumir oxigênio molecular.

Ensaios Independentes de Oxigênio para Medir a Função Mitocondrial em Mamíferos

Aqui, apresentamos detalhadamente o protocolo de medição do dispositivo ultrassônico de transmissão axial bidirecional (BDAT) e o testamos em um estudo de reprodutibilidade, considerando 14 participantes saudáveis e 3 operadores. A confiabilidade, medida com os coeficientes de correlação intraclasse (CCI), foi de boa a excelente para quatro parâmetros de interesse.

Avaliação óssea cortical usando ondas guiadas por ultrassom: um estudo de reprodutibilidade em uma população saudável

Este procedimento visa identificar metabólitos transferidos do espermatozoide para os oócitos durante a fertilização por meio da marcação isotópica estável com glicose 2H2O ou U13C seguida de análise metabolômica. Os touros marcados com deutério são acasalados com mães não marcadas. Os embriões pré-implantação coletados são analisados por espectrometria de massa para separar os metabólitos paternos (deuterados) dos maternos (não deuterados).

Marcação in vivo de isótopos estáveis para identificação por espectrometria de massa de metabólitos paternos transferidos do espermatozoide para o oócito durante a fertilização

Aprenda a técnica de diluição com óxido de deutério para avaliar composição corporal e consumo de água em mamíferos. Este método não invasivo permite estudar espécies selvagens em perigo sem anestesia.

Usando óxido de utério como ferramenta não invasiva e não letal para avaliar composição corporal e consumo de água em mamíferos

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