Name: Avaliação da multiplicidade sináptica usando células inteiras Patch-clamp eletrofisiologia (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-23T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: Aprenda a avaliar multiplicidade sináptica em neurônios usando eletrofisiologia de patch-clamp de célula inteira em fatias cerebrais agudas. Este protocolo permite estimar contatos sinápticos múltiplos em diversas espécies e regiões cerebrais.

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J.S. recebeu bolsa de pós-graduação de Ontário. Wi recebeu uma nova bolsa de investigador de pesquisa de Saúde Mental do Canadá. Este trabalho é apoiado por subvenções de funcionamento para Wi de ciências naturais e engenharia Conselho de pesquisa do Canadá (06106-2015 RGPIN) e o Instituto Canadense para pesquisa em saúde (PJT 148707).

Todas as experiências com animais são aprovadas na Comissão de cuidado Animal da Universidade de Ontário ocidental em conformidade com o Conselho canadense sobre orientações de cuidado Animal (AUP #2014-031).
1. soluções
<ol><li>
Solução de corte
	<ol>
<li>Consulte a tabela 1 para a composição da solução de corte.</li>
		<li>Preparar uma solução stock de 20x com antecedência e armazená-lo em 4 ° C por até 1 mês.</li>
		<li>Para 1 x solução fatiamento, dissolver NaHCO3, glicose e sacarose em ddH2O e adicione o caldo de 20x. Garantir que a osmolaridade é entre 315-320 mOsm e armazenar a solução para não mais de 1 semana a 4 ° C.</li>
		<li>Encha dois copos com 100 mL de solução de corte e cubra-os com parafilme. Refrigere a solução em um freezer até a solução torna-se parcialmente congelada (cerca de 20 min no freezer-80 ° C). Usando um tubo de dispersão de gás, bolha dois copos de fatiar a solução com 95% O25% CO2 por 20 min no gelo.</li>
	</ol>
</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="5">Concentrações de solução (mM)</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>De corte</td>
			<td>ACSF normal</td>
			<td>Baixa de Ca2 + aCSF</td>
			<td>ACSF Sr+</td>
			<td>Pipeta/interno</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaCl</td>
			<td>87</td>
			<td>126</td>
			<td>126</td>
			<td>126</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>KCl</td>
			<td>2.5</td>
			<td>2.5</td>
			<td>2.5</td>
			<td>2.5</td>
			<td>8</td>
		</tr>
<tr>
<td>CaCl2
</td>
			<td>0,5</td>
			<td>2.5</td>
			<td>0,5</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>SrCl2
</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>2.5</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2
</td>
			<td>7</td>
			<td>1.5</td>
			<td>2.5</td>
			<td>1.5</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaH2PO4
</td>
			<td>1.25</td>
			<td>1.25</td>
			<td>1.25</td>
			<td>1.25</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaHCO3
</td>
			<td>25</td>
			<td>26</td>
			<td>26</td>
			<td>26</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glicose</td>
			<td>25</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sacarose</td>
			<td>75</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>K-gluconato</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>116</td>
		</tr>
<tr>
<td>At-gluconato</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>12</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>K2-EGTA</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>K2ATP</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>4</td>
		</tr>
<tr>
<td>At3GTP</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>0.3</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: Composição de várias soluções.
<ol start="2"><li>
aCSF (para manutenção e recuperação de fatia)
	<ol>
<li>Consulte a tabela 1 para a composição da aCSF.</li>
		<li>Preparar uma solução stock de 20x com antecedência e armazená-lo em 4 ° C por até 1 mês.</li>
		<li>Para 1 x aCSF, dissolver NaHCO3 e glicose em ddH2O e adicione o caldo de 20x. Garantir que a osmolaridade é entre 298-300 mOsm. Utilize a solução dentro de 1 dia.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
aCSF (baixo Ca2 + para gravação)
	<ol>
<li>Consulte a tabela 1 para a composição da Ca2 + aCSF baixa.</li>
		<li>Preparar uma solução stock de 20x com antecedência e armazená-lo em 4 ° C por até 1 mês.</li>
		<li>Para 1 x baixo Ca2 + aCSF, dissolver NaHCO3 e glicose em ddH2O e adicionar 20 x (CaCl2 e MgCl2 grátis) estoque, CaCl2 e MgCl2 para especificado concentrações. Garantir que a osmolaridade é entre 298-300. Utilize a solução dentro de 1 dia.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
aCSF (Sr2 + para gravação)
	<ol>
<li>Consulte a tabela 1 para a composição do Sr2 + aCSF.</li>
		<li>Preparar uma solução stock de 20x com antecedência e armazená-lo em 4 ° C por até 1 mês.</li>
		<li>Para 1 x Sr2 + aCSF, dissolver NaHCO3 e glicose em ddH2O e adicionar 20 x (CaCl2 e MgCl2 grátis) estoque, SrCl2 e MgCl2 para especificado concentrações. Garantir que a osmolaridade é entre 298-300. Utilize a solução dentro de 1 dia.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Solução interna
	<ol>
<li>Consulte a tabela 1 para a composição da solução interna com base K-gluconato.</li>
		<li>Para fazer 20 mL da solução interna, adicione 15 mL de água de grau de biologia molecular para um tubo de 50 mL. Execute as etapas subsequentes no gelo.</li>
		<li>Prepare as seguintes soluções antes do tempo para concentrações estoque de 1 M em biologia molecular da classe água. Adicionar (em mL): 2,32 K-gluconato, at-gluconato 0,24, 0,20 HEPES, 0.16 KCl, 0.05 K2-EGTA, 0,04 MgCl2 para o tubo de 50 mL.</li>
		<li>Adicione 100 µ l de 0,3 M AT3GTP.</li>
		<li>Pesar 44,08 mg de K2ATP em um tubo de microcentrifugadora de 2 mL e adicionar 1 mL de água de grau de biologia molecular e, em seguida, adicionar ao tubo de 50 mL.</li>
		<li>Ajuste o pH para 7,2-7,4 com 1m KOH. Garantir que a osmolaridade é entre 283-289 mOsm.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. preparação da fatia
<ol><li>
Preparar ferramentas
	<ol>
<li>Adicionar 200 mL de aCSF para a câmara de recuperação (construída a partir de um copo de 250 mL com 4 poços e rede) e coloque a câmara de recuperação em um banho de água (35 ° C).</li>
		<li>Cobrir a câmara com uma película de parafina e bolha constantemente a aCSF com 95% O25% CO2 usando um tubo de vidro dispersão pelo menos 20 min.</li>
		<li>Prepare-se para a dissecação, configurando as ferramentas (bisturi, tesoura bem angulada, pinça, pincel fino, colher de plástico).</li>
		<li>Encha uma seringa de 60 mL com cerca de 15 mL da solução gelada fatia da etapa 1.1.4.</li>
		<li>Prepare a plataforma de dissecação, colocando um papel de filtro na tampa de um prato bem.</li>
		<li>Prepare a câmara de corte colocando-o na bandeja de gelo e enchendo a bandeja de gelo.</li>
		<li>Configurar o vibratome, fixando uma lâmina descartável em porta-lâmina.</li>
		<li>Fazer uma pipeta de transferência, quebrando a ponta de uma pipeta Pasteur e colocando um bulbo de borracha sobre a extremidade quebrada.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Dissecar o cérebro de rato
	<ol>
<li>Anestesia o animal numa câmara saturada com 4% de isoflurano até os reflexos da coluna vertebral estão ausentes.</li>
		<li>Decapitar o animal usando uma guilhotina e remover rapidamente o cérebro.<ol>
<li>Fazer uma incisão com uma lâmina de bisturi n º 22 de rostral ao caudal.</li>
			<li>Lateralmente, descasca o couro cabeludo em cada lado da cabeça.</li>
			<li>Bem de uso de tesoura para cortar o crânio de um lado de caudal para rostral (incluindo o lado dos ossos frontal), usando o cuidado para não danificar o cérebro.</li>
			<li>Uso de fórceps para levantar o pedaço do crânio fora o cérebro e esfriar rapidamente o cérebro com 15 mL de solução de corte gelada utilizando a seringa da etapa 2.1.4.</li>
			<li>Levante o cérebro o crânio.</li>
			<li>Lugar do cérebro em um dos copos cheios de solução gelada de corte (da etapa 1.1.4) borbulhava com 95% O25% CO2.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Prepare fatias de hipotálamo de rato
	<ol>
<li>Bloquear o cérebro para a área do cérebro desejado e ângulo de corte (por exemplo, para coronais hipotalâmicas fatias, retire o tecido do quiasma rostral e caudal a ponte usando uma lâmina e assegurar o caudal bloco tem uma superfície plana perpendicular à base do cérebro).</li>
		<li>Usando um pedaço de papel de filtro, pegar o cérebro do lado anterior e cola no lado posterior para a chapa de suporte usando a cola instantânea.</li>
		<li>Rapidamente Coloque a placa de exploração para a câmara de fatiamento e encha a câmara com a solução de corte do segundo copo na etapa 1.1.4.</li>
		<li>Fixe o corte câmara e gelo a bandeja sobre o vibratome.</li>
		<li>Definir a área de corte (anterior e posterior do cérebro) e começar a cortar 250 µm fatias coronais de espessura. Parâmetros recomendados: 0.10 mm/s, amplitude de velocidade 2 mm.</li>
		<li>Apare as fatias para o tamanho apropriado para a área do cérebro desejado.</li>
		<li>Recupere as fatias a 35 ° C por 30-45 min. Em seguida, remova a câmara de recuperação do banho de aquecimento e permitir que as fatias recuperar a temperatura para um adicional de 30 min. fatias de manter a temperatura do quarto para o resto do dia e continuam a bolha banho constantemente com 95% O25% CO2 .</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. células inteiras Patch ClampRecording
<ol><li>
Puxe as remendo de pipetas
	<ol>
<li>Usando os parâmetros sugeridos para a célula inteira de gravação do manual do extrator a pipeta, puxe pipetas de remendo de paredes de espessura de vidro para uma resistência de pipeta de 3-5 MΩ.</li>
		<li>Usando uma microsseringa (comercial ou caseiro), preencher uma ponta da pipeta com a solução filtrada interna. Para fazer uma microsseringa, queimar a ponta de uma seringa de 1 mL e permitir que a ponta cair criando uma multa longa ponta.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Obter a configuração de células inteiras
	<ol>
<li>A pipeta de gravação apenas acima da pipeta fatia e deslocamento local atual no modo de grampo de tensão. Aplique uma ligeira pressão positiva para a pipeta e fechar a torneira.</li>
		<li>Selecione uma célula saudável com uma membrana intacta e abordagem a célula com a pipeta. A pressão positiva deve causar uma perturbação ligeira no tecido (ou seja, uma onda lenta no tecido quando entrar).</li>
		<li>Lentamente continue a trazer a pipeta mais próximo à célula usando um movimento diagonal até a pipeta constitui uma pequena ondulação na superfície da célula.</li>
		<li>Libere o bloqueio de pressão positiva. O celular vai começar a formar um selo e a resistência aumentará acima de 1 GΩ. No grampo de tensão, segure o celular na-68 mV.</li>
		<li>Se afastar ligeiramente a célula diagonalmente para remover o excesso de pressão da célula.</li>
		<li>Compensa a capacitância de pipeta rápidas e lentas.</li>
		<li>Aplica uma breve aspiração através do tubo conectado ao titular da pipeta para romper a célula e obter configuração de células inteiras.</li>
		<li>Mude para o modo de célula na membrana teste janela em uma eletrofisiologia, aquisição de dados e software de análise (por exemplo, Clampex).</li>
		<li>Antes de cada grampo de tensão gravar, executar um teste de membrana, usando o mesmo software e gravar os parâmetros relevantes em um livro de laboratório (membrana resistência, acesso e da capacidade).</li>
		<li>Manter a temperatura do banho gravação 27 – 30 ° c e a taxa de fluxo em 1.5-2.0 mL/min para experiências posteriores.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. a multiplicidade experiências
<ol><li>
Experimento 1: estimativa de multiplicidade usando 4-AP
	<ol>
<li>No grampo de tensão, segure o celular na-68 mV. Usando o mesmo software, grave o sEPSCs enquanto perfusing o banho com baixa Ca2 + aCSF. Recorde pelo menos 5 min após o início da configuração de células inteiras para garantir uma gravação da linha de base estável como a atividade sináptica pode ser alta logo após a descoberta da membrana.</li>
		<li>Utilizando uma micropipeta, adicione 4-AP para a aCSF e banho aplicar 30 µM 4-AP. sEPSCs de registro pelo menos 10 min obter o efeito completo de drogas.</li>
		<li>Adicionar 0,5 µM TTX e 10 µM Cd2 + a aCSF com 4-AP e gravar o mEPSCs pelo menos 10 min.</li>
		<li>Para análise off-line, use o último 1 min de linha de base imediatamente antes da aplicação de 4-AP (em baixo Ca2 + aCSF), a 10 min de aplicação 4-AP e a 10 min de aplicação TTX.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Experimento 2: desynchronize liberação de vesículas usando Sr2 +
	<ol>
<li>Enquanto perfusing o banho com normal Ca2 + aCSF (o mesmo que o banho aCSF) registro sEPSCs pelo menos 5 min.</li>
		<li>Alternar o Ca2 + aCSF normal e começar perfusing Sr2 + aCSF (da etapa 1.4) e registro sEPSCs.</li>
		<li>Para análise off-line, para determinar se o sEPSCs de grande amplitude são devido à liberação síncrona de vesículas, compare o último 1 min de linha de base (no normal aCSF) para os 10 minutos deth do Sr2 + aCSF aplicativo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Experimento 3: teste para lançamento multivesiculares usando Γ- DGG
	<ol>
<li>Em baixo Ca2 + aCSF registro sEPSCs pelo menos 5 min.</li>
		<li>Adicione 30 µM 4-AP para a aCSF através do sistema de perfusão. SEPSCs recorde pelo menos 10 min.</li>
		<li>Adicionar 200 µM γ-DGG para a aCSF com 4-AP e gravar o sEPSCs pelo menos 10 min.</li>
		<li>Como um experimento de controle em uma célula separada, execute as etapas 1-3 mas se aplicam a uma baixa concentração (125 nM) de DNQX em vez de γ-DGG.</li>
		<li>Para análise off-line, analise o último minuto de cada aplicação da droga.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Experimento 4: Estimule entradas aferentes para aumentar o potencial de ação tiro.
	<ol>
<li>SEPSCs registro no Ca2 + aCSF normal.</li>
		<li>Estimule o afferents usando um eletrodo monopolar de vidro preenchido com aCSF a uma taxa de 20 Hz durante 2 segundos e repetir 10 vezes com um intervalo entre a explosão de 20 seg.</li>
		<li>Para análise, usar os ms 5.000 antes o primeiro estímulo como linha de base e comparar com os 10-300 ms após o estímulo final e então tomar a variação de amplitude e frequência média mais de 10 ensaios.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. análise
<ol><li>Analise sEPSCs e mEPSCs usando um programa que detecta e analisa as correntes sinápticas (por exemplo, software de análise de Mini).<ol>
<li>Usando este software, use os parâmetros de deteção sugerido para detecção de Leandro Receptor EPSCs (ou EPSCs de Receptor GABA se gravação inibitórias correntes).</li>
		<li>Use a função de análise Nonstop para detectar EPSCs na gravação.</li>
		<li>Digitalizar manualmente cada gravação para garantir que o programa é detectar com precisão cada evento (por exemplo, certifique-se de eventos não estão sendo perdido ou contados duas vezes).</li>
		<li>Exportar os dados do evento copiando-o para a área de transferência e colá-lo em um software de gerenciamento de dados (por exemplo, Excel)</li>
		<li>Calcular a média frequência e/ou amplitude para cada tratamento de drogas e realizar as análises estatísticas relevantes.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar

Um requisito importante para um experimento de eletrofisiologia braçadeira remendo bem sucedida é a obtenção de fatias/células saudáveis. Nosso protocolo descrito é otimizado para fatias hipotalâmicas que contêm neurônios PVN. Outro áreas podem exigir de cérebro modificado soluções e fatiamento métodos21,22,23,24. Para a gravação, é fundamental para aceitar apenas gravações estáveis monitorando...

Transmissão sináptica é um mecanismo fundamental para a comunicação entre os neurônios e, portanto, funcionamento do cérebro. Transmissão sináptica também é lábil e pode alterar sua eficácia de forma dependente da atividade, bem como em resposta a sinais moduladora1. Assim, examinando a função sináptica tem sido um foco importante de pesquisa da neurociência. Eletrofisiologia do grampo de remendo de célula inteira é uma técnica versátil que permite-nos compreender, pela elaboração de projetos experimentais e análises de dados, em profundidade mecanismos biofísicos e moleculares da transmissão sináptica. Uma abordagem comumente usada, talvez devido a simplicidade da técnica e conceito, é a medição das correntes de pós-sináptico excitatório/inibitório em miniatura (mE / IPSCs) sob a tensão braçadeira configuração2,3, 4 , 5 , 6. mPSCs individuais representam o fluxo de íons através de receptores pós-sinápticos geleificação (por exemplo, os receptores GABA e GABAA ) em resposta à ligação de seus respectivos neurotransmissores liberados do terminal pré-sináptica 7 . Porque a gravação é obtida na presença da voltagem-dependente Na+ canal bloqueador tetrodotoxina (TTX), o lançamento é independente do potencial de ação e normalmente envolve uma única vesícula sináptica que contém o neurotransmissor. Partindo deste pressuposto, a amplitude média de mPSCs é amplamente utilizada como uma estimativa crua para o tamanho de quantal, que representa o número e funcionalidade dos receptores pós-sinápticos, opondo-se um único lançamento de site. Por outro lado, a frequência de mPSCs é considerada para representar uma combinação do número total de sinapses encerra para a célula pós-sináptica e sua probabilidade média de lançamento. No entanto, esses parâmetros não meça outra variável-multiplicatividade de sinapses, ou multiplicidade sináptica — que é importante para a eficácia da transmissão sináptica.
Com base na teoria quantal da transmissão sináptica7,8,9, a força de uma determinada conexão entre um par de neurônios é dependente de três fatores: o número de sinapses funcionais (N), o resposta pós-sináptica para o lançamento de uma única vesícula sináptica (tamanho quantal; Q) e a probabilidade de liberação do neurotransmissor (Pr). Sináptica multiplicidade é equivalente a N. O desenvolvimento da multiplicidade sináptica ou a poda das sinapses multiplicativas é plástico durante todo o desenvolvimento e doença diferentes Estados3,4,6,10. Por esta razão, caracterizando a multiplicidade sináptica tem implicações importantes para compreender a eficácia da transmissão sináptica na saúde e na doença. Técnicas, tais como a microscopia eletrônica podem identificar evidências estruturais da multiplicidade sináptica através da detecção de múltiplos contatos sinápticos provenientes do mesmo axônio para o mesmo neurônio pós-sináptico11,12, 13,14. No entanto, essas multisynapses estruturalmente identificados podem ser funcionalmente silenciosa15,16. Análise funcional precisa de N exige que tecnicamente desafiador eletrofisiológicas abordagens, tais como gravações de células inteiras emparelhadas que podem identificar se uma determinada conexão tem vários sites de lançamento funcional mínima e abordagens de estimulação que visam recrutar um único axônio putativo.
Neste protocolo, descrevemos um método simples para estimar a multiplicidade sináptica, adoptando um método originalmente desenvolvido por Hsia et al2. Esta técnica envolve a medição de espontânea PSCs (sPSCs) e mPSCs usando eletrofisiologia braçadeira remendo de célula inteira, o que nos permite estimar o grau de multiplicidade sináptica através de todas as entradas para um determinado neurônio.  Como definida anteriormente, sináptica multiplicidade reflete o número de sinapses entre um determinado neurônio pré e pós-sinápticas. Se múltiplas sinapses são recrutadas em sincronia por um potencial de ação, haverá uma grande probabilidade do somatório temporal das EPS (ou seja, quantal) individuais, gerando uma maior amplitude PSC.  Nas gravações do mPSC (em que potenciais de ação são bloqueados por TTX), a probabilidade de somação temporal dos individuais (não-síncronas) mPSCs é baixa. Usando esta lógica, multiplicidade sináptica pode ser estimada, comparando a amplitude de sPSC (com liberação de dependente do potencial de ação) para a amplitude do mPSC.
Para examinar a existência de multiplicidade, descrevemos quatro experimentos e suas análises usando glutamatérgico EPSCs como exemplo. No entanto, a mesma abordagem pode ser usada para a rápida transmissão gabaérgica/glycinergic (IPSCs). Uma breve fundamentação para cada experimento é descrita abaixo. Em primeiro lugar, conforme explicado acima, multiplicidade sináptica pode ser estimada, comparando a amplitude de sEPSCs para mEPSCs. Há dois requisitos para esta abordagem; 1) pré-sináptica axônios de disparar um número suficiente de potenciais de ação durante a gravação, e 2) Pr deve ser alta para que múltiplas sinapses liberar neurotransmissores após a chegada de um potencial de ação. A fim de atender a esses requisitos, sEPSCs são primeiramente registrados em baixo Ca2 + artificial líquido cefalorraquidiano (aCSF) e em seguida na presença de uma baixa concentração do antagonista de canal de K+ , 4-aminopiridina (4-AP) para aumentar a ação disparo de potencial e Pr. Então disparando do potencial de ação é bloqueado por TTX e Pr diminuída uma voltagem Ca2 + bloqueador dos canais de Cd2 +. A amplitude da sEPSCs (com 4AP) é comparada com a de mEPSC (com 4AP, TTX e Cd2 +). No segundo experimento, Ca2 + é substituído por equimolar Sr2 + na aCSF para desynchronize liberação de vesículas. Como Ca2 + é necessária para a versão síncrona de vesículas, substituição com Sr2 + deve eliminar a sEPSCs de grande amplitude que sejam indicativos de multiplicidade. Em terceiro lugar, mecanicamente, multiplicidade pode resultar de qualquer vários contatos sinápticos ao mesmo neurônio pós-sináptico ou liberação multivesiculares (ou seja, múltiplas vesículas lançadas dentro de um único contato sináptico)17,18. Para diferenciar entre os dois tipos de multiplicidade, o terceiro experimento utiliza uma baixa afinidade, rápida dissociando antagonista competitivo dos receptores GABA, γ-D-glutamylglycine (γ-DGG)17,18 , para determinar se o grande sEPSC são o resultado de uma soma temporal das sinapses independentes ou liberação multivesiculares atuando sobre uma população de sobreposição de receptores pós-sinápticos. Se os acontecimentos de grande amplitude surgem de lançamento multivesiculares, γ-DGG será menos eficaz inibe a maior sEPSCs em relação ao menor, Considerando que grande sEPSCs que surgem a partir do somatório temporal de vários contatos sinápticos serão afetados da mesma forma por Γ-DGG. No quarto experimento, um método mais fisiológico é usado para aumentar o potencial de ação mista, nomeadamente aferente estimulação sináptica. Picos de atividade sináptica podem transitoriamente aumento/facilitar a probabilidade de queima e liberação de potencial de ação espontânea das afferents estimulada. Portanto, esta abordagem permite que a multiplicidade de manifestar de forma mais fisiológica.
O seguinte protocolo descreve o método para a realização dessas experiências no tecido hipotalâmico de rato. Especificamente, os neurônios de hormônio (CRH) liberando corticotropina do núcleo paraventricular do hipotálamo (PVN) são utilizados. Descrevemos os procedimentos para a realização de eletrofisiologia de braçadeira do remendo de células inteiras e explicar as experiências específicas para testar a multiplicidade sináptica.

<table><tbody><tr><td>Seringa de 1 mL</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>10 lâminas</td><td>Fisher Scientific/outros</td><td>35698</td><td></td></tr><tr><td>22 lâminas</td><td>VWR/outros</td><td>21909-626</td><td></td></tr><tr><td>22 &mu; Filtros de seringa</td><td>M Milipore</td><td>09-719-000</td><td></td></tr><tr><td>Adson foreceps</td><td>Harvard Instruments</td><td>72-8547</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura afiada angular</td><td>Harvard Instruments</td><td>72-8437</td><td></td></tr><tr><td>Clampex</td><td>Molecular Devices</td><td>pClamp 10</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina de borda dupla</td><td>VWR</td><td>74-0002</td><td></td></tr><tr><td>Papel de filtro</td><td>Sigma/outros</td><td>1001090</td><td></td></tr><tr><td>Pincel fino</td><td>Fisher / vários</td><td>15-183-35 / vários</td><td></td></tr><tr><td>tubo de dispersão de gás</td><td>VWR</td><td>LG-8680-120</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Fresenius Kabi / outros</td><td>M60303</td><td></td></tr><tr><td>Krazy cola</td><td>vários</td><td>vários Mini</td><td></td></tr><tr><td>análise</td><td>Synaptosoft</td><td>MiniAnalysis 6</td><td></td></tr><tr><td>Osmomoter</td><td>Wescor Inc</td><td>Modelo 5600</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Pasteur</td><td>VWR</td><td>14672-200</td><td></td></tr><tr><td>medidor de ph</td><td>Mettler Toledo</td><td>FE20-ATC</td><td></td></tr><tr><td>Bulbo de borracha</td><td>VWR</td><td>82024-550</td><td></td></tr><tr><td>Cabo de bisturi nº 3</td><td>Harvard Instruments</td><td>72-8350</td><td></td></tr><tr><td>Cabo de bisturi nº 4</td><td>Harvard Instruments</td><td>72-8356</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina de borda única</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>Cortador de vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1200S</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de purificação de água</td><td>Millipore Milli-Q</td><td>Academic A10</td><td></td></tr><tr><td>Tampa da placa do poço</td><td>Fisher / various</td><td>07-201-590 / vários</td><td></td></tr><tr><td>< forte > produtos químicos / reagentes < / forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-AP</td><td>Sigma</td><td>275875</td><td></td></tr><tr><td>BAPTA</td><td>sondas moleculares</td><td>B1204</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2*2H2O</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>CdCl2</td><td>sigma</td><td>202908</td><td></td></tr><tr><td>DNQX</td><td>Tocris</td><td>189</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>glicose</td><td>Sigma</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>K2-ATP</td><td>Sigma</td><td>A8937</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>K-gluconato</td><td>Sigma</td><td>G4500</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2*6H2O</td><td>Sigma</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Grau de biologia molecular água</td><td>Sigma</td><td>W4502-1L</td><td></td></tr><tr><td>Na3GTP</td><td>Sigma</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Bioshop</td><td>SOD001.1</td><td></td></tr><tr><td>Na-gluconato</td><td>Sigma</td><td>S2054</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma</td><td>71504</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Picrotoxina</td><td>sigma</td><td>P1675</td><td></td></tr><tr><td>SrCl</td><td>Sigma</td><td>255521</td><td></td></tr><tr><td>sacarose</td><td>Bioshop</td><td>SUC507.1</td><td></td></tr><tr><td>TTX</td><td>Alamone Labs</td><td>T-550</td><td></td></tr><tr><td>yDGG</td><td>Tocris</td><td>6729-55-1</td><td></td></tr></tbody></table>

avaliação da multiplicidade sináptica usando células inteiras patch-clamp eletrofisiologia

Evaluation of Synaptic Multiplicity Using Whole-cell Patch-clamp Electrophysiology

No sistema nervoso central, um par de neurônios formam frequentemente múltiplos contatos sinápticos e/ou sites de liberação de neurotransmissor funcional (multiplicidade sináptica). Sináptica multiplicidade é plástico e mudanças ao longo do desenvolvimento e em diferentes condições fisiológicas, sendo um importante determinante para a eficácia da transmissão sináptica. Aqui, nós esboçamos experimentos para estimar o grau de multiplicidade das sinapses de terminação para um determinado neurônio pós-sináptico usando eletrofisiologia de braçadeira do remendo de células inteiras em fatias cerebral aguda. Especificamente, a gravação de tensão-braçadeira é usada para comparar a diferença entre a amplitude das correntes pós-sináptico excitatórias espontâneas (sEPSCs) e correntes de pós-sinápticos excitatórios em miniatura (mEPSCs). A teoria por trás deste método é que entradas aferentes que apresentam multiplicidade mostrará sEPSCs grande, dependente do potencial de ação, devido à liberação de síncrona que ocorre em cada contato sináptico. Em contraste, o lançamento independente de potencial de ação (que é assíncrono) irá gerar menor amplitude mEPSCs. Este artigo descreve um conjunto de experiências e análises para caracterizar a existência de multiplicidade sináptica e discute os requisitos e limitações da técnica. Esta técnica pode ser aplicada para investigar como diferentes intervenções comportamentais, farmacológicas ou ambientais em vivo, afectar a organização de contatos sinápticos em áreas diferentes do cérebro.

O protocolo acima descreve um método para usar eletrofisiologia de braçadeira do remendo de células inteiras para examinar o grau de multiplicidade sináptica, usando hipotalâmico neurônios de rato como exemplo. Esta técnica de preparação de fatia deve produzir células viáveis saudáveis que não possuem uma membrana inchada ou núcleo (Figura 1). Cada passo no protocolo é importante para a saúde do tecido e da qualidade das gravações.
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Aqui, apresentamos um protocolo para avaliar a multiplicidade sináptica funcional usando eletrofisiologia de braçadeira do remendo de células inteiras em fatias cerebral aguda.

Avaliação da multiplicidade sináptica usando células inteiras Patch-clamp eletrofisiologia

In the central nervous system, a pair of neurons often form&#160;multiple synaptic contacts and/or functional neurotransmitter release sites (synaptic ...

No cérebro, um par de neurônios frequentemente formam múltiplos contatos sinápticos, o que é chamado de multiplicidade sináptica. No entanto, o exame preciso da multiplicidade sináptica requer experimentos tecnicamente desafiadores. Este protocolo descreve um método simples para estimativa bruta da multiplicidade sináptica usando eletrofisiologia de grampo de remendo de células inteiras.Este método pode ser aplicado a qualquer espécie e área cerebral para investigar a multiplicidade sináptica. Este método requer habilidades básicas na eletrofisiologia de grampo de remendo de células inteiras. A obtenção de gravações de alta qualidade com baixa e estável resistência ao acesso é fundamental para a interpretação precisa dos dados.Para obter a configuração de células inteiras, coloque a pipeta de gravação logo acima da corrente de pipeta de corte e compense a corrente de pipeta no modo de fixação de tensão. Aplique uma leve pressão positiva na pipeta e bloqueie a torneira. Em seguida, selecione uma célula saudável com uma membrana intacta, e aproxime-se do tecido com a pipeta.A pressão positiva deve causar um leve distúrbio no tecido. Aproxime lentamente a pipeta da célula em um movimento diagonal até que uma pequena covinha se forme na superfície da célula. Em seguida, solte o bloqueio de pressão positivo.A célula começará a formar uma vedação, e a resistência aumentará acima de um gigaohm. No grampo de tensão, segure a célula a menos 68 milvolts. Posteriormente, puxe ligeiramente a pipeta para longe da célula diagonalmente para remover o excesso de pressão.Compensar a capacidade rápida e lenta da pipeta. Aplique uma breve sucção através do tubo conectado ao suporte da pipeta para quebrar a célula e obter uma configuração de célula inteira. Em seguida, mude para o modo celular na janela de teste de membrana em um software de aquisição e análise de dados eletrofisiológicos.Mantenha a temperatura do banho de gravação em 27 a 30 graus Celsius e a vazão em 1,5 a dois mililitros por minuto para experimentos subsequentes. Em uma sinapse multiplicidade, um potencial de ação sincroniza a liberação de neurotransmissores e gera uma corrente postsináptica maior. O potencial de ação de bloqueio e a liberação vesicular dependente de cálcio com TTX e cádmio impedem a soma da corrente postsiática e diminuem a amplitude.Quando não há multiplicidade, o potencial de ação de bloqueio não mudará a amplitude. No experimento um, para estimar a multiplicidade, mantenha a célula a menos 68 milvolts enquanto a perfuz com aCSF de baixo cálcio. Regisse os EPSCs espontâneos por pelo menos cinco minutos para garantir uma linha de base estável.Em seguida, adicione 30 micromolars 4-AP ao aCSF para aumentar eventos potenciais dependentes da ação e registigue EPSCs espontâneos por pelo menos 10 minutos para obter o efeito completo da droga. Em seguida, adicione 0,5 micromolars TTX e 10 micromolars de cádmio ao aCSF com 4-AP, e registe os EPSCs em miniatura por pelo menos 10 minutos. Para análise offline, use o último minuto da linha de base imediatamente antes da aplicação do 4-AP, o 10º minuto do aplicativo 4-AP e o 10º minuto do aplicativo TTX.Neste experimento, o cálcio extracelular é substituído por estrôncio para dessincronizar a liberação de vesículas sinápticas. Portanto, se a multiplicidade estiver presente, isso deve diminuir a amplitude das correntes postsinásticas. No experimento dois, regise EPSCs espontâneos por pelo menos cinco minutos enquanto perfusa a célula com aCSF de cálcio normal.Para dessincronizar a liberação vesícula, comece a perfumar a célula com estrôncio aCSF e regis frequentes espontâneas. Para análise offline, para determinar se os EPSCs espontâneos de grande amplitude são devido à liberação síncrona de vesículas, compare o último minuto da linha de base com o 10º minuto do aplicativo estrôncio aCSF. A multiplicidade pode envolver liberação multivesicular, o que causa maior concentração de neurotransmissores na fissura sináptica.A adição de gama-DGG, um antagonista receptor AMPA de baixa afinidade, leva a uma inibição menos eficaz de correntes pós-sinápticas uniquantais menores. Sem a versão multivesicular, o gama-DGG será igualmente eficaz em correntes postsináspticas maiores e menores. No experimento três, para testar a liberação multivesicular, registos espontâneos em aCSF de baixo cálcio por pelo menos cinco minutos.Adicione 30 micromolars 4-AP ao aCSF através do sistema de perfusão. Regisse os EPSCs espontâneos por pelo menos 10 minutos. Em seguida, adicione 200 micromolars gama-DGG ao aCSF com 4-AP, e regisse os EPSCs espontâneos por pelo menos 10 minutos.Como um experimento de controle em uma célula separada, repita os procedimentos, mas aplique uma baixa concentração de DNQX em vez de gama-DGG. Para análise offline, analise o último minuto de cada aplicação de medicamentos. Rajadas de atividade sináptica podem aumentar transitoriamente a potencial de ação espontânea de disparo e probabilidade de liberação dos diferentes aferentes estimulados.Se os neurônios apresentarem multiplicidade, o aumento dos potenciais de ação deve causar um aumento transitório na amplitude das correntes postsináspticas. No experimento quatro, registos espontâneos em aCSF de cálcio normal. Para aumentar o potencial de disparo de ação, estimule os aferentes usando um eletrodo de vidro monopolar cheio de aCSF a uma taxa de 20 hertz por dois segundos, e repita 10 vezes com um intervalo entre rajadas de 20 segundos.Para análise, use EPSCs espontâneos de 5.000 milissegundos antes do primeiro estímulo como linha de base e compare com os EPSCs espontâneos de 10 a 300 milissegundos após o estímulo final. Em seguida, tome a amplitude média e a mudança de frequência ao longo de 10 ensaios. Analise EPSCs espontâneos e EPSCs em miniatura usando um programa que detecta e analisa correntes sinápticas.Use os parâmetros de detecção sugeridos e a função de análise sem escalas para detectar EPSCs mediados por receptores AMPA. Escaneie manualmente cada gravação para garantir que o programa esteja detectando com precisão cada evento. Exporte os dados do evento copiando-os para a área de transferência e cole-os em um software de gerenciamento de dados.Em seguida, calcule a frequência média e a amplitude de cada tratamento medicamentoso e realize as análises estatísticas relevantes. Em um exemplo mostrado aqui, o 4-AP aumenta tanto a amplitude quanto a frequência de EPSCs espontâneos. A aplicação subsequente de TTX e cádmio diminui tanto a amplitude quanto a frequência.Aqui está a distribuição da amplitude espontânea do EPSC a partir da gravação. Nos neurônios hipotalâmicos aqui examinados, a amplitude e a frequência das condições de linha de base e TTX são as mesmas, sugerindo que os EPSCs espontâneos da linha de base contêm pedênicos de ação potenciais dependentes dos EPSCs. Assim, experimentos subsequentes podem comparar a diferença entre linha de base e 4-AP para medir a multiplicidade.A força da transmissão sináptica pode ser aumentada transitoriamente por rajadas de atividade sináptica. Para investigar a multiplicidade em condições mais fisiológicas, a estimulação aferente pode ser usada para aumentar a probabilidade de disparo e liberação de ações. Aqui estão os resumos das frequência espontâneas e mudanças de amplitude após a estimulação sináptica.Gravações estáveis são essenciais para uma interpretação precisa dos dados. Descreva os dados se a resistência de acesso mudar em mais de 20% durante o registro, pois isso pode confundir a análise. Este protocolo oferece uma maneira simples de estimar a multiplicidade sináptica, que é um determinante fundamental da eficácia sináptica e sua plasticidade em diferentes condições fisiológicas e fioficológicas.

evaluation-synaptic-multiplicity-using-whole-cell-patch-clamp

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este protocolo descreve uma técnica chamada eletrofisiologia de patch clamp de célula inteira, que é um método para estudar propriedades elétricas de neurônios de Mauthner e outras células reticuloespinhais em embriões de peixe-zebra.

Eletrofisiologia de grampo de remendo de células inteiras: um método para estudar as propriedades elétricas dos neurônios

Este vídeo demonstra a técnica de patch clamp de célula inteira em uma fatia de cérebro de camundongo. Essa técnica estabelece uma conexão estável entre a micropipeta e a membrana do neurônio, que é ainda mais interrompida para estabelecer uma configuração de célula inteira para estudar a saúde e as respostas fisiológicas do neurônio.

Estabelecendo uma configuração de célula inteira por meio do método Patch Clamp

O vídeo demonstra um método para estudar a excitabilidade de células neuronais que expressam proteína fluorescente usando uma pinça de corrente de contato de célula inteira. No modo de pinça de corrente, potenciais de ação indicativos de excitabilidade neuronal são gerados.

Estudando a excitabilidade de neurônios fluorescentes usando um grampo de patch de célula inteira

Este vídeo demonstra o posicionamento de uma pipeta pontiaguda perto de fatias de cérebro, formando um selo com uma célula neuronal. A sucção quebra a membrana celular, criando assim um grampo de remendo de célula inteira que permite medições de corrente para experimentos de eletrofisiologia.

Estabelecendo uma configuração de grampo de voltagem de célula inteira para registros eletrofisiológicos em fatias cerebrais

Multi-eletrodo gravações de patch-clamp constitui uma tarefa complexa. Aqui nós mostramos como, através da automatização de muitas das etapas experimentais, é possível acelerar o processo conducente à melhoria qualitativa no desempenho e número de gravações.

A Multi-eletrodo Sistema patch-clamp assistida por computador

Redes corticais são controlados por um conjunto de pequenos, mas diversificada de interneurónios inibitórios. Investigação funcional dos interneurônios, portanto, requer a gravação específica e rigorosa identificação. Descrito aqui é uma abordagem conjunta, envolvendo gravações de células inteiras de pares simples ou synaptically acoplados de neurônios com rotulagem intracelular, post-hoc Análise morfológica e imunocitoquímica.

Whole-cell Recordings patch-clamp de Morphologically- e identificados Neuroquimicamente hipocampo Interneurônios

As gravações de pares são gravações simultâneas de grampo de patch de células inteiras de dois neurônios sinapticamente conectados, permitindo a caracterização eletrofisiológica e farmacológica precisa das sinapses entre neurônios individuais. Aqui descrevemos a metodologia detalhada e os requisitos para estabelecer esta técnica em culturas de fatias organotípicas do hipocampo em qualquer laboratório equipado para eletrofisiologia.

Emparelhados Recordings células inteiras em organotï¿½icas fatias do hipocampo

Registros de patch-clamp e preenchimento simultâneo de biocitina intracelular de neurônios sinapticamente acoplados em fatias cerebrais agudas permitem uma análise correlacionada de suas propriedades estruturais e funcionais. O objetivo deste protocolo é descrever as etapas técnicas essenciais do registro eletrofisiológico a partir de microcircuitos neuronais e sua posterior análise morfológica.

Eletrofisiológica e Caracterização Morfológica de Neuronal Microcircuits em aguda fatias do cérebro do Usando Emparelhados patch-clamp Recordings

Este protocolo descreve passos processuais básicas para a realização de célula inteira gravações de patch-clamp. Esta técnica permite o estudo do comportamento eléctrico de neurónios, e quando realizados em fatias do cérebro, permite a avaliação de várias funções neuronais a partir de neurónios que ainda estão integrados nos circuitos do cérebro relativamente bem conservadas.

Gravações de células inteiras de patch-clamp em Brain Slices

A técnica de braçadeira do remendo de fatia é um método eficaz para a análise de aprendizagem induzido por alterações nas propriedades intrínsecas e plasticidade de sinapses excitatórias ou inibitórias.

Fatia Patch Clamp técnica para análise de plasticidade induzida pela aprendizagem

Aprenda a avaliar multiplicidade sináptica em neurônios usando eletrofisiologia de patch-clamp de célula inteira em fatias cerebrais agudas. Este protocolo permite estimar contatos sinápticos múltiplos em diversas espécies e regiões cerebrais.

Avaliação da multiplicidade sináptica usando células inteiras Patch-clamp eletrofisiologia

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