Name: Uma estratégia convergente para a geração de uma biblioteca de cDNA virtualmente seqüenciada de ostras pacíficos não referenciadas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-13T13:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 14 s
Description: Aprenda a clonar genes biotecnológicos de ostras do Pacífico sem sequenciamento convencional, utilizando amostras de mercados locais e dados genéticos públicos. Este método econômico facilita pesquisas em biotecnologia marinha.

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Este trabalho foi apoiado em parte pela Fundação de ciências naturais da China (conceder números 31471703, A0201300537 e 31671854 para J.V. e ll, conceder o número 31470435 para G.Y.), e o plano de talentos estrangeiros 100 (número de subvenção JSB2014012 para J.V.).

Nota: uma síntese esquemática é mostrada na Figura 1.
1. coleta de amostra
<ol><li>Obter espécimes de ostra. Manter as ostras no gelo durante o período pós-colheita, o transporte e antes do uso laboratorial e processo dentro de 4-7 dias após a compra. Nota: para este protocolo, as ostras foram compradas no mercado grossista Zhong cai em Nanjing (originária de Ningde, Fujian, China e Lianyungang, Jiangsu, China), Haijie Aquatic Product Company em Qingdao (originário de Qingdao, Shandong, China), Jucheng Companhia aquática do produto em Yantai (originando de Yantai, Shandong, China) e companhia aquática do produto de jinxiu em Qingdao (originando de Qingdao, Shandong, China)).</li>
</ol>2. isolação do RNA pela extração do thiocyanate-fenol do guanidina
<ol><li>Preparação da amostra de tecido de ostra<ol>
<li>Recorte aproximadamente 100 mg de tecido mole homogêneo do centro geométrico aproximado de cada espécime de ostra com um bisturi esterilizado e transfira as amostras para o nitrogênio líquido.</li>
		<li>Eutanizar a parte restante das ostras congelando a-80 ° c por 1 h e descarte como resíduo biológico.</li>
		<li>Moer o tecido de ostra de flash congelado em um pó fino em um almofariz (200 mL) preenchido com 50 mL de nitrogênio líquido.</li>
		<li>Pesar 75 mg de tecido congelado de cada espécime em um tubo de centrifugação estéril de 1,5 mL e misturar com 1 mL do reagente de extração de tiocianato de guanidínio-fenol. Centrifugue a amostra a 14.000 x g a 4 ° c durante 15 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transfira o sobrenadante para um novo tubo de centrífuga de 1,5 mL, adicione 200 μL de clorofórmio e misture bem usando um misturador de vórtice para 10-15 s até que a mistura se transforme em branco-leitoso.</li>
	<li>Centrifugue a 14.000 x g a 4 ° c durante 15 min e transfira cuidadosamente a camada aquosa superior com uma pipeta de 200 μl sem perturbar a interfase num novo tubo de centrifugação de 1,5 ml.</li>
	<li>Adicione 500 μL de álcool isopropílico e misture as amostras suavemente por inversão e, em seguida, deixe as amostras por 20 min no gelo. Centrifugue a 14.000 x g a 4 ° c durante 8 min e retire o sobrenadante.</li>
	<li>Ressuspender cada um dos pellets em 1 mL de 75% EtOH, e centrifugar a 14.000 x g a 4 ° c durante 5 min. Retire todo o sobrenadante.</li>
	<li>Repita o passo 2,5 uma vez. Seque os pellets durante 6 min à temperatura ambiente. Não seque por mais tempo; caso contrário, pode ser difícil dissolver a pelota do RNA na próxima etapa.</li>
	<li>Dissolva a pelota secada do RNA em 25 μL de DEPC (diethylpyrocarbonate)-água tratada e mantenha o tubo no gelo. Use amostras de RNA dentro de 24 h.</li>
</ol>3. geração da biblioteca do cDNA pela transcrição reversa
<ol><li>Para cada amostra de RNA, prepare uma mistura de reacção utilizando um sistema de transcrição reversa comercial utilizando uma pipeta de 10 μL: adicionar 4 μL de solução de MgCl2 , 2 μL de tampão de reacção 10x, 2 μL de solução de dntp, 0,5 μL de inibidor de RNase, 0,7 ΜL de AMV Reverse Transcriptase, 0,5 μL de oligo (dT) 15 primer, 1 μL da amostra de RNA extraído e 9,3 μL de H2o em um tubo de 300 ΜL de PCR.</li>
	<li>Incubar a mistura em um thermocycler do PCR para 60 minutos em 42 ° c, e aumenta então a temperatura a 95 ° c por 5 minutos.</li>
	<li>Armazene a biblioteca de cDNA gerada por até 12 meses a-20 ° c.</li>
</ol>4. amplificação e purificação do gene mitocondrial
<ol><li>Prepare a mistura de PCR usando uma pipeta de 10 μL. Adicionar 0,25 μL (1,25 U) de DNA polimerase de alta fidelidade, 2 μL de solução de dNTP (2,5 mM de cada dNTP), 0,5 μL do primer dianteiro COX1 ou ND (100 μM), 0,5 μL do primer reverso COX1 ou ND correspondente (100 μM), 1 μL da biblioteca cDNA , 5 μL de solução tampão 5x e 16 μL de H2O destilada num tubo de 300 ΜL de PCR.</li>
	<li>Realize a amplificação do PCR usando os seguintes parâmetros: após uma etapa inicial da desnaturação em 95 ° c (duração 5 minutos), 35 ciclos da reação do PCR que consistem em uma etapa do recozimento em 55 ° c (30 s), etapa do alongamento em 72 ° c (2 minutos), e etapa da desnaturação em 95 ° c (30 s) , realize um passo de alongamento de finalização por 5 min a 72 ° c.</li>
	<li>Use 5 μL do produto do PCR para verific pela electroforese do gel do agarose a qualidade do produto obtido do PCR. Observe o gene COX1 ou ND amplificado como uma única faixa em ambos os 759 ou 748 pares de base, respectivamente.</li>
	<li>Purify o descanso do produto do PCR com um jogo da limpeza do PCR.<ol>
<li>Adicionar 100 μl de solução ' PCR-A ' (tampão de ligação do ADN que contém concentrações elevadas de sais de agente11) à amostra. Vortex brevemente para misturar o conteúdo.</li>
		<li>Coloque a coluna de purificação num tubo de centrifugação de 2 mL. Pipeta a mistura de reacção de 4.4.1. na coluna. Centrifugar a 14.000 x g durante 1 min à temperatura ambiente.</li>
		<li>Elimine o filtrado do tubo de centrifugação. Retorne a coluna para o tubo de centrífuga de 2 ml, adicione 700 μL de solução ' W2 ' na coluna e centrifugue a 14.000 x g durante 1 min à temperatura ambiente (' W2 ' é uma solução de lavagem que contém altas concentrações de etanol para a remoção de agente residual sais da coluna de purificação).</li>
		<li>Elimine o filtrado e devolva a coluna ao tubo de centrifugação de 2 mL. Adicionar 400 μL de solução ' W2 ' à coluna e centrifugar a 14.000 x g durante 1 min à temperatura ambiente.</li>
		<li>Pré-aqueça 1 mL de água deionizada a 65 ° c num aquecedor de blocos metálicos. Transfira a coluna para um novo tubo de centrifugação de 1,5 mL. Pipetar 25 μL da água deionizada quente pré-aquecida a 65 ° c para o centro da membrana da coluna branca. Deixe a membrana mergulhar por 1 min à temperatura ambiente.</li>
		<li>Centrifugar a 14.000 x g durante 1 min à temperatura ambiente e descartar a coluna.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Armazene o produto purificado do PCR por até 12 meses em-20 ° c.</li>
</ol>5. sequenciamento e comparação de genes mitocondrial
<ol><li>Emita as amostras purified do PCR da etapa 4,5 para o sequenciamento de Sanger usando os primers para diante COX1 ou ND relevantes como iniciadores de sequenciamento. Opcionalmente, os primers reversos COX1 ou ND também podem ser usados para seqüenciamento bidirecional.</li>
	<li>Depois de recuperar os resultados de seqüenciamento, compare as sequências com a sequência do genoma da cepa de referência de ostra do Pacífico (ID de taxonomia NCBI: 29159) usando a ferramenta on-line de Nucleotide BLAST da NCBI (blast.ncbi.nlm.nih.gov) (Figura 2 e Figura 3 ).</li>
</ol>6. aplicando a biblioteca cDNA para clonagem dos genes MgUGD e MgUXS
<ol><li>Amplify e purificar os genes de mgugd e de mguxs usando os primers para diante e reversos respectivos de mgugd e de mguxs pelo PCR que segue etapas 4,1. a 4,4.</li>
	<li>Transfira 2 μL de tampão de digestão (10x concentrado) e 6 μL de água desionizada para um tubo de centrifugação de 1,5 mL. Adicionar 10 μL dos produtos MgUGD ou MgUXS PCR purificados juntamente com as endonucleases de restrição Nde I e Xho I (1 μL cada, 20 U). Incubar a 37 ° c por 3 h.</li>
	<li>Prepare o vetor pET-30A pré-digerido: Transfira 500 ng do vetor pET-30A para um novo tubo de centrífuga de 1,5 mL e levante o volume para 16 μL usando água desionizada. Adicionar 2 μL de tampão de digestão (10x concentrado) juntamente com as endonucleases de restrição Nde I e Xho I (1 μL cada, 20 U).<ol>
<li>Após a incubação da mistura a 37 ° c durante 3 h, adicionar 1 μL de fosfatase alcalina (1 U) e incubar a 37 ° c durante uma hora adicional. Inative a fosfatase alcalina por aquecimento a 75 ° c por 10 min em um aquecedor de bloco de metal pré-aquecido.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transfira 4 μL dos produtos de DNA MgUGD ou MgUXS digeridos em tubos de centrifugação frescos de 1,5 mL e adicione 4 μL do vetor de pET-30A digerido. Adicionar 1 μL de tampão de ligadura (10x), 1 μL de ligase T4 (3 U) e incubar a mistura de reacção a 22 ° c durante 3 h.</li>
	<li>Transforme as pilhas competentes electrocompetentes de E. coli Mach1 pelo Electroporation usando os produtos da ligadura. Espalhe as células transformadas em placas de agar LB contendo 50 μg/mL de canamicina. Incubar células a 37 ° c por 16 h.</li>
	<li>Verifique colônias para a inserção desejada pelo sequenciamento de Sanger usando o promotor T7 e iniciadores de terminador de plasmídeo específicos. Prepare plasmímetros dos clones bacterianos validados.</li>
</ol>7. testes de expressão e de atividade de MgUGD e MgUXS
<ol><li>Transforme e . coli BL21 (de3) células competentes com plasmís que carregam os genes MgUGD e MgUXS e espalham as células transformadas em placas de agar LB contendo 50 μg/ml de canamicina. Incubar células a 37 ° c por 16 h.</li>
	<li>Cultivar uma única colônia em meio LB 5 mL com 50 μg/mL de canamicina durante a noite. Transfira a cultura para 400 mL de meio LB e agite continuamente a 200 rpm a uma temperatura de 37 ° c até que a densidade óptica em um comprimento de onda de 600 nm (OD600) atinja uma absorção de aproximadamente 0,5.<ol>
<li>Reduza a temperatura de incubação para 20 ° c e adicione 400 μL de isopropílico β-D-tiogalactopyranoside (concentração 1 M). Induzir a expressão das proteínas recombinantes por 3 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Células de colheita por centrifugação a 4.500 x g por 15 min a 4 ° c. Suspender pellets em 10 mL de tampão de lise (100 mM NaCl, 50 mM Tris/HCl, 1% Triton X-100, 1 mM fenilmetilsulfonilo-fluoreto (PMSF), pH 8,0).</li>
	<li>Interrompa as células por sonicação durante 20 min (40 ciclos de ligar/desligar com amplitude de 20 μm para 15 s a 4 ° c). Centrifugar a 14.000 x g a 4 ° c durante 20 min e recolher o sobrenadante para o teste de atividade.</li>
	<li>Realize o ensaio de atividade de MgUGD incubando 2 μL do lisado de células com 2 μL de UDP-glucose (10 mM), 4 μL de NAD+ (10mm), 4 μL de MgCl2 (10 mm), 2 μL de tampão Tris/HCl (500 mm, pH 7,5) e 6 μL de H2O deionizado num novo 1,5 tubo de centrifugação mL e incubar a 37 ° c durante 30 min.</li>
	<li>Realize o ensaio de atividade de MgUXS incubando 2 μL do lisado de células com 2 μL de ácido UDP-glucurônico (10 mM), 2 μL de tampão Tris/HCl (500 mM, pH 7,5) e 14 μL de H2o desionizado em um novo tubo de centrifugação de 1,5 ml e incubar a 37 ° c durante 30 min.</li>
	<li>Saciar as reações na etapa 7,5 e 7,6 adicionando 20 μL de metanol e 40 μL de clorofórmio a cada mistura. Após vortexing as misturas da amostra, centrifugue em 14.000 x g por 6 minutos em 4 ° c e colete a camada aquosa superior de cada tubo.</li>
	<li>Analise os produtos da reação usando a espectrometria maciça de MALDI-TOF no modo negativo da ionização na escala de m/z de 500-700. Misturar 1 μL de mistura de amostras com 1 μL de matriz de amostras de ácido 2,5-dihidroxibenzóico (1% p/V em 50% de acetonitrila aquosa). Observar os valores esperados de m/z em 579 e 535 para o ácido UDP-glucurônico e UDP-xilose, respectivamente (Figura 4).</li>
</ol>

<ol><li>Blaxter, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promise+of+a+DNA+taxonomy%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+transactions+of+the+Royal+Society+of+London.+Series+B%2C+Biological%22%5BJournal%5D)">The promise of a DNA taxonomy.</a> Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological. 359 (1444), 669-679 (2004).</li>
<li>Wen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species+identification+of+dried+shellfish+%28oyster%2C+clam+and+mussel%29+products+sold+on+the+Chinese+market%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Control%22%5BJournal%5D)">Species identification of dried shellfish (oyster, clam and mussel) products sold on the Chinese market.</a> Food Control. 90, 199-204 (2018).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+cob+and+cox1+genes+and+editing+of+the+corresponding+mRNAs+in+Dinophysis+acuminata+from+Narragansett+Bay%2C+with+special+reference+to+the+phylogenetic+position+of+the+genus+Dinophysis%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial cob and cox1 genes and editing of the corresponding mRNAs in Dinophysis acuminata from Narragansett Bay, with special reference to the phylogenetic position of the genus Dinophysis.</a> Applied and Environmental Microbiology. 74 (5), 1546-1554 (2007).</li>
<li>Sell, J., Spirkovski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+DNA+differentiation+between+two+forms+of+trout+Salmo+letnica%2C+endemic+to+the+Balkan+Lake+Ohrid%2C+reflects+their+reproductive+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Ecology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial DNA differentiation between two forms of trout Salmo letnica, endemic to the Balkan Lake Ohrid, reflects their reproductive isolation.</a> Molecular Ecology. 13, 3633-3644 (2004).</li>
<li>Karadjian, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+rearranged+mitochondrial+genome+in+Nycteria+parasites+%28Haemosporidia%29+from+bats%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Highly rearranged mitochondrial genome in Nycteria parasites (Haemosporidia) from bats.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (35), 9834-9839 (2018).</li>
<li>Morga, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+genes+from+flat+oyster+Ostrea+edulis+as+suitable+housekeeping+genes+for+quantitative+real+time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Fish+and+Shellfish+Immunology%22%5BJournal%5D)">Identification of genes from flat oyster Ostrea edulis as suitable housekeeping genes for quantitative real time PCR.</a> Fish and Shellfish Immunology. 29 (6), 937-945 (2010).</li>
<li>Delsuc, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+systematics+of+armadillos+%28Xenarthra%2C+Dasypodidae%29%3A+contribution+of+maximum+likelihood+and+Bayesian+analyses+of+mitochondrial+and+nuclear+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Phylogenetics+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Molecular systematics of armadillos (Xenarthra, Dasypodidae): contribution of maximum likelihood and Bayesian analyses of mitochondrial and nuclear genes.</a> Molecular Phylogenetics and Evolution. 28 (2), 261-265 (2005).</li>
<li>Wei, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+and+Biochemical+Characterization+of+UDP-Glucose+Dehydrogenase+from+Akkermansia+muciniphila%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+%26+Peptide+Letters%22%5BJournal%5D)">Discovery and Biochemical Characterization of UDP-Glucose Dehydrogenase from Akkermansia muciniphila.</a> Protein & Peptide Letters. 24 (8), 735-741 (2017).</li>
<li>Gu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+and+Biochemical+Characterization+of+the+UDP-Xylose+Biosynthesis+Pathway+in+Sphaerobacter+thermophilus%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+%26+Peptide+Letters%22%5BJournal%5D)">Discovery and Biochemical Characterization of the UDP-Xylose Biosynthesis Pathway in Sphaerobacter thermophilus.</a> Protein & Peptide Letters. 23 (12), 1103-1110 (2016).</li>
<li>Duan, X. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+the+UDP-xylose+biosynthesis+pathway+in+Rhodothermus+marinus%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of the UDP-xylose biosynthesis pathway in Rhodothermus marinus.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 99 (22), 9463-9472 (2015).</li>
<li>Vogelstein, B., Gillespie, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparative+and+analytical+purification+of+DNA+from+agarose%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Preparative and analytical purification of DNA from agarose.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (2), 615-619 (1979).</li>
<li>Song, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UDP-glucose+4-epimerase+and+%CE%B2-1%2C4-galactosyltransferase+from+the+oyster+Magallana+gigas+as+valuable+biocatalysts+for+the+production+of+galactosylated+products%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">UDP-glucose 4-epimerase and β-1,4-galactosyltransferase from the oyster Magallana gigas as valuable biocatalysts for the production of galactosylated products.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1600(2018).</li>
<li>Gainey, P. A., Phelps, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uridine+diphosphate+glucuronic+acid+production+and+utilization+in+various+tissues+actively+synthesizing+glycosaminoglycans%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Uridine diphosphate glucuronic acid production and utilization in various tissues actively synthesizing glycosaminoglycans.</a> Biochemical Journal. 128 (2), 215-227 (1972).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O protocolo apresentado permite a identificação genética de espécimes não referenciados da ostra com phenotype similar dos mercados regionais do marisco pela comparação dos genes de COX1 e de ND com uma base de dados publicamente disponível do genoma do ADN da ostra. O significado desse método reside na sua simplicidade, pois apenas uma única reação de PCR é necessária para a avaliação da biblioteca virtual de cDNA. Os dois conservaram os genes COX1 e ND mitochondrial foram amplificados de uma biblioteca do cDNA que foss...

A aquisição de material biológico referenciado em vida pode ser desafiadora devido a longos prazos de entrega, raciocínio empreendedor ou regulamentação aduaneira específica do país. Como alternativa, o material biológico necessário também pode ser coletado de espécimes fenotipicamente idênticos. No entanto, essas amostras podem variar significativamente ao nível do genótipo e, portanto, as comparações com genomas de referência armazenados digitalmente da mesma espécie são muitas vezes tornadas difíceis ou mesmo fútil devido à incompatibilidade do material recém-originado com métodos de amplificação de ADN existentes. A sequenciação de genes altamente conservados de amostras individuais é uma ferramenta amplamente utilizada e poderosa para identificar espécies1, tais como genes mitocondrial conservados que são freqüentemente usados como genes de referência para a avaliação da qualidade das bibliotecas de cDNA2 ,3,4,5,6. A fundamentação subjacente para o presente método apresentado é que a alta conservação das sequências de genes mitocondriais em amostras de ostras anônimas individuais em comparação com as sequências correspondentes do genoma de referência indica que outros genes também podem mostrar um baixo nível de divergência, dada a taxa geralmente mais rápida de evolução do DNA mitocondrial em relação ao DNA nuclear7, permitindo a amplificação e isolamento de uma ampla gama de genes cientificamente e industrialmente relevantes, simplesmente usando publicamente dados de sequenciamento disponíveis como referência.
O objetivo geral do presente método descrito é apresentar um fluxo de trabalho otimizado para gerar uma biblioteca de cDNA de ostra virtualmente sequenciada que pode ser usada como DNA de modelo para a clonagem de genes de ostra. Em sequenciamento virtual, o sequenciamento do genoma de novo é contornado; em vez disso, uma seqüência de referência conhecida e armazenada digitalmente é usada diretamente para utilizar ou projetar iniciadores para a produção de cDNAs que acabará por incluir uma biblioteca (ou ser adicionado a um pré-existente). O objetivo é produzir uma biblioteca de cDNA convergente, o que significa que as semelhanças entre as sequências de cDNA geradas e a sequência de referência podem ser classificadas de baixa a alta divergência. Uma vantagem chave de usar o subunidade 1 da oxidase do cytochrome C (COX1) e o dehydrogenase de NADH (ND) como genes da referência é que mesmo os espécimes altamente geograficamente disjunção da ostra podem ser perfilados devido à conservação elevada destes genes mitochondrial. Tendo provado a abordagem com esses marcadores bem estabelecidos, demonstramos sua aplicação a dois candidatos enzimáticos que estão envolvidos na biossíntese de nucleotídeo açucareiro e podem ser de relevância industrial8,9, 10. o potencial biotecnológico da ostra do Pacífico ainda é inexplorado. Assim, acreditamos que este método convergente para a preparação de uma biblioteca de cDNA virtualmente sequenciada também será adequado para pesquisadores não especializados que desejam gerar cDNA a partir deste material biológico relevante.

<table><tbody><tr><td><forte>Produtos químicos: < / forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1% Triton X-100</td><td>Solarbio</td><td>9002-93-1</td> <td>* Distribuidores alternativos possíveis</td></tr><tr><td>Ácido 2,5-dihidroxibenzóico</td><td>Alfa Aesar</td><td>490-79-9</td> <td>* Distribuidores alternativos possíveis</td></tr><tr><td>Acetonitrila</td><td>Merck</td><td>75-05-8</td> <td>* Distribuidores alternativos possíveis</td></tr><tr><td>Agarose para biologia molecular</td><td>Biowest Chemicals</td><td>111860</td><td>*Distribuidores alternativos possíveis</td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>Solarbio</td><td>69-52-3</td><td>*Distribuidores alternativos possíveis</td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>Lingfeng, Xangai</td><td>67-66-3</td><td>*Distribuidores alternativos possíveis</td></tr><tr><td>DEPC água</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0601</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Jinhuada, Guangzhou</td><td>64-17-5</td><td>*Distribuidores alternativos possíveis</td></tr><tr><td>Reagente de tiocianato-fenol de guanidínio</td><td>Invitrogen</td><td>15596018</td><td>Reagente TRIzol</td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Energy Chemical</td><td>288-32-4</td><td>*Distribuidores alternativos possíveis</td></tr><tr><td>Álcool isopropílico</td><td>Nanjing Chemical Reagent</td><td>67-63-0</td><td>*Distribuidores alternativos possíveis</td></tr><tr><td>Isopropil &beta;- D-tiogalactopiranosídeo</td><td>Solarbio</td><td>367-93-1</td> <td>* Distribuidores alternativos possíveis</td></tr><tr><td>Kanamicina</td><td>Solarbio</td><td>25389-94-0</td> <td>* Distribuidores alternativos possíveis</td></tr><tr><td>LB Agar</td><td>Thermo Fisher</td><td>22700025</td> <td>* Distribuidores alternativos possíveis</td></tr><tr><td>LB Broth</td><td>Thermo Fisher</td><td>10855021</td> <td>* Distribuidores alternativos possíveis</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Jinhuada, Guangzhou</td><td>67-56-1</td><td>*Distribuidores alternativos possíveis</td></tr><tr><td>MgCl2 hexahidratado</td><td>Xilong Huagong</td><td>7791-18-6</td><td>*Distribuidores alternativos possíveis</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Xilong Huagong</td><td>7647-14-5</td><td>*Distribuidores alternativos possíveis</td></tr><tr><td>NAD+</td><td>Duly Biotech</td><td>53-84-9</td><td>*Distribuidores alternativos possíveis</td></tr><tr><td>Fluoreto de fenil-metilsulfonil</td><td>Macklin</td><td>329-98-6</td><td>*Distribuidores alternativos possíveis</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Solarbio</td><td>77-86-1</td><td>*Distribuidores alternativos possíveis</td></tr><tr><td>UDP-glicose</td><td>Wuhu Nuowei Chemicals</td><td>28053-08-9</td><td>*Distribuidores alternativos possíveis</td></tr><tr><td>Ácido glucurônico UDP</td><td>SIGMA</td><td>63700-19-6</td><td>*Distribuidores alternativos possíveis</td></tr><tr><td>Ferramentas/Instrumentos: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MALDI-TOF espectrômetro de massa</td><td>Bruker</td><td>Autoflex</td><td>*Distribuidores alternativos possíveis</td></tr><tr><td>Aquecedor de bloco de metal</td><td>Long Yang Scientific Instruments</td><td>Thermoshaker HB20</td><td>*Distribuidores alternativos possíveis</td></tr><tr><td>termociclador PCR</td><td>Hema</td><td>9600</td><td>*Distribuidores alternativos possíveis</td></tr><tr><td>< forte> enzima e kits: < / forte ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>10 &vezes; Tampão de ligação</td><td>Thermo Scientific</td><td>B69</td> <td>* Distribuidores alternativos possíveis</td></tr><tr><td>5 vezes; Amortecedor PrimeSTAR</td><td>Takara</td><td>9158A</td><td></td></tr><tr><td>Fosfatase alcalina</td><td>ThermoFisher FastAP</td><td>EF0654</td><td>*Distribuidores alternativos possíveis</td></tr><tr><td>COX forward primer</td><td>Genscript</td><td>ATGTCAACAAATCATTTAGACATTG</td><td></td></tr><tr><td>COX reverse primer</td><td>Genscript</td><td>ACTTGACCAAAAACATAAGACATG</td><td></td></tr><tr><td>Cutsmart Buffer</td><td>NEB</td><td>B7204S</td><td>*Alternativa distribuidores possíveis</td></tr><tr><td>mistura dNTP</td><td>Invitrogen</td><td>18427088</td><td></td></tr><tr><td>MgUGD forward primer</td><td>Genscript</td><td>ACATATGACCCTGTCCAAGATCTGTTGT</td><td></td></tr><tr><td>MgUGD reverse primer</td><td>Genscript</td><td>ACTCGAGACTCTGTGAGGCGGTGGAG</td><td></td></tr><tr><td>MgUXS forward primer</td><td>Genscript</td><td>CCATATGGCAGAATCCTCACAATCAC</td><td></td></tr><tr><td>MgUXS reverse primer</td><td>Genscript</td><td>ACTCGAGCACATTTTTGAATTTGCAGACGT</td><td></td></tr><tr><td>ND primer direto</td><td>Genscript</td><td>ATGAGATGGCAATTATTTTTTAAT</td><td></td></tr><tr><td>ND primer reverso</td><td>Genscript</td><td>ATGTATTTTGGAAAAATCTCCAC</td><td></td></tr><tr><td>PCR Cleanup Kit</td><td>AxyGen</td><td>AP-PCR-250</td> <td>* Distribuidores alternativos possíveis</td></tr><tr><td>vetor pET-30a (+) Merck</td><td>Millipore</td><td>69909</td><td></td></tr></tbody></table>

uma estratégia convergente para a geração de uma biblioteca de cdna virtualmente seqüenciada de ostras pacíficos não referenciadas

A Converging Strategy for the Generation of a Virtually Sequenced cDNA Library from Unreferenced Pacific Oysters

O acesso ao material biológico de espécies de referência, que foram utilizados anteriormente em experimentos-chave, como no desenvolvimento de novas linhas celulares ou projetos de sequenciamento de genoma, são muitas vezes difíceis de prever estudos ou terceiros devido à natureza consumptiva das amostras. Embora agora distribuído extensamente sobre as costas pacíficos de Ásia, de Austrália e de America do Norte, os espécimes pacíficos individuais da ostra são genetically completamente diverso e são conseqüentemente não diretamente apropriados como o material começar para bibliotecas do gene. Neste artigo, demonstramos o uso de espécimes de ostras pacíficos não referenciados obtidos de mercados regionais de frutos do mar para gerar bibliotecas de cDNA. Essas bibliotecas foram comparadas com o genoma de ostra disponível publicamente, e a biblioteca relacionada mais próxima foi selecionada usando os genes de referência mitocondrial citocromo C oxidase subunidade I (COX1) e NADH desidrogenase (ND). A adequação da biblioteca de cDNA gerada também é demonstrada pela clonagem e expressão de dois genes que codificam as enzimas UDP-glucuronic ácido desidrogenase (UGD) e UDP-xylose sintase (UXS), que são responsáveis pela biossíntese de UDP-xylose de UDP-glicose.

A Figura 1 mostra uma visão geral esquemática do método de preparação descrito da biblioteca convergente de cDNA derivada de indivíduos de ostra do Pacífico. A Figura 2 mostra as sequências dos genes COX1 e nd de um espécime de ostra distante relacionado com alta divergência das sequências genéticas COX1 e ND do material de referência. A Figura 3 mostra as sequências dos genes COX1 e nd de um espécime de ostra intimamente relacionad...

Nós descrevemos uma estratégia para como usar amostras do RNA dos espécimes de ostra pacíficos não referenciados, e avaliamos o material genético em comparação com os dados publicamente disponíveis do genoma para gerar uma biblioteca virtualmente seqüenciada do cDNA.

Uma estratégia convergente para a geração de uma biblioteca de cDNA virtualmente seqüenciada de ostras pacíficos não referenciadas

The access to biological material of reference species, which were used previously in key experiments such as in the development of novel cell lines or ...

A questão-chave que queremos abordar com este método é como podemos usar amostras de RNA de materiais comprados em mercados locais de alimentos para a clonagem de genes biotecnologicamente relevantes? Aqui, usamos ostras do Pacífico como um estudo de caso para demonstrar essa abordagem e potencial aplicação adicional. A principal vantagem desta técnica é que o sequenciamento convencional do genoma ou cDNA das amostras de ostra pode ser contornado.Em vez disso, sequências da subunidade citocromática c oxidase I e NADH desidrogenase foram comparadas com sequências de referência disponíveis publicamente da ostra do Pacífico para selecionar o espécime mais intimamente relacionado. O cDNA preparado a partir deste espécime pode ser usado diretamente para a clonagem de genes biotecnologicamente relevantes, que podem ser selecionados usando as informações de sequência pública. Demonstrando o procedimento estarão Yongmei Lyu e Yuquan Li, dois estudantes de pós-graduação do Centro de Pesquisa em Bioengenharia Glicânica e Gliccano da Universidade Agrícola de Nanjing.Para preparar a amostra de tecido de ostra, use um bisturi esterilizado para cortar aproximadamente 100 miligramas de tecido mole homogêneo do centro geométrico aproximado de cada espécime de ostra. Transfira a amostra para uma argamassa cheia de 50 mililitros de nitrogênio líquido. Triture o tecido de ostra congelado em um pó fino.Pesar 75 miligramas do tecido congelado de cada espécime em um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro e se misturar com um mililitro de reagente de extração de tiocianato-fenol de guanidinium. O passo mais crítico deste procedimento é a etapa de extração do RNA. Para minimizar a degradação do RNA, é essencial reduzir o tempo entre a colheita do tecido de ostra e a extração do RNA.Centrifugar a amostra a 14.000 vezes g e quatro graus Celsius por 15 minutos. Transfira o supernatante para um novo tubo de centrífuga de 1,5 mililitro, adicione 200 microlitadores de clorofórmio e misture bem em um misturador de vórtice por 10 a 15 segundos até que a mistura fique branca leitosa. Em seguida, centrífuga por 15 minutos como feito anteriormente.Com uma pipeta de 200 microliter, transfira cuidadosamente a camada aquosa superior, sem perturbar a interfase, em um novo tubo de centrífuga de 1,5 mililitro. Adicione 500 microliters de álcool isopropílico no tubo centrífuga e inverta suavemente para misturar as amostras. Em seguida, deixe as amostras no gelo por 20 minutos.Centrifugar a 14.000 vezes g e quatro graus Celsius por oito minutos, e remover o supernante. Resuspense a pelota em um mililitro de 75% de etanol, e centrífuga a 14.000 vezes g e quatro graus Celsius por cinco minutos. Retire todo o supernatante e repita a lavagem no etanol.Seque as pelotas por seis minutos em temperatura ambiente. Em seguida, dissolva a pelota de RNA seca em 25 microliters de água tratada com DEPC, e mantenha o tubo no gelo. Use as amostras de RNA dentro de 24 horas.Para gerar uma biblioteca cDNA, primeiro prepare uma mistura de reação para cada amostra de RNA em um tubo PCR de 300 microliter adicionando soluções de acordo com o manuscrito. Adicione um microliter da amostra de RNA extraída no tubo. Incubar a mistura em um termociclador PCR por 60 minutos a 42 graus Celsius e, em seguida, aumente a temperatura para 95 graus Celsius por cinco minutos.Armazene a biblioteca cDNA gerada por até 12 meses a menos 20 graus Celsius. Primeiro, adicione um microliter da biblioteca cDNA gerada aos tubos contendo misturas PCR, preparados de acordo com o manuscrito. Coloque os tubos PCR no termociclador PCR e realize a amplificação do PCR com uma etapa inicial de desnaturação e 35 ciclos de reação PCR consistindo em um passo de ressarcialização, uma etapa de alongamento e uma etapa de desnaturação de acordo com o manuscrito.Após os ciclos, realize uma etapa de alongamento finalizadora por cinco minutos. Use cinco microliters do produto PCR para verificar a qualidade por eletroforese de gel agarose. Observe o gene COX1 ou ND amplificado como uma única banda em 759 ou 748 pares de base, respectivamente.Para purificar o resto do produto PCR, adicione 100 microliters de tampão de ligação de DNA contendo altas concentrações de sais chaotrópicos a cada amostra. Vórtice brevemente para misturar o conteúdo. Coloque uma coluna de purificação em um tubo de centrífuga de dois mililitros.Pipeta a mistura de reação na coluna. Coloque o tubo com a coluna montada em uma centrífuga a 14.000 vezes g durante um minuto em temperatura ambiente. Depois de descartar o filtrado do tubo centrífuga de dois mililitros, lave duas vezes com 700 e 400 microliters de solução de lavagem W2 por centrifugação a 14.000 vezes g.Em seguida, aqueça um mililitro de água deionizada a 65 graus Celsius em um aquecedor de blocos de metal. Transfira a coluna para um novo tubo de centrífuga de 1,5 mililitro e 25 microliters da água desorganizada pré-aque para o centro da membrana da coluna branca. Deixe a membrana absorver por um minuto em temperatura ambiente.Em seguida, centrifufique o tubo com a coluna a 14.000 vezes g por um minuto em temperatura ambiente. Descarte a coluna e armazene o produto PCR purificado por até 12 meses a menos 20 graus Celsius. Opcionalmente, os primers reversos COX1 ou ND também podem ser usados para sequenciamento bidirecional.Para sequenciamento Sanger, use o primer avançado RELEVANTE COX1 ou ND. Depois de recuperar os resultados de sequenciamento, compare as sequências com a sequência de genoma da cepa de referência de ostra do Pacífico usando a ferramenta on-line NCBI Nucleotide BLAST. Use os respectivos primers dianteiros e invertidos dos genes MgUGD e MgUXS para amplificar e purificar pelo PCR, como feito anteriormente.Depois de incubar produtos PCR purificados com tampão de digestão, prepare o vetor pET-30a predigested dissolvendo 500 nanogramas de pET-30a em um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro e adicione água deionizada para completar até 16 microlitugas. Em seguida, adicione dois microlitadores de tampão de digestão 10 vezes concentrado e um microliter cada uma das 20 unidades de restrição endonucleases Nde1 e Xho1 no tubo. Incubar a mistura a 37 graus Celsius por três horas.Depois disso, adicione um microliter de fosfattase alcalina de uma unidade e incubar a 37 graus Celsius por mais uma hora. Em seguida, coloque o tubo em um aquecedor de bloco metálico pré-aquecido a 75 graus Celsius por 10 minutos para inativar a fosfatase alcalina. Depois de cultivar células E.coli BL21 com os genes MgUGD e MgUXS, transfira a cultura para um meio LB de 400 mililitros em um frasco de dois litros, e coloque-a em um shaker a 200 rpm a uma temperatura de 37 graus Celsius.Após três horas, verifique a densidade óptica em um fotômetro em um comprimento de onda de 600 nanômetros, e certifique-se de que ele atinge uma absorção de aproximadamente 0,5. Em seguida, reduza a temperatura do agitador para 20 graus Celsius. Adicione 400 microliters de IPTG de um molar para induzir a expressão das proteínas recombinantes por três horas.Depois de colher as células, interrompa as células por sônica por 20 minutos a quatro graus Celsius. Centrifugar a 14.000 vezes g e quatro graus Celsius por 20 minutos, e coletar o supernasal em um novo tubo para o teste de atividade. Após o ensaio de atividade, sacie as reações adicionando 20 microliters de metanol e 40 microliters de clorofórmio às misturas MgUXS e MgUGD.Vórtice as misturas de amostra, e centrífuga a 14.000 vezes g durante seis minutos e quatro graus Celsius. Colete a camada aquosa superior de cada tubo em novos tubos para espectrometria de massa MALDI-TOF. Neste experimento, o alinhamento sequencial das sequências genéticas COX1 e ND de um espécime altamente divergente foi comparado com a linha de ostras do Pacífico de referência.As setas vermelhas mostram diferenças de nucleotídeos entre a sequência de referência e a sequência das amostras de cDNA obtidas. As sequências dos genes COX1 e ND de um espécime de ostra intimamente relacionado mostram baixa divergência da linha de ostras do Pacífico de referência. A espectrometria de massa MALDI-TOF mostra a aplicação bem sucedida da biblioteca cDNA para clonar os genes industrialmente relevantes MgUGD e MgUXS.A imagem em gel também identifica o ácido UDP-glucuronic e o UDP-xilose gerado pela ação enzimática do MgUGD e MgUXS sucessivamente expressos e purificados. Este método não requer uma combinação perfeita entre a sequência de referência e as sequências de marcadores obtidas e deve dar ao pesquisador confiança para trabalhar com ostras nãoferências. Em princípio, este método pode ser aplicado a qualquer amostra biológica nãoferência para a qual sequências de uma espécie de referência intimamente relacionadas estão disponíveis publicamente.Este método permite que pesquisadores não especialistas acessem facilmente material genético de potencial importância biológica e abre caminho para que mais cientistas trabalhem com amostras biológicas facilmente acessíveis, mas incompletamente identificadas.

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Bioengineering

Bioengenharia

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Aqui nós descrevemos um método para a preparação de ambos única leitura e emparelhado final Illumina mRNA Seq-libraries seqüenciamento para análise de expressão gênica com base na amplificação T7 RNA linear. Este protocolo requer apenas 10 nanogramas de começar RNA total e gera bibliotecas altamente consistentes representando transcrições todo.

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Contaminação durante o sequenciamento de genoma de organismos microscópicos continua a ser um grande problema. Aqui, nós mostramos um método para sequenciar o genoma de um Tardigrada de um único espécime com tão pouco quanto 50 pg de DNA genômico sem amplificação do genoma inteiro para minimizar o risco de contaminação.

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