Name: Melhorar o Engraftment de cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por uma inibição transitória da atividade da Rho kinase (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Aprenda a melhorar o engraftment de cardiomiócitos derivados de hiPSCs usando inibição transitória da Rho kinase em modelo de infarto do miocárdio. Este protocolo eficiente aumenta a adesão e sobrevivência celular.

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Os autores agradecem ao Dr. Joseph C. Wu (Universidade de Stanford) por gentilmente fornecer o constructo Fluc-GFP e o Dr. Yanwen Liu para uma excelente assistência técnica. Este estudo é apoiado pelos institutos nacionais de saúde RO1 concede HL95077, HL114120, HL131017, HL138023, UO1 HL134764 (a J.Z.), e HL121206A1 (a L.Z.), e um R56 conceder HL142627 (a W.Z.), uma associação americana de desenvolvimento do cientista do coração Grant 16SDG30410018, e a Universidade de Alabama na concessão do desenvolvimento da faculdade de Birmingham (a W.Z.).

Todos os procedimentos animais neste estudo foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais (IACUC) da Universidade do Alabama em Birmingham e foram baseados nos institutos nacionais de saúde laboratório de cuidados com os animais e diretrizes de uso (NIH publicação não 85-23).
1. preparação de meios de cultura e placas de cultura
<ol><li>
Preparação média
	<ol>
<li>Para o meio hiPSC, misture 400 mL de meio basal de células-tronco pluripotentes humanas (hPSC) (tabela de materiais 1) e 100 ml de suplemento HPSC 5x; armazenar a mistura a 4 ° c.</li>
		<li>Para RPMI 1640/B27 menos insulina (RB-) médio, misture 500 mL de RPMI 1640 e 10 mL de suplemento B27 menos insulina.</li>
		<li>Para o meio RPMI 1640/B27 (RB +), misture 500 mL de RPMI 1640, 10 mL de suplemento B27 e 5 mL de antibiótico de penicilina-estreptomicina (Pen-Strep).</li>
		<li>Para o meio de purificação16, misture 500 ml de no-glucose rpmi 1640, 10 ml de suplemento B27, 5 ml de antibiótico Pen-Strep e 1.000 μl de solução de DL-lactato de sódio (a uma concentração final de 4 mm).</li>
		<li>Para solução de neutralização, misture 200 mL de RPMI 1640, 50 mL de soro fetal bovino (FBS), 2,5 mL de antibiótico Pen-Strep e 50 μL de Y-27632 (numa concentração final de 10 μM).</li>
		<li>Para o meio de congelação, misture 9 mL de FBS, 1 mL de dimetil sulfóxido (DMSO) e 10 μL de Y-27632 (numa concentração final de 10 μM).</li>
		<li>Para a solução de matriz extracelular (EMS), descongelar a matriz extracelular concentrada (tabela de materiais 1) a 4 ° c até atingir um estado líquido uniformemente consistente. Precool pontas de pipeta e tubos antes de fazer alíquotas de matriz de 350 μL cada um no gelo, e armazenar as alíquotas em-20 ° c. Antes de revestir as chapas, diluir uma alíquota descongelada em 24 mL de meio DMEM/F12 frio-gelado (EMS); Mantenha o EMS em 4 ° c por até 2 semanas. Nota: Execute todas as etapas do revestimento no gelo para impedir a solidificação da matriz da membrana do porão.</li>
		<li>Para a solução de Tyrode, tome 90% do volume final exigido da água da classe da cultura do tecido, adicione a quantidade apropriada dos seguintes reagentes, e mexa até dissolver. Em seguida, use 1 N NaOH para ajustar o pH para 7,4. Adicione água extra a uma concentração final de 140 mmol/L de cloreto de sódio, 1 mmol/L de cloreto de magnésio, 10 mmol/L HEPES, 5 mmol/L de cloreto de potássio, 10 mmol/L de glicose, e 1,8 mmol/L cloreto de cálcio. Esterilizar por filtração, usando uma membrana de 0,22 μm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Revestimento da placa da cultura de pilha
	<ol>
<li>Para placas de cultura hiPSC, aplique 1 mL de EMS a cada poço de uma placa de 6 poços e incubar a placa por pelo menos 1 h a 37 ° c. Aspirar a solução DMEM/F12 antes de semear as células.</li>
		<li>Para o revestimento de gelatina, dissolva 0,2 g de pó de gelatina em água de grau de cultura de tecidos para fazer uma solução de 0,2% (w/v). Esterilizar por autoclavagem a 121 ° c, 15 psi por 30 min. Cubra cada poço de uma placa de 6 poços com 2 mL da solução e incubar por 1 h a 37 ° c. Antes de de as pilhas, aspirar a solução e permitir que a placa seque por pelo menos 1 h na temperatura ambiente dentro da capa da cultura do tecido.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. manutenção hiPSC e Ddiferenciação de cardiomiócitos
<ol><li>Cultura os hiPSCs no meio hiPSC (ver passo 1.1.1) com uma mudança média diária até que as células atinjam 80% – 90% de confluência por poço. Nota: Para fins de manutenção, os hiPSCs estão geralmente prontos para a passagem a cada 4 dias.</li>
	<li>Para a passagem de hiPSCs, aspirar o meio e lavar o poço 1x com 1x fosfato-tampão salino (PBS). Adicionar 0,5 mL de solução de descolamento de células estaminais (tabela de materiais 1) a cada poço e incubar a 37 ° c durante 5 – 7 min. Nota: O tempo de incubação depende da densidade das células e da taxa de dissociação, que pode ser observada um microscópio.</li>
	<li>Neutralize a solução de descolamento de células-tronco com 1 mL de meio hiPSC suplementado com 5 μM Y-27632. Colete a mistura em um tubo de centrífuga de 15 mL. Centrifugue o tubo durante 5 min a 200 x g, Aspire o sobrenadante sem perturbar o pellet celular e, em seguida, ressuscitem as células em 1 ml de meio hipsc contendo 5 μm Y-27632.</li>
	<li>Semente os hiPSCs em um novo EMS-revestido 6-placa bem em uma relação entre 1:6 a 1:18. Mude o meio ao meio do hiPSC sem Y27632 após 24 h.</li>
	<li>Para congelar as células, Ressuspender os hiPSCs dissociados em meio de congelamento em uma concentração de 0,5 – 1 milhão/500 μL, colocar a suspensão em cryovials e armazená-los em um freezer de-80 ° c. Transferir os frascos congelados para nitrogênio líquido após 24 h.</li>
	<li>Para diferenciar, substitua o meio hiPSC por 2 mL de RB-meio suplementado com 10 μM de inibidor GSK-3β CHIR99021 (CHIR) em 80% – 90% de confluência celular. Substitua o meio por 3 mL de RB-meio após 24 h e incubar por um adicional de 48 h (dia 3).</li>
	<li>No dia 3, mude o meio para 3 mL de RB-meio com 10 μM de inibidor de WNT IWR1 para 48 h (dia 5) e, em seguida, substitua o meio com 3 mL de RB-médio e mantenha por 48 h (dia 7).</li>
	<li>No dia 7, substitua o meio com 3 mL de meio RB e mude o meio a cada 3 dias daqui para frente. A batida espontânea de hiPSC-CMs deve ser observada entre os dias 7 – 10.</li>
</ol>3. hiPSC-CMs purificação e pequena molécula pre-tratamento
Nota: Enzimas de dissociação de células recombinantes altamente purificadas (tabela de materiais 1) foram utilizadas para dissociar o hipsc-CMS.
<ol><li>No dia 21 após a diferenciação hiPSC-CM, aspirar o meio e lavar as células 1x com PBS estéril. Incubar as células com 0,5 mL de enzimas de dissociação celular por poço por 5 – 7 min a 37 ° c. Pipeta repetidamente a suspensão da pilha usando uma pipeta de 1 mL a fim dissociar completamente as pilhas.</li>
	<li>Depois que as células são dissociadas, adicione 1 mL de solução de neutralização a cada poço, colete a mistura de células em um tubo de centrífuga de 15 mL e centrifugue a 200 x g por 3 min. descarte o sobrenadante e resuma as células na solução neutralizadora.</li>
	<li>Replantar as células em placas de 6 poços revestidas com gelatina a uma densidade de 2 milhões células por poço.</li>
	<li>Após 24 – 48 h, substitua o meio de cultura por meio de purificação por 3 – 5 dias. Nota: A purificação está completa quando mais de 90% das células em cada campo de visão do microscópio estão batendo. Para evitar mais danos aos cardiomiócitos, não prolongue a duração da purificação além de 5 dias. Se a primeira rodada não produzir a pureza necessária, substitua o meio de purificação por meio de RB + por 1 dia e, em seguida, conclua uma segunda rodada de purificação.</li>
	<li>Antes da transplantação, a cultura as pilhas no grupo do tratamento para 12 h no meio do RB + suplementou com 10 μM Y-27632. Da mesma forma, realizar o tratamento com Verapamil nas células do meio RB + com 1 μM de Verapamil para 12 h (hiPSC-CMs+ Ver).</li>
	<li>Após o tratamento, lave o hiPSC-CMs 1x com PBS e incubar as células com 0,5 mL de enzimas de dissociação de células por poço para um máximo de 2 min. Pipetar repetidamente a suspensão da célula, utilizando uma pipeta de 1 mL, para separar completamente as células. Neutralize as células com solução neutralizante, colete a mistura de células em um tubo de centrífuga de 15 mL e centrifugue a 200 x g durante 3 min. ressuscitem as células em PBS em uma concentração de 100.000 células/5 μL em preparação para injeção.</li>
</ol>4. infarto do miocárdio e transplante de células
Nota: Todos os instrumentos cirúrgicos são saco com autoclave e são mantidos na condição asséptica durante cirurgias múltiplas através de um esterilizador quente do grânulo (tabela dos materiais 2).
<ol><li>Anestesiar camundongos NOD/scid (tabela de materiais 2) com isoflurano inalatório (1,5% – 2%). Monitore os níveis de anestesia pelas respostas dos camundongos a uma pitada de dedo do pé. Coloque o veterinário pomada óptica sobre os olhos para impedi-los de secar durante a cirurgia.</li>
	<li>Forneça 0,1 mg/kg de buprenorfina por via subcutânea para o manejo da dor antes da cirurgia.</li>
	<li>Posicione e prenda o rato em uma posição supina em uma tabela de funcionamento aquecida, remova o cabelo da região ventral da garganta e do tórax esquerdo usando um creme depilatórios, exponha a pele, e desinfecte-o com álcool de 70%.</li>
	<li>Corte uma incisão de 0,5 cm no centro do pescoço usando tesouras cirúrgicas, separe a gordura subcutânea com fórceps estéril e exponha a traquéia. Introduzir oralmente a cânula de intubação na traquéia, conectar a cânula a um pequeno ventilador animal e ajustar as configurações de ventilação (ajustar o volume corrente a 100 – 150 μL e a taxa de respiração a 100x – 150x por minuto).</li>
	<li>Depois que o mouse se estabiliza, corte uma incisão de 0,5 cm no meio da pele do tórax esquerdo. Use fórceps para separar sem rodeios a camada muscular e fazer uma pequena incisão no quinto espaço intercostal para expor a cavidade torácica. Coloque o retractor na incisão para abrir a cavidade torácica e localize a artéria coronária descendente esquerda (LAD). um microscópio cirúrgico de dissecação, ligadura o Lad com um 8-0 sutura não absorvível.</li>
	<li>Imediatamente após a indução da MI, injete 5 μL de hiPSC-CMs-ri, hipsc-CMS+ ri, hipsc-CMS-Ver, hipsc-CMS+ Ver, ou um volume igual de PBS no miocárdio do camundongo em cada local (3 x 105 células/animal, 1 x 105 células/local), um na área do enfarte e dois nas áreas em torno do enfarte. Nota: Desde que 5 μL é volume muito pequeno, não é fácil controlar exatamente o volume sugando-o diretamente com uma seringa. A tampa de um prato de Petri estéril pode ser girado sobre, e 5 μL das pilhas podem primeiramente ser depositados na tampa com uma pipeta. Devido à tensão de superfície, não se espalhará mas condensar-se-á em uma massa líquida pequena. Isso pode ser facilmente absorvido e injetado no miocárdio do mouse.</li>
	<li>Elimine o ar residual na cavidade torácica enchendo-o acima com a solução salina isotônica morna. Costurar as costelas, os músculos e a pele em sequência com uma sutura 6-0 absorvível. Desligue a injeção da anestesia do isoflurano. Mantenha os animais da cirurgia na almofada de aquecimento e observá-los pròxima Quando recuperarem a consciência cheia. Em seguida, coloque os animais em uma gaiola limpa. Não devolva os animais à companhia de outros animais até que estejam totalmente recuperados.</li>
	<li>Após a cirurgia, injete os camundongos intraperitonealmente com buprenorfina (0,1 mg/kg) a cada 12 h durante 3 dias consecutivos e injete-os com ibuprofeno (5 mg/kg) a cada 12 h por um dia. Realize estudos de análise subsequentes em pontos de tempo especificados. Nota: Siga as diretrizes do Comitê de cuidados com animais locais para analgesia.</li>
</ol>5. registro transiente do cálcio e da contractilidade
<ol><li>Autoclave de 15 mm de diâmetro (tabela de materiais 2) e pinças em uma taça de vidro pequeno a 121 ° c, 15 psi por 15 min. precool as lamínulas e pinças a 4 ° c.</li>
	<li>Usando a pinça, coloque a lamínula em uma placa de 12 poços e pipetar 300 μL de matriz extracelular para cada lamínula. Nota: Não deixe que a matriz exceda a borda da lamínula para evitar a redução da quantidade de revestimento da matriz. Incubar a placa de 12 poços em uma incubadora da cultura de célula de 37 ° c por 1 h.</li>
	<li>Aspirar o meio na placa gelatina-revestida de 6 poços com hiPSC-CMs purificado, lave-a 1x com PBS e, em seguida, digerir com 0,5 mL de enzimas de dissociação de células por 1,5 min. Adicione 1 mL de solução de neutralização, pipetar repetidamente para não mais do que 5x – 10x com uma pipeta de 1 mL e centrifugue a mistura a 200 x g durante 3 min.</li>
	<li>Aspirar a matriz extracelular revestida dos lamínulas. Conte o número da célula e ressuscitem as células na solução de neutralização para uma concentração de 40000/300 μL e, em seguida, adicione 300 μL da suspensão da célula em cada lamínula. Cultura da placa em uma incubadora de 37 ° c.</li>
	<li>Após 24 h, aspire suavemente a solução neutralizada, adicione 500 μL de meio RB + a cada poço da placa e continue a cultura por 2 dias.</li>
	<li>Adicionar Y-27632 (10 μM), ativador Rho quinase (RA, 100 nM), verapamil (1 μM), ou um volume igual de PBS no meio de cultura de hiPSC-CMs, 12 h antes de detecção de transiente e contratilidade de cálcio. Nota: Além da detecção de transientes e contratilidade de cálcio das células após 12 h de tratamento químico, a detecção desses parâmetros também foi testada em 12, 24, 48 e 72 h após a retirada química.</li>
	<li>Retire a placa, descarte o meio, e lave a placa 1x com PBS. Mude o meio a um DMEM fenol-vermelho-livre que contem 0, 2% (w/v) do poliol do surfactante (tabela dos materiais 1), do indicador do cálcio de 5 μm (tabela dos materiais 1), e do Y-27632 correspondente (10 μm), ra (100 nanômetro), verapamil (1 μm), ou um volume igual de PBS, e incubar a placa por 30 min a 37 ° c.</li>
	<li>Descarte o sobrenadante, lave as células 3x com meio DMEM livre de corante e deixe o meio descansar por 30 min para desesterificar o corante de mapeamento.</li>
	<li>Coloc o lamela pilha-semeado em uma câmara aberta do banho e insira a câmara em um sistema da microincubação equilibrado a 37 ° c com um controlador de temperatura automático (tabela dos materiais 2), perfuse-o com a solução de Tyrode, e adicione continuamente Inibidor da Rho-quinase (RI), ar ou PBS à solução de perfusão.</li>
	<li>Use um microscópio de fluorescência invertido (tabela de materiais 2) e uma cabeça da exploraçãodo laser (tabela dos materiais 2) para gravar o transiente espontâneo do cálcio empregando uma varredura da linha de x-t, usando um laser do argão de 488 nanômetro para a excitação da tintura e um 515 ± 10 nanômetro filtro de barreira para coletar luz de emissão. Registre a contração espontânea de hiPSC-CMs usando a funcionalidade de contraste de interferência diferencial do microscópio confocal (tabela de materiais 2). Nota: As gravações transientes de cálcio foram processadas e analisadas com o uso do software MATLAB R2016A (tabela de materiais 4). Os ensaios de mudança de contração celular foram realizados utilizando-se o software ImageJ (tabela de materiais 4).</li>
</ol>

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<li>Lelievre, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-cadherin+mediates+neuronal+cell+survival+through+Bim+down-regulation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">N-cadherin mediates neuronal cell survival through Bim down-regulation.</a> PLoS One. 7 (3), e33206(2012).</li>
<li>Murata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increase+in+cell+motility+by+carbon+ion+irradiation+via+the+Rho+signaling+pathway+and+its+inhibition+by+the+ROCK+inhibitor+Y-27632+in+lung+adenocarcinoma+A549+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Radiation+Research%22%5BJournal%5D)">Increase in cell motility by carbon ion irradiation via the Rho signaling pathway and its inhibition by the ROCK inhibitor Y-27632 in lung adenocarcinoma A549 cells.</a> Journal of Radiation Research. 55 (4), 658-664 (2014).</li>
<li>Srivastava, K., Shao, B., Bayraktutan, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PKC-beta+exacerbates+in+vitro+brain+barrier+damage+in+hyperglycemic+settings+via+regulation+of+RhoA%2FRho-kinase%2FMLC2+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">PKC-beta exacerbates in vitro brain barrier damage in hyperglycemic settings via regulation of RhoA/Rho-kinase/MLC2 pathway.</a> Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 33 (12), 1928-1936 (2013).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Os principais passos deste estudo incluem a obtenção de Hisc-CMs puro, melhorando a atividade do hiPSC-CMs através do pré-tratamento Y-27632 e, finalmente, transplantar uma quantidade exata de hiPSC-CMs em um modelo de MI do mouse.
As principais questões abordadas aqui foram que, primeiro, otimizamos os métodos de purificação sem glicose19 e estabelecemos um novo sistema de purificação eficiente. O procedimento de sistema incluiu a aplicação de enzimas de dissociação ce...

As terapias baseadas em células-tronco mostraram um potencial considerável como um tratamento para danos cardíacos causados pelo MI1. O uso de hiPSCs diferenciados fornece uma fonte inesgotável de hiPSC-CMs2 e abre a porta para o rápido desenvolvimento de tratamentos inovadores. Entretanto, muitas limitações à tradução terapêutica permanecem, incluindo o desafio da taxa severamente baixa do Engraftment de pilhas implantadas.
Dissociar células com tripsina inicia anoikis3, que só é acelerado uma vez que estas células são injetadas em ambientes agressivos como o miocárdio isquêmico, onde o ambiente hipóxico acelera o curso em direção à morte celular. Das células remanescentes, uma grande proporção é lavada do local de implantação para a corrente sanguínea e se espalhou por toda a periferia. Uma das principais vias apoptóticas é a via RhoA/ROCK4. Com base em pesquisas anteriores, a via Rhoa/rock regula a organização citoesquelética actina5,6, que é responsável pela disfunção celular7,8. O inibidor da rocha Y-27632 é amplamente utilizado durante a dissociação e passaging de células estéticas e somáticas, para aumentar a adesão celular e reduzir a apoptose celular9,10,11. Neste estudo, o Y-27632 é usado para tratar o hiPSC-CMs antes da transplantação na tentativa de aumentar a taxa do Engraftment da pilha.
Vários métodos destinados a melhorar a taxa de Engraftment celular, tais como choque térmico e revestimento da matriz de membrana basal12, foram estabelecidas. Além desses métodos, a tecnologia genética também pode promover a proliferação de cardiomiócitos13 ou células não miocárdicas reversas em cardiomiócitos14. Do ponto de vista da bioengenharia, os cardiomiócitos são semeados em um andaime biomaterial para melhorar a eficiência do transplante15. Infelizmente, a maioria destes métodos são complicados e dispendiosos. Pelo contrário, o método proposto aqui é simples, econômico e efetivo, podendo ser utilizado como tratamento basal antes do transplante, bem como na conjugação com outras tecnologias.

<table><tbody><tr><td>Reagente</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Accutase (solução de descolamento de células-tronco)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>#07920</td><td></td></tr><tr><td>B27 menos insulina</td><td>Fisher Scientific</td><td>A1895601</td><td></td></tr><tr><td>B27 Suplemento</td><td>Fisher Scientific</td><td>17-504-044</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>72054</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (1x), glicose alta, HEPES, sem vermelho de fenol</td><td>Thermofisher</td><td>20163029</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM (indicador de cálcio)</td> <td>Invitrogen/Thermofisher</td><td>F14201</td><td></td></tr><tr><td>RPMI sem glicose 1640</td><td>Fisher Scientific</td><td>11879020</td><td></td></tr><tr><td>IWR1</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>72562</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel (matriz extracelular)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>CB-40230C</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR (meio de células-tronco pluripotentes humanas)</td> <td>STEMCELL Technologies</td><td>85850</td><td></td></tr><tr><td>Antibiótico Pen-strep</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-140-122</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127 (poliol surfactante)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443</td><td></td></tr><tr><td>Rho ativador II</td><td>Citoesqueleto</td><td>CN03</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640</td><td>Fisher Scientific</td><td>11875119</td><td></td></tr><tr><td>DL-lactato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4263</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE (enzimas de dissociação celular)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-605-010</td><td></td></tr><tr><td>Verapamil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V4629</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72304</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de Catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Equipamentos e Suprimentos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IVIS Lumina III Bioluminescence Instruments</td><td>PerkinElmer</td><td>CLS136334</td><td></td></tr><tr><td>15 mm Coverslips</td><td>Warner</td><td>CS-15R15</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5415R</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Confocal</td><td>Olympus</td><td>IX81</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Thermo Scientific</td><td>NX50</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de Temperatura Automático Duplo Warner</td><td>Instruments</td><td>TC-344B</td><td></td></tr><tr><td>Fonte de Alimentação de Eletroforese</td><td>BIO-RAD</td><td>1645050</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de Fluorescência</td><td>Olympus</td><td>Câmera de alta velocidade IX83</td><td></td></tr><tr><td></td><td>pco</td><td>1200 s</td><td></td></tr><tr><td>Cabeça de varredura a laser</td><td>Olympus</td><td>FV-1000</td><td></td></tr><tr><td>Câmara de banho aberta de baixo perfil (monta no sistema de microincubação acima)</td> <td>Warner Instruments</td><td>RC-42LP</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de Microincubação</td><td>Warner Instruments</td><td>DH-40iL</td><td></td></tr><tr><td>Minivent Mouse Ventilador</td><td>Harvard Aparelho</td><td>845</td><td></td></tr><tr><td>camundongos NOD/SCID</td><td>Jackson Laboratory</td><td>001303</td><td></td></tr><tr><td>Géis de proteína pré-moldados</td><td>BIO-RAD</td><td>4561033</td><td></td></tr><tr><td>Pacotes de transferência de PVDF</td><td>BIO-RAD Sistema</td><td>Trans-Blot 1704156</td><td></td></tr><tr><td></td><td>BIO-RAD</td><td>Trans-Blot Turbo</td><td></td></tr><tr><td>Esterilizador de esferas quentes</td><td>Ferramentas de ciência fina</td><td>18000-45</td><td></td></tr><tr><td> Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Anticorpo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nucleolina anti-humana (Alexa Fluor 647)</td><td>Abcam</td><td>ab198580</td><td></td></tr><tr><td>Troponina cardíaca T</td><td>R& D Systems</td><td>MAB1874</td><td></td></tr><tr><td>Troponina Cardíaca C</td><td>Abcam</td><td>ab137130</td><td></td></tr><tr><td>Troponina Cardíaca I</td><td>Abcam</td><td>ab47003</td><td></td></tr><tr><td>Cy5-burro anti-rato</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratory</td><td>715-175-150</td><td></td></tr><tr><td>Cy3-burro anti-coelho</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratory</td><td>711-165-152</td><td></td></tr><tr><td>Fitc-burro anti-rato</td><td>Jackson Integrina</td> cardíaca humana Abcam ab91605 da troponina cardíaca humana <td>Abcam ab91605 do laboratório 715-095-150</td><td></td>de ImmunoResearch</tr><tr><td></td><td>Abcam</td><td>ab22555</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>;<td></td></tr><tr><td> 1</td><td>Abcam</td><td>ab24693</td><td></td></tr><tr><td>Ki67</td><td>EMD Millipore</td><td>ab9260</td><td></td></tr><tr><td>N-caderina</td><td>Abcam</td><td>ab18203</td><td></td></tr><tr><td>Cadeia Leve de Fosfo-Miosina 2</td><td>Tecnologia de Sinalização de Células</td><td>3671s</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de Catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>MathWorks</td><td>R2016A</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>1.52g</td><td></td></tr></tbody></table>

melhorar o engraftment de cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por uma inibição transitória da atividade da rho kinase

Enhancing the Engraftment of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes via a Transient Inhibition of Rho Kinase Activity

Um fator crucial na melhoria da eficácia da terapia celular para a regeneração miocárdica é de forma segura e eficiente aumentar a taxa de Engraftment celular. Y-27632 é um inibidor altamente potente da proteína quinase (RhoA/ROCK) associada a Rho, coiled-coil, e é usada para prevenir a apoptose celular induzida por dissociação (anoikis). Nós demonstramos que o pré-tratamento de Y-27632 para os cardiomiócitos pluripotentes induzidos humanos da pilha de haste (hiPSC-CMs+ ri) antes da implantação conduz a uma melhoria da taxa do Engraftment da pilha em um modelo do rato do infarction miocárdico agudo (MI). Aqui, nós descrevemos um procedimento completo da diferenciação, da purificação, e do pré-tratamento da pilha do hiPSC-CMs com Y-27632, assim como a contração resultante da pilha, as medidas transientes do cálcio, e a transplantação em modelos do rato MI. O método proposto fornece um método simples, seguro, eficaz e de baixo custo que aumenta significativamente a taxa de Engraftment celular. Este método não pode somente ser usado conjuntamente com outros métodos para realçar mais a eficiência da transplantação da pilha mas igualmente fornece uma base favorável para o estudo dos mecanismos de outras doenças cardíacas.

O hiPSC-CMs usado neste estudo foi derivado da origem humana com o gene do repórter do luciferase; Conseqüentemente, a taxa de sobrevivência das pilhas transplantadas in vivo foi detectada pela imagem latente do bioluminescência (bli)17 (Figura 1a, B). Para as seções histológicas do coração, a troponina cardíaca humana-específica T (hctnt) e o antígeno nuclear humano (HNA) pilhas dobro-positivas foram classific como o ...

Neste protocolo, podemos demonstrar e elaborar sobre como usar células-tronco pluripotentes induzidas por humanos para diferenciação e purificação de cardiomiócitos, e ainda, sobre como melhorar sua eficiência de transplante com inibidor de proteína quinase associada a Rho pré-tratamento em um modelo de infarto do miocárdio do camundongo.

Melhorar o Engraftment de cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por uma inibição transitória da atividade da Rho kinase

A crucial factor in improving cellular therapy effectiveness for myocardial regeneration is to safely and efficiently increase the cell engraftment rate. ...

Nossos dados demonstram que a inibição transitória da atividade rho-quinase aumenta a adesão, sobrevivência e engrafamento de cardiomiócitos derivados do hiPSC após serem transplantados nos corações animais infartados. Fornecemos um método simples, de baixo custo, enquanto altamente eficiente para aumentar o enxerto de cardiomiócitos transplantados derivados de hiPSC nos corações animais feridos. Como essa técnica pode melhorar as taxas de enxercimento celular de forma segura e eficiente em infarto cardíaco agudo e insuficiência cardíaca, contribui para as melhorias resultantes na função cardíaca, vasculares e apoptose.Embora só tenhamos testado nossos protocolos em hiPSCs, esses métodos podem ser aplicados a outros tipos de células, como células-tronco embrionárias, células-tronco mesenquimais, etc. A dose e duração do tratamento Y-27632 é crítica. A demonstração visual pode demonstrar em grande detalhe todos os passos-chave do protocolo, o que é benéfico para alguém que nunca realizou essa técnica antes.No dia 21, após a diferenciação hiPSC-CM, aspire o meio e lave as células com PBS estéril uma vez. Incubar as células com 0,5 mililitros de enzimas de dissociação celular por poço a 37 graus Celsius por cinco a sete minutos. Após o tempo de incubação, pipeta repetidamente a suspensão celular usando uma pipeta de um mililitro, a fim de dissociar completamente as células.Em seguida, adicione um mililitro de solução neutralizante a cada poço, colete a mistura celular em um tubo de centrífuga de 15 mililitros e centrífuga a 200 vezes g por três minutos. Após a centrifugação, descarte o supernasce e resuspenque as células na solução neutralizante. Em seguida, replante as células em placas revestidas de gelatina, seis poços a uma densidade de dois milhões de células por poço.Após 24 a 48 horas, substitua o meio de cultura pelo meio de purificação por três a cinco dias. Antes do transplante, cultura as células do grupo de tratamento por 12 horas em RB-plus médio suplementado com 10-micromolar Y-27632. Da mesma forma, realize o tratamento verapamil nas células do meio RB-plus com um micromole de verapamil por 12 horas.Após o tratamento, lave os hiPSC-CMs com PBS uma vez, e incuba as células com 0,5 microliters de enzimas de dissociação celular por poço por um máximo de dois minutos. Pipeta repetidamente a suspensão celular usando uma pipeta de um mililitro para dissociar completamente as células. Em seguida, neutralizar as células com solução neutralizante, coletar a mistura celular em um tubo de centrífuga de 15 mililitros e centrífugas a 200 vezes g por três minutos.Após a centrifugação, resuspengue as células em PBS a uma concentração de 0,1 milhão de células por cinco microliters em preparação para a injeção. Imediatamente após a indução do infarto do miocárdio, injete cinco microliters de controle hiPSC-CMs, Y-27632-pré-tratado hiPSC-CMs, hiPSC-CMs tratados com verapamil, ou um volume igual de PBS no miocárdio do camundongo em cada local, um na área de infarto e dois nas áreas ao redor do infarto. 12 horas antes de realizar a detecção transitória e contralute de cálcio, adicione 10 micromolar Y-27632, 100-nanomolar RA, verapamil de um micromolar, ou um volume igual de PBS no meio de cultura de hiPSC-CMs.Em seguida, descarte o meio e lave a placa com PBS uma vez. Altere o DMEM médio para um DMEM sem fenol contendo 0,02 peso por volume por cento do políil surfactante, indicador de cálcio de cinco micromolares e o Y-27632 correspondente, RA, verapamil, ou um volume igual de PBS, e incubar a placa a 37 graus Celsius por 30 minutos. Após a incubação, descarte o supernasce, lave as células com o DMEM sem corante três vezes e deixe o meio descansar por 30 minutos para desesmagizar o corante de mapeamento.Coloque o deslizamento de cobertura semeado por células em uma câmara de banho aberta e insira a câmara em um sistema de microincubstura equilibrado a 37 graus Celsius com um controlador de temperatura automático. Perfumá-lo com a solução de Tyrode e adicione continuamente RI, RA ou PBS à solução de perfusão. Use um microscópio de fluorescência invertida e uma cabeça de varredura a laser para registrar um transitório de cálcio espontâneo, empregando uma varredura de linha X-T.Regissocular a contração espontânea de hiPSC-CMs utilizando a funcionalidade de contraste de interferência diferencial do microscópio confocal. A taxa de sobrevivência das células transplantadas foi confirmada pelo aumento da atividade da luciferase. O aumento da troponina cardíaca t e a expressão do antígeno nuclear humano mostraram que o pré-tratamento Y-27632 poderia melhorar significativamente a taxa de enxercimento celular.As células pré-tratadas Y-27632 apresentaram uma estrutura citoesquelélada maior e mais definida em forma de vara. Além disso, o pré-tratamento Y-27632 diminuiu as células tunel-positivas, indicando a redução da apoptose hiPSC-CM transplantada in vivo. A mancha ocidental sugeriu que o pré-tratamento Y-27632 aumentou a expressão de beta-1 e N-cadherin integrin e diminuiu a expressão da cadeia de luz fosfo-miosina 2.Essa mudança foi normalizada 72 horas após a retirada do Y-27632. Experimentos in vitro de fixação de células HL-1 indicaram que o pré-tratamento Y-27632 aumentou significativamente a adesão do hiPSC-CM em relação ao HL-1. O pré-tratamento Y-27632 reduziu a força contratil, o pico da fluorescência transitória do cálcio e a duração transitória do cálcio.Y-27632 pré-tratamento regulado contração de cardiomiócitos reduzindo significativamente a expressão de 2008 e cTnT. Semelhante ao Y-27632, o pré-tratamento verapamil aumentou a atividade da luciferase e o número de células hcTnT/HNA duplamente positivas. O passo mais importante é cultivar as células do grupo de tratamento por 12 horas em rb-plus médio suplementado com 10-micromolar Y-27632.Com base neste método, a liberação lenta do Y-27632 para aumentar ainda mais a taxa de enxerximento celular é uma estratégia promissora. Essa técnica abre caminho para os pesquisadores estudarem a fisiologia e a função do hiPSC dos CMs in vivo. A pequena molécula CHIR99021 usada para diferenciação de cardiomiócitos é perigosa, o que pode causar irritação respiratória.Por favor, não ingestão ou inalar de forma alguma.

enhancing-engraftment-human-induced-pluripotent-stem-cell-derived

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Nós estabelecemos um protocolo para indução de cardioblasts direta de pluripotentes células estaminais embrionárias humanas mantidas sob condições definidas com pequenas moléculas, que permite a derivação de uma grande oferta de recursos humanos progenitores cardíaca e funcional cardiovascular cardiomiócitos para reparação.

Derivação eficiente dos recursos humanos Precursores cardíaca e Cardiomyocytes pluripotentes a partir de células estaminais embrionárias humanas com a indução de moléculas pequenas

Células-tronco pluripotentes, tanto as células-tronco embrionárias ou pluripotentes induzidas (iPS), constituem uma valiosa fonte de células diferenciadas humanos, incluindo os cardiomiócitos. Aqui, vamos nos concentrar na indução cardíaco de células iPS, mostrando como usá-los para obter os cardiomiócitos humanos funcionais através de um protocolo de corpos baseada embryoid.

Geração de cardiomiócitos Humanos: Um Protocolo de Diferenciação de Feeder livres Humanos células-tronco pluripotentes induzidas

Entrega célula intramio em modelos murinos de doenças cardiovasculares, como a hipertensão ou o enfarte do miocárdio, é amplamente utilizado para testar o potencial terapêutico de diferentes tipos celulares em estudos de regeneração. Portanto, uma descrição detalhada e uma visualização clara deste procedimento cirúrgico ajudará a definir os limites e as vantagens das análises terapêuticas celulares cardiovasculares em pequenos roedores.

Entrega celular intramiocárdico: Observações em murino Corações

O artigo descreve a metodologia detalhada para diferenciar de forma eficiente as células estaminais pluripotentes em cardiomiócitos de modular selectivamente a via Wnt, seguido por análise de citometria de fluxo de marcadores de referência para avaliar a homogeneidade e a identidade da população.

Diferenciação de alta eficiência de pluripotentes humanas células-tronco para Cardiomyocytes e Caracterização por citometria de fluxo

Aqui, descrevemos um protocolo robusto para derivação de cardiomiócitos humanos que combina diferenciação cardíaca modulada por pequenas moléculas e purificação de cardiomiócitos mediada por privação de glicose, permitindo a produção de cardiomiócitos purificados para fins de modelagem de doenças cardiovasculares e triagem de drogas.

Derivação de Cardiomyocytes altamente purificada de induzidas pelo homem pluripotentes células estaminais usando pequenos Diferenciação modulada-Molecule e Subsequente Glucose Fome

Apresentamos três protocolos de novos e mais eficientes para a diferenciação de células estaminais pluripotentes humanas induzida em cardiomiócitos, células endoteliais, e células do músculo liso e um método de entrega que melhora o enxerto de células transplantadas através da combinação de injecção das células com citocinas entrega mediada por remendo.

Pluripotentes Stem Cell Derivado células cardíacas para reparo do miocárdio

Aqui nós apresentamos um método robusto para reprogramar fibroblastos embrionários primários em cardiomyocytes funcional através de superexpressão de GATA4 Hand2, Mef2c, Tbx5, miR-1 e miR-133 (GHMT2m) juntamente com a inibição da sinalização do TGF-β. Nosso protocolo gera cardiomyocytes bater tão cedo quanto pós-transdução de 7 dias com até 60% eficiência.

Supressão de sinalização pró-fibróticos potencializa mediada por fator de reprogramação de fibroblastos embrionários de rato em Cardiomyocytes induzida

Aqui, apresentamos um protocolo para gerar e expandir robustamente os cardiomiócitos humanos a partir de células mononucleares de sangue periféricos do paciente.

Geração e Expansão de Cardiomiócitos Humanos a partir de células mononucleares de sangue periféricos do paciente

A entrega celular guiada por ultrassom ao redor do local do infarto do miocárdio em camundongos é uma maneira segura, eficaz e conveniente de transplante de células.

Implante de Cardiomiócitos Derivados de Células-Tronco Pluripotentes Induzidos por Ultrassom em Camundongos Infartados do Miocárdio

Os cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos (hiPSC-CMs) oferecem uma alternativa ao uso de animais para triagem pré-clínica de cardiotoxicidade. Uma limitação à adoção generalizada de hiPSC-CMs na triagem pré-clínica de toxicidade é o fenótipo imaturo e semelhante ao fetal das células. São apresentados protocolos para maturação robusta e rápida de hiPSC-CMs.

Triagem de cardiotoxicidade de alto rendimento usando monocamadas de cardiomiócitos derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos maduros

O uso da luz para controlar células e tecidos cardíacos permite a estimulação sem contato, preservando assim o estado natural e a função das células, tornando-se uma abordagem valiosa tanto para pesquisa básica quanto para aplicações terapêuticas.

Um sistema microfisiológico cardíaco para estudar a propagação de Ca2+ via estimulação óptica não genética

Aprenda a melhorar o engraftment de cardiomiócitos derivados de hiPSCs usando inibição transitória da Rho kinase em modelo de infarto do miocárdio. Este protocolo eficiente aumenta a adesão e sobrevivência celular.

Melhorar o Engraftment de cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por uma inibição transitória da atividade da Rho kinase (Vídeo) | JoVE Journal

Melhorar o Engraftment de cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por uma inibição transitória da atividade da Rho kinase

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