Name: VirWaTest, um método de ponto de uso para a detecção de vírus em amostras de água (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 32 s
Description: Aprenda o método VirWaTest para detecção de vírus entéricos em amostras de água usando concentração viral e extração de ácido nucleico. Esta técnica portátil melhora a segurança hídrica em contextos humanitários.

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O VirWaTest foi um projeto de pesquisa financiado pelo programa de fundos de inovação humanitária (HIF) da ELHRA (aprimorando o aprendizado & pesquisa para assistência humanitária). Os autores reconhecem as equipes de WASH que gentilmente colaboraram neste estudo. A análise de amostras no Equador foi financiada pela Oxfam Ecuador e Dirección de Investigaciones de la Universidad de las Americas (AMB. BRT. 17.01). S. Bofill-mas é um companheiro da Serra-caçador na Universidade de Barcelona.

1. preparação e embalagem
Nota: os materiais/equipamentos a serem embalados estão listados na tabela 1. Use luvas para manusear os reagentes necessários para o controle do processo, os reagentes de concentração, os reagentes de extração de ácido nucleico e os reagentes de detecção. Use óculos protetores para manusear os reagentes necessários para a extração de ácido nucleico.
<ol><li>Controle de processo
	<ol>
<li>Prepare a cultura de ações do bacteriófago de MS2 (American Type Culture Collection [ATCC] 15597-B1) contendo 1 x 1010 pfu/ml em laboratório seguindo o procedimento ISO 10705-1:199514.</li>
		<li>Em seguida, alíquota 10 μL da suspensão por tubo contendo 1 x 108 Pfu em tubos de 10 ml e deixe a água evalhar a 37 ° c. Use um tubo por amostra de água.</li>
		<li>Além disso, prepare um tubo contendo 10 mL de água destilada estéril por amostra coletada.</li>
	</ol></li>
	<li>Reagentes de concentração
	<ol>
<li>Para a solução de leite desnatado pré-floculada (PSM), use as seguintes quantidades para concentrar amostras de água de 5 10 L.<ol>
<li>Prepare um tubo de plástico contendo 5 g de leite desnatado.</li>
			<li>Prepare um saco de plástico com zíper contendo 16,66 g de sais marinhos.</li>
			<li>Prepare uma garrafa plástica contendo 500 mL de água destilada.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Prepare os reagentes necessários para o ajuste do pH. Use as seguintes quantidades para ajustar o pH do PSM e de amostras de água de 5 10 L.<ol>
<li>Adicionar 5 g de ácido cítrico 1-hidrato a um tubo de plástico de 10 mL. PRECAUÇÃO: o ácido cítrico provoca irritação grave quando entra em contacto com os olhos. Se isto ocorrer, lave o olho cautelosamente com água durante vários minutos. Se a irritação persistir, procure aconselhamento médico.</li>
			<li>Colocar 2 g de hidróxido de sódio num tubo plástico de 10 mL. PRECAUÇÃO: o hidróxido de sódio pode provocar queimaduras cutâneas graves e danos oculares. Se ingerido, lave a boca. Não induzir o vômito. Se ele entra em contato com os olhos, enxaguar com cautela com água por vários minutos. Em seguida, procure aconselhamento médico.</li>
			<li>Coloque 25 mL de água destilada estéril em um recipiente de plástico.</li>
			<li>Colocar 50 mL de água destilada estéril num recipiente de plástico.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Prepare a saqueta de condicionamento da amostra utilizada para a floculação, a solução conservante utilizada para preservar os ácidos nucleicos e a saqueta neutralizadora para neutralizar a água e os materiais descartados. Use as seguintes quantidades para cada amostra de água de 10 L a ser testada.<ol>
<li>Coloque 15 g de sais marinhos e 8 g de ácido cítrico 1-hidrata em um saco de plástico com zíper para a saqueta de condicionamento.</li>
			<li>Adicionar 2 mL de tampão de lise (tabela de materiais) e 0,3 ml de agente de preservação de ácidos nucleicos (tabela de materiais) a um tubo de 5 ml. PRECAUÇÃO: o tampão de Lise contém tiocianato de guanidina e Triton X-100. Contato com ácido liberta gás tóxico, e é prejudicial se ingerido, inalado, ou entra em contato com a pele. Se ingerido, lave a boca. Não induzir o vômito. Se ele entra em contato com a pele, lave com muita água. Em seguida, procure aconselhamento médico. O agente de preservação do ácido nucleico causa a irritação da pele e do olho e é prejudicial se engolido. Se ele entra em contato com a pele ou os olhos, enxaguar com água abundante por vários minutos. Em qualquer caso, especialmente se ingerido e sentindo-se mal, procurar aconselhamento médico.</li>
			<li>Põr 40 g do pó detergente em quatro sacos plásticos do zipper. PRECAUÇÃO: o detergente em pó provoca irritação ocular. Se vier em contacto com os olhos, enxague com água abundante durante vários minutos. Se a irritação persistir ou se engolida, procure aconselhamento médico.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Reagentes de extração de ácido nucleico
	<ol>
<li>Coloque 50 μL de partículas magnéticas (tabela de materiais) e 1 ml de etanol 96% em um tubo de 5 ml que constituem o tampão de ligação. PRECAUÇÃO: o tampão de partículas magnéticas contém azida sódica, que forma um gás tóxico quando entra em contacto com ácidos ou íons metálicos pesados e é tóxico se ingerido ou quando entra em contacto com a pele. Se ingerido ou em contacto com a pele, enxague a boca ou a pele com água abundante e procure aconselhamento médico. O etanol é um líquido altamente inflamável e vapor e provoca irritação ocular grave. Manter afastado do calor, superfícies quentes, faíscas, e qualquer outra fonte de ignição. Se ele entra em contato com a pele ou os olhos, enxaguar com água abundante. Em caso de ingestão de grandes quantidades de água e/ou se inalado, ir para fora para o ar fresco. Em qualquer caso, procure aconselhamento médico.</li>
		<li>Adicionar 500 μl, 600 μL, e 200 μL de tampões de lavagem 1, 2, e 3, respectivamente (tabela de materiais), a três tubos de 2 ml. Cuidado: os tampões de lavagem contêm o tiocianato do guanidina e o cloreto do guanidina, que são prejudiciais se inalados ou engolidos e irrigar a pele e os olhos. Contato com ácidos libera gás muito tóxico. Se eles entram em contato com a pele ou os olhos, enxaguar com água abundante. Se ingerido, lave a boca com água abundante. Não induzir o vômito. Procure sempre aconselhamento médico.</li>
		<li>Adicionar 120 μL de tampão de eluição (tabela de materiais) a um tubo de 0,5 ml.</li>
	</ol></li>
	<li>Reagentes de detecção de HAdV e MS2 Nota: duas reações diferentes da extração do ácido nucleico podem ser analisadas simultaneamente em cada ensaio do PCR se um termociclador 8-well é usado. Para todos os ensaios de PCR, prepare a água da biologia molecular alicitado em 1,5 tubos de mL.<ol>
<li>
Detecção de HAdV
		<ol>
<li>Prepare uma mistura contendo 10 μL de primer para a frente do AdF de 22,5 μM, 10 μL de primer reverso de 22,5 μM AdR e 5 μL de sonda AdP de 11,25 μM (tabela 2).</li>
			<li>Adicionar 2,5 μL da mistura aos tubos de 1 a 8 de uma tira de tubo. Deixe secar à temperatura ambiente, feche os tubos e mantenha-os protegidos da luz.</li>
			<li>Corte a tira dividindo-a em duas tiras: tubos 1-5 e tubos 6-8.</li>
			<li>Prepare uma diluição em série de suspensões de DNA contendo a sequência de nucleotídeo da região HAdV amplificada. Ar-seco 1 μL de suspensões contendo 1 x 105, 1 x 107e 1 x 109 GC/ml em tubos 6-8. Nota: Mantenha os tubos contendo os primers, a sonda e as suspensões secas ao ar protegidas da luz.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Detecção de MS2
		<ol>
<li>Prepare uma mistura contendo 10 μL de primer para a frente Pecson-2F de 25 μM, 10 μL de primer reverso Pecson-2R de 25 μM e 2,5 μL de sonda PecP-2 de 25 μM (tabela 2).</li>
			<li>Adicionar 2,25 μL da mistura aos tubos de 1 a 8 de uma tira de tubo. Deixe secar à temperatura ambiente, feche os tubos e mantenha-os protegidos da luz.</li>
			<li>Corte a tira dividindo-a em duas tiras: tubos 1-5 e tubos 6-8.</li>
			<li>Prossiga como na etapa 1.4.1.4 mas use uma suspensão padrão projetada para o MS2 preferivelmente.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>2. concentração viral
Nota: use luvas em todos os momentos durante a coleta de amostras, preparação de reagentes, floculação, coleta de flocos e procedimentos de descarte de resíduos. Use óculos de proteção durante o procedimento de preparação do reagente.
<ol><li>Coleta de amostra
	<ol>
<li>Colete uma amostra de água de 10 L em um balde de fundo plano com uma tampa. Colete um mínimo de duas repetições para cada amostra. Nota: é importante usar baldes claros para visualizar o pellet. Se a amostra de água contiver material suspenso (por exemplo, areia, algas), deixe-o sedimento e, em seguida, colete o sobrenadante de água em um novo balde.</li>
		<li>Registre o volume coletado, bem como a data de localização e coleta, para cada amostra de água.</li>
		<li>Põr um agitador magnético conectado a uma bateria um apoio da cubeta e coloc a cubeta que contem a amostra da água em seu apoio. Observação: Procure uma superfície plana em um local fresco e mantenha os baldes contendo as amostras de água da luz solar direta.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação de reagentes
	<ol>
<li>
reagentes de ajuste de pH
		<ol>
<li>Despeje o pó de ácido cítrico e as pelotas de hidróxido de sódio nos vasos contendo 25 e 50 mL de água destilada, respectivamente.</li>
			<li>Agitar suavemente à mão até que o ácido cítrico e o hidróxido de sódio sejam completamente dissolvidos. Atenção: não deite a água sobre as pastilhas de hidróxido de sódio. Em vez disso, Despeje as pelotas de hidróxido de sódio sobre a água.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Leite desnatado preflocculated
		<ol>
<li>Coloque um saco de stand-up em um agitador magnético e despeje 500 mL de água destilada nele. Deixe cair um ímã de agitação dentro do saco e gire sobre o agitador magnético.</li>
			<li>Despeje o conteúdo de um saquinho de sal marinho e de um tubo de leite desnatado no saco de stand-up e mexa por 5 min em velocidade média para dissolvê-los.</li>
			<li>Adicione 3 mL de ácido cítrico à solução de PSM usando uma pipeta de Pasteur para certificar-se que o pH está entre 3,4 e 3,6. Meça o pH da solução PSM usando tiras indicadoras de pH. Adicionar pequenas quantidades de ácido cítrico e hidróxido de sódio como o pH se aproxima de 3,5.</li>
			<li>Desligue o agitador magnético e certifique-se de que os flocos estão visíveis. Use uma lanterna para ajudar a visualizar os flocs.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Floculação
	<ol>
<li>Deixe cair um ímã de agitação na água, ajuste o agitador magnético na velocidade máxima, e gire-o sobre. Certifique-se de que o íman de agitação começa a girar.</li>
		<li>Adicione 10 mL de água destilada a um tubo de controle de processo. Inverta o tubo algumas vezes para Rehidratar o estoque viral e despeje a solução na água.</li>
		<li>Despeje o conteúdo de um saquinho de condicionamento da amostra na água e mexa por 5 min.</li>
		<li>Meça o pH da amostra de água usando tiras indicadoras de pH. Adicione algumas gotas de ácido cítrico ou hidróxido de sódio para a amostra de água para se certificar de que o pH está entre 3,4 e 3,6. Adicionar pequenas quantidades de ácido cítrico e hidróxido de sódio como o pH se aproxima de 3,5.</li>
		<li>Adicione 100 mL da solução PSM usando um recipiente de 100 mL.</li>
		<li>Sele a cubeta com a tampa, ajuste o agitador magnético na velocidade mínima, e deixe a agitação da água por 8 h.</li>
		<li>Desligue o agitador magnético e deixe a água ainda por pelo menos 5 h para permitir que os flocos se instalem.</li>
	</ol></li>
	<li>FLOC coleção
	<ol>
<li>Construa um sistema desviando compor de um controlador da pipeta, de duas pipetas, e de um tubo plástico, para aspirar o sobrenadante da água para descarregar a água nos flocs.<ol>
<li>Fixe uma pipeta de 10 mL de fita no controlador da pipeta. Em seguida, prenda a ponta da pipeta ao tubo de plástico.</li>
			<li>Retire o filtro de uma pipeta de ponta aberta de 10 mL com uma pinça e prenda a pipeta ao tubo de plástico.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Coloque um balde vazio no chão.</li>
		<li>Mergulhe a ponta da pipeta de ponta aberta na água. Certifique-se de mantê-lo perto da superfície da água para evitar perturbar os flocs. Aspirar o sobrenadante de água até atingir a pipeta de fita-final.</li>
		<li>Aperte o tubo de plástico na extremidade fixada à pipeta de fita e retire-a da pipeta.</li>
		<li>Coloque o tubo em um balde vazio. Libere a pressão no tubo para deixar o fluxo de água no balde vazio.</li>
		<li>Aperte o tubo de plástico para parar o fluxo de água quando o nível da água está prestes a chegar ao ímã de agitação e mova a pipeta para longe da caçamba.</li>
		<li>Agitar o balde para ressuscita os flocos e despeje-os em um saco plástico stand-up de 500 mL. Permita que os flocos se instalem por mais 1 h.</li>
		<li>Aspirar com cuidado o sobrenadante da água usando uma pipeta de 50 mL e um controlador manual da pipeta, evitando perturbar os flocs.</li>
		<li>Aspirar os flocos usando uma pipeta de 100 mL e transferi-los para um tubo de centrifugação graduado de 50 mL. Anote o volume final do concentrado de amostra e transfira 1 mL do mesmo para um tubo de 5 mL contendo a solução conservante, utilizando uma pipeta Pasteur. Nota: é importante que o tubo de centrifugação seja graduado para que o volume final da amostra concentrada possa ser medido da forma mais precisa possível e registado.</li>
		<li>Realize a extração de ácido nucleico no campo. Alternativamente, armazene a solução conservante contendo os vírus a 20-30 ° c por até 15 dias ou envie-os para um laboratório de referência para posterior análise.</li>
	</ol></li>
	<li>Descarte de resíduos e reutilização de materiais
	<ol>
<li>Adicione o conteúdo de um saquinho de agente neutralizador ao balde que contém a água descartada. Misture a água, e então, deixá-lo ainda por 30 min.</li>
		<li>Elimine a água tratada como resíduo geral.</li>
		<li>Coloque as pipetas e o tubo de plástico no interior da caçamba. Encha o balde com água e despeje o conteúdo de uma saqueta agente neutralizante.</li>
		<li>Lave-os por pelo menos 30 minutos para esterilizá-los e enxágüe-os com água limpa abundante para remover qualquer agente neutralizador remanescente.</li>
	</ol></li>
</ol>3. extração de ácido nucleico
Nota: usar luvas e sempre usar óculos protetores durante o procedimento de extração de ácido nucleico.
<ol><li>
Operação de pipeta magnética
	<ol>
<li>Familiarize-se com a operação da pipeta magnética antes de realizar a extração.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Extração de ácido nucleico
	<ol>
<li>Organize os tubos contendo os reagentes necessários para a extração em um rack, da esquerda para a direita: tampão de ligação, buffers de lavagem e tampão de eluição. Defina o número apropriado de tubos de acordo com o número de amostras ou repetições que estão sendo analisadas.</li>
		<li>Transfira 1 mL de concentrado de amostra para o tubo que contém o tampão de ligação, utilizando uma pipeta Pasteur descartável. Inverta o tubo 8x a 10x para homogeneizar a solução.</li>
		<li>Incubar a solução à temperatura ambiente durante 10 min enquanto mistura continuamente, seja usando um orbital movido a energia solar ou manualmente.</li>
		<li>Colete as partículas magnéticas usando a pipeta magnética e uma ponta limpa, que possa ser reutilizada para os três amortecedores de lavagem.</li>
		<li>Liberte as partículas magnéticas no tubo contendo 500 μL de tampão de lavagem 1. Lave-os agitando suavemente a solução com a ponta por 30 s e recolhê-los.</li>
		<li>Transfira as partículas magnéticas para o tubo contendo 600 μL de tampão de lavagem 2. Lave-os agitando suavemente a solução com a ponta por 30 s e recolhê-los.</li>
		<li>Transfira as partículas magnéticas para o tubo contendo 200 μL de tampão de lavagem 3. Lave-os agitando suavemente a solução com a ponta por 30 s e recolhê-los.</li>
		<li>Solte as partículas magnéticas no tubo que contém o tampão de eluição e descarte a ponta.</li>
		<li>Incubar a solução à temperatura ambiente durante 5 min enquanto mistura continuamente, utilizando o orbital movido a energia solar. Nota: a mistura das partículas magnéticas no tampão de eluição é uma etapa crucial. Em caso de falta de um orbital, misture continuamente à mão durante o tempo de incubação.</li>
		<li>Substitua a ponta na pipeta magnética por uma nova e colete as partículas magnéticas do tampão de eluição. Certifique-se de remover completamente as partículas magnéticas do tampão de eluição, uma vez que podem interferir com os métodos de detecção molecular.</li>
		<li>Descarte a ponta com as partículas anexadas a ela. Prossiga com a análise de PCR, envie o tampão de eluição para um laboratório de referência ou armazene o tampão de eluição em 4 ° c para análise posterior.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. detecção viral com uma bateria-operado oito-tubo em tempo real termociclador
Nota: usar luvas e sempre usar óculos protetores durante o procedimento de detecção de ácidos nucleicos. Substitua as luvas para os novos ao realizar um novo experimento de PCR para evitar a contaminação cruzada.
<ol><li>
PCR quantitativo de HAdV
	<ol>
<li>Adicionar 14 μL de água sem nuclease aos tubos 2, 4 e 5.</li>
		<li>Adicionar 4 μL de mistura de PCR aos tubos 1-5.</li>
		<li>Adicionar 14 μL de extração de ácido nucleico da amostra a ao tubo 1 e 14 μL da amostra B ao tubo 3.</li>
		<li>Adicionar 2 μL de ácidos nucleicos extraídos da amostra a ao tubo 2 e 2 μL da amostra B ao tubo 4. Feche a tira de cinco tubos.</li>
		<li>Adicionar 14 μL de água sem nuclease aos tubos 6, 7 e 8.</li>
		<li>Adicione 4 μL desta mistura aos tubos 6, 7 e 8 e feche-os.</li>
		<li>Coloque as duas tiras no termocicer e selecione a corrida apropriada (tabela 3).</li>
		<li>Descarte o tubo de água e mantenha o ácido nucleico extraído no congelador, se possível, ou, se não, em um lugar fresco protegido da luz caso que um segundo teste precisa de ser executado.</li>
		<li>Limpe as micropipetas, a cremalheira, o material de trabalho, e todo o material corretamente com um líquido de limpeza ácido nucleico, e descarte o saco de plástico que contem a ponta, as luvas, e os tubos usados. Cuidado: o removedor de ácido nucleico é um líquido e um vapor muito inflamáveis. Não respire na névoa de pulverização e evite qualquer contato do líquido com os olhos ou a pele. Caso contrário, enxaguar imediatamente com água abundante e procurar aconselhamento médico.</li>
		<li>Colete os resultados e analise os dados obtidos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
MS2 PCR quantitativo
	<ol>
<li>Adicionar 14 μL de água sem nuclease aos tubos 2, 4 e 5.</li>
		<li>Adicionar 4 μL de mistura de PCR e 0,5 μL de enzima transcriptase reversa em tubos 1-5.</li>
		<li>Adicionar 14 μL de extração de ácido nucleico da amostra a ao tubo 1 e 14 μL da amostra B ao tubo 3.</li>
		<li>Adicionar 1 μL de ácidos nucleicos extraídos da amostra a ao tubo 2 e 1 μL da amostra B ao tubo 4. Feche a tira de cinco tubos.</li>
		<li>Adicione 15,5 μL de água sem nuclease aos tubos 5, 6, 7 e 8 e feche-os.</li>
		<li>Adicionar 4 μL de mistura de PCR e 0,5 μL de enzima transcriptase reversa nos tubos 6, 7 e 8.</li>
		<li>Coloque as duas tiras no termocicer e selecione a corrida apropriada (tabela 3).</li>
		<li>Proceda conforme descrito nas etapas 4.1.8 a 4.1.10.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O método VirWaTest permite a concentração de vírus e extração de ácido nucleico de amostras de água no ponto de uso por usuários não experientes. É um protocolo acessível, rápido e simples. A concentração baseia-se no princípio da floculação orgânica utilizando leite desnatado, pelo qual o pH baixo e as condições de alta condutividade tornam as proteínas do leite desnatadas agregadas em flocos os vírus adsorver. Quando o sedimento do flocos, é fácil recolhê-los, fazendo o possível concentrar 10 litros da água, visto que ...

Durante as primeiras fases de qualquer emergência humanitária, o acesso a fontes de água potável, saneamento e higiene são fundamentais para a sobrevivência dos afetados. Portanto, a monitorização da qualidade da água é uma prioridade para prevenir surtos de águas. É bem sabido que a água contaminada é freqüentemente a origem das doenças, mas muitas vezes é difícil determinar as fontes de surtos virais, como o vírus da hepatite E (HEV), mesmo com a disponibilidade de métodos laboratoriais convencionais. O controle da qualidade da água é baseado na quantificação de FIB1,2,3,4. No entanto, tem sido extensivamente documentado que não há correlação entre a ausência de FIB e a presença de patógenos transmitidos por água viral, como rotavírus (RoV), norovírus (NoV) ou HEV5,6. Assim, o uso dos critérios de qualidade da água baseados em FIB pode resultar em uma subestimação dos riscos associados à presença de patógenos virais transmitidas por águas. A vigilância de vírus indicativos, tais como adenovírus humanos (hadv), ou patógenos específicos seria útil na definição da exposição a patógenos virais e identificando a fonte potencial de infecção humana7,8, 9,10 e na validação da eficácia das medidas sanitárias11.
Até agora, a detecção de vírus nesses cenários dependia de pessoal qualificado e logística complexa. VirWaTest (virwatest.org) destina-se ao desenvolvimento de um método simples, acessível e portátil para a concentração e subsequente detecção de vírus de amostras de água no ponto de uso.
A concentração de vírus é baseada no princípio da floculação orgânica de amostras de água de 10 L, pelas quais os vírus são recuperados em volumes menores12,13. Os flocos são recolhidos e adicionados a um tampão que lise os vírus e impede que os ácidos nucleicos da degradação quando armazenados na temperatura ambiente por não mais de 2 semanas.
O método da extração do ácido nucleico é baseado no uso de partículas magnéticas a que os ácidos nucleicos começ adsorbed. Eles podem ser transferidos de um tampão de lavagem para outro e, finalmente, para o tampão de eluição usando uma pipeta magnética à qual as partículas se unem. As suspensões de ácidos nucleicos virais obtidas podem ser enviadas para um laboratório de referência, onde a detecção pode ser realizada usando métodos moleculares baseados em PCR. Para cada extração de ácido nucleico, duas quantidades diferentes são testadas para descartar a inibição enzimática originada pela amostra. Alternativamente, com a disponibilidade mínima do equipamento, os testes de PCR podem ser executados no ponto de uso. Todo o processo é projetado para ser realizado independentemente de uma fonte de alimentação (Figura 1).
Um ensaio quantitativo de PCR para detectar HAdV, excretado por humanos e encontrado em amostras de águas residuais em altas concentrações, foi adaptado para ser executado no ponto de uso. HAdV são usados como indicadores virais fecais humanos. Um PCR para a quantificação do bacteriófago de MS2 foi adaptado igualmente desde que MS2 é usado em VirWaTest como o controle do processo. O método pode ser personalizado para a detecção de qualquer vírus de interesse.
Após o desenvolvimento, o método VirWaTest tem sido aplicado pelos usuários em duas configurações diferentes na República da África Central (RCA) e no Equador, fornecendo feedback sobre a aplicação do protocolo em situações reais.
A nosso conhecimento, este é o primeiro procedimento que permite a concentração e a deteção dos vírus no ponto de uso, independente de toda a fonte de alimentação, equipamento grande, e condições de congelação/refrigerando. Recomenda-se a coleta de duas repetições de cada amostra de água, a fim de obter resultados robustos.

<table><tbody><tr><td>5x HOT FIREPol Probe qPCR Mix Plus (ROX)</td><td>Solis BioDyne</td><td>08-14-00001</td><td>Inclui Solis Biodyne's 5x HOT FIREPol Probe qPCR Mix Plus (qPCR Mix), 50 Reações</td></tr><tr><td>8-Microtube Strips com Caps</td><td>dD Biolab</td><td>840637</td><td>Perfil Baixo, Paredes Finas, Adaptadas para Baterias PCR Quantitativas e</td></tr><tr><td>Qualitativas e Adaptadores de Energia para Agitador</td><td>Magnético GenIUL</td><td>900011674</td><td>Inclui energia de carro de 12V adaptador</td></tr><tr><td>Balde de suporte</td><td>GenIUL</td><td>900011648</td> Balde <td>de suporte de alumínio</td></tr><tr><td>, 10 L</td><td>Cater4You</td><td>10LTR</td><td>Polipropileno, inviolável, Tubo</td></tr> de <tr><td>centrífuga de cor clara, 50 mL</td><td>LabBox</td><td>CTSP-E50-050</td><td>Polipropileno, Estéril, Graduado, Com Saia</td></tr><tr><td>Ácido Cítrico 1-Hidrato, 500 g</td><td>PanReac AppliChem</td><td>1410181211</td><td>Puro, Grau Farmacêutico, 1 Quilograma</td></tr><tr><td>Garrafa PET Transparente</td><td>LabBox</td><td>FPET-500-088</td><td>Cor Transparente, PET, Tampa Não Incluída</td></tr><tr><td>Leite Desnatado Difco, 500 g</td><td>Becton Dickinson</td><td>232100</td> Escudo de DNA/RNA <td>Desidratado</td></tr><tr><td>, 250 mL</td> Meio de Preservação de DNA/RNA <td>Zymo Research</td><td>R1100-250</td>, Controlador de Pipeta Easy9 <td>de 250 mL</td></tr><tr><td></td><td>LabBox</td><td>EAS9-001-001</td><td>0,3 &mu; m filtro, pipetas de 0,1 a 100 mL, suporte de pipeta de silicone autoclavável</td></tr><tr><td>Eppendorf Tube, 0,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030121023</td><td>Polypropilene, Safe-Lock</td></tr><tr><td>Eppendorf Tube, 2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030120094</td><td>Polypropilene, Safe-Lock</td></tr><tr><td>Eppendorf Tube, 5 mL</td><td>dD Biolab</td><td>999542</td><td>Polipropileno, Estéril, Etanol graduado</td></tr><tr><td>96% V/V, 1 L</td><td>Panreac AppliChem</td><td>361085-1611</td><td>Para UV, IR&nbsp; e HPLC</td></tr><tr><td>Pinças de Laboratório</td><td>LabBox</td><td>FORS-007-002</td><td>Fino, Extremidade Curvada, L= 120 mm</td></tr><tr><td>Agitador Magnético</td><td>GenIUL</td><td>900017000</td><td>Marcador alimentado por</td></tr><tr><td>bateria</td><td>dD Biolab</td><td>929203</td><td>Preto, Ponta extra fina, Resistente à água, Secagem rápida, Para Plástico e Vidraria</td></tr><tr><td>Micro Rota-Rack para Microtubos</td><td>dD Biolab</td><td>37782</td><td>4 Módulos, L x W x H= 208 x 100 x 100 mm</td></tr><tr><td>Mini8 Ciclador de PCR em Tempo Real</td><td>Coyote Biosciences, China</td><td>Mini-8</td><td>Portátil, Funciona com Fontes de Alimentação de 12V ou Baterias Externas, Dois canais, Capacidade para 8 Tubos</td></tr><tr><td>NucliSens Lysis Buffer</td><td>Biomerieux</td><td>200292</td><td>Reagentes para até 48 Isolamentos, Armazenar à Temperatura Ambiente</td></tr><tr><td>Pipeta Sorológica de Ponta Aberta, 10 mL</td><td>Deltalab</td><td>900136N</td><td>Estéril, Embalado Individualmente (Papel/Plástico)</td></tr> <tr><td>Tampa de Rosca PE PP28</td><td>LabBox</td><td>TP28-004-020</td><td>Para Garrafas PET</td></tr><tr><td>Faixa Indicadora de pH</td><td>LabBox</td><td>WSPH-001-001</td><td>Faixa pH 2.8 a pH 4.4, 50 Tiras por Pacote</td></tr><tr><td>Tubo de Ensaio de Plástico</td><td>Quimikals</td><td>300913</td><td>Inclui</td></tr><tr><td>Tampa Pipeta de Polietileno Pasteur</td><td>LabBox</td><td>PIPP-003-500</td><td>Graduado, 7 mL Volume Total, Frasco de rosca de polipropileno não estéril</td></tr><tr><td>com tampa de rosca, 150 mL</td><td></td><td>Deltalab 409726</td><td>Tampa de rosca, estéril, graduado até 100 mL</td></tr><tr><td>Frasco de rosca de polipropileno com tampa de rosca, 60 mL</td><td>Deltalab</td><td>409526G</td><td>Tampa de rosca, estéril, graduada até 50 mL Detergente</td></tr><tr><td>em pó em pó</td> <td>-</td><td></td> <td>Sabão em pó comum para lavar roupas</td></tr><tr><td>Cabos de alimentação para agitador magnético</td><td>GenIUL</td><td>900011692</td><td>Conexão entre baterias e agitadores magnéticos</td></tr><tr><td>QuickPick Ferramenta Magnética</td><td>BioNobile</td><td>24001</td><td>Ferramenta portátil para partículas magnéticas</td></tr><tr><td>Pontas QuickPick na Caixa</td><td>BioNobile</td><td>24296</td><td>Livre de RNase, Autoclavado, 96 Unidades</td></tr><tr><td>QuickPick XL gDNA Partículas Magnéticas</td><td>BioNobile</td><td>SN51100</td><td>3.2 mL</td></tr><tr><td>Sais Marinhos</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9883-500G</td><td>Uma mistura de sal artificial que se assemelha muito à composição dos sais dissolvidos da água do oceano</td></tr><tr><td>Tubo de Silicone</td><td>LabBox</td><td>SILT-006-005</td><td>Rolo de 5 Metros, Interno&nbsp; &oslash; x Externo&nbsp; &oslash;= 6 x 10 mm</td></tr><tr><td>Pellets de Hidróxido de Sódio, 98,5 - 100,5%</td><td>VWR Produtos Químicos</td><td>28244295</td><td>Pellets,</td></tr><tr><td>Plataforma Rotativa Solar</td> de 1 Kg <td>SOL-EXPERT Group</td><td>70020</td><td>Placa de Acrílico, 10 RPM, Suporta até 300 Gramas</td></tr><tr><td>SOLIScript Kit de Sonda de 1 passo</td><td>Solis BioDyne</td><td>08-57-00250</td><td>Inclui Solis Biodyne's 5x One-Step Probe Mix (qPCR Mix) e 40x One-Step SOLIScript Mix (Enzima Transcriptase Reversa), 250 Reações</td></tr><tr><td>SPEEDTOOLS Kit de Extração de Vírus RNA</td><td>BioTools</td><td>21.141-4197</td><td>Inclui o tampão BAW (tampão de lavagem 1), o tampão BAV3 (tampão de lavagem 2 e 3) e o tampão BRE (tampão de eluição) da BioTools.</td></tr><tr><td>Ímã de agitação octoédrico SpinBar</td><td>dD Biolab</td><td>045926</td><td>Pivot Ring, L x&nbsp; &oslash; = 38 x 8 mm,</td></tr><tr><td>Pipeta sorológica com ponta de fita azul, 10 mL</td><td>Deltalab</td><td>PN10E1</td><td>Estéril, Embalada Individualmente (Papel/Plástico)</td></tr><tr><td>Pipeta sorológica com ponta de fita, 50 mL</td><td>Deltalab</td><td>900043</td><td>Estéril, Embalada individualmente (Papel/Plástico)</td></tr><tr><td>Termi-DNA-Tor - Removedor</td> <td>de Ácido NucleicoBioTools</td><td>22001-4291</td><td>Removedor de ácidos nucleicos, bactérias, fungos e micoplasma de materiais e superfícies, 450 mL</td></tr><tr><td>de Reagente de Biologia Molecular de Água, 1L</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W4502-1L</td><td>Livre de Nuclease e Protease, 0.1 &mu; m Saco</td></tr><tr><td>Whirl-Pak filtrado, 540 mL</td><td>Deltalab</td><td>200361</td><td>Fundo estável</td></tr><tr><td>Saco liso com fecho de correr</td><td>LabBox</td><td>BZIP-080-100</td><td>Polietileno, C x L= 120 x 80 mm</td></tr></tbody></table>

virwatest, um método de ponto de uso para a detecção de vírus em amostras de água

VirWaTest, A Point-of-Use Method for the Detection of Viruses in Water Samples

Vírus excretados por seres humanos e animais podem contaminar fontes de água e representam um risco para a saúde humana quando esta água é usada para beber, irrigação de alimentos, lavagem, etc. O indicador clássico de bactérias fecais nem sempre verifica a presença de patógenos virais para que a detecção de patógenos virais e indicadores virais seja relevante para adotar medidas de mitigação de riscos, especialmente em cenários humanitários e em áreas onde as manifestações virais transmitidas pela água são freqüentes.
Atualmente, vários testes comerciais que permitem a quantificação de bactérias indicadoras fecais (FIB) estão disponíveis para testes no ponto de uso. No entanto, tais testes comerciais não estão disponíveis para a detecção de vírus. A detecção de vírus em amostras de água ambiental requer a concentração de vários litros em volumes menores. Além disso, uma vez concentrada, a detecção de vírus depende de métodos como extração de ácidos nucleicos e detecção molecular (por exemplo, reação em cadeia da polimerase [PCR]-ensaios baseados) dos genomas virais.
O método descrito aqui permite a concentração de vírus de amostras de água de 10 L, bem como a extração de ácidos nucleicos virais no ponto de uso, com equipamentos simples e portáteis. Isso permite o teste de amostras de água no ponto de uso para vários vírus e é útil em cenários humanitários, bem como em qualquer contexto onde um laboratório equipado não está disponível. Alternativamente, o método permite concentrar os vírus presentes em amostras de água e o transporte do concentrado para um laboratório à temperatura ambiente para posterior análise.

Desenvolvimento de método
Este procedimento foi desenvolvido no laboratório de contaminantes de vírus de água e alimentos com a colaboração de GenIUL e Oxfam Intermón. Compreende de três etapas diferentes. A primeira, a concentração de partículas virais, é uma adaptação de um método de floculação de leite desnatado previamente descrito12,17<su...

Aqui nós apresentamos VirWaTest, que é um método simples, disponível e portátil para a concentração e a deteção dos vírus das amostras da água no ponto do uso.

VirWaTest, um método de ponto de uso para a detecção de vírus em amostras de água

Viruses excreted by humans and animals may contaminate water sources and pose a risk to human health when this water is used for drinking, food ...

Os vírus entéricos são encontrados principalmente em diferentes reservatórios aquáticos, incluindo água subterrânea, água parada, córregos, rios e água r. Eles estão associados a riscos à saúde e são responsáveis por infecções em humanos. Vírus entéricos geralmente causam gastroenterite e são transmitidos principalmente pela rota fecal-oral.Outras doenças transmitidas pela água causam hepatite aguda pelo vírus da hepatite A e pelos vírus da hepatite E, com mortalidade associada significativa especialmente em relação à hepatite E em gestantes. Protocolos reais de monitoramento da qualidade da água propostos para contextos humanitários foram projetados para manter bactérias como a E.Coli como um indicador de contaminação fecal. Mas já se sabe que não há correlação com outros microrganismos, como vírus que são mais resistentes a muitos processos de ativação.Até agora, a detecção de vírus em ambientes de crise humanitária tem sido realizada adaptando protocolos existentes às condições desses contextos, e enviando amostras para laboratórios de referência para detecção molecular de vírus. Há necessidade de métodos para detectar patógenos virais e indicadores virais no ponto de vista para reduzir os riscos à saúde pública, prevenir surtos e aumentar a eficiência das intervenções humanitárias. Propomos um método para a detecção de vírus em amostras de água de 10 litros que é dividido em três etapas: concentração viral, extração de ácido nucleico e detecção viral.Todas essas etapas foram adaptadas a partir de métodos atualmente em uso em nosso laboratório, e podem ser realizadas no ponto de vista utilizando reagentes e equipamentos portáteis, produzindo os dependentes de alimentação e freezers. Além disso, uma solução de conservante foi adicionada ao método para justificar a estabilidade dos ácidos nucleicos para envio aos laboratórios de referência, se necessário. O método que propomos se chama VirWaTest e foi desenvolvido com a colaboração da GenIUL e da Intermon Oxfam.Antes de iniciar, o número de amostras a serem testadas deve ser considerado para a preparação de reagentes e material. Recomenda-se coletar duas réplicas de cada amostra de água para obter resultados representativos. Várias amostras podem ser testadas ao mesmo tempo se a quantidade apropriada de material estiver disponível.Os reagentes e materiais devem ser preparados e embalados antes de serem movidos ou enviados para o local onde o método é necessário. A lista de materiais e pequenos equipamentos que devem ser embalados está descrita na tabela um. Prepare um estoque de bacteriófago MS2 a ser adicionado a cada amostra de água como controle de processo seguindo o método ISO correspondente.Em seguida, distribua 10 microlitadores de uma suspensão contendo 10 a 10 unidades de plataforma pré-transformadas em tubos de 10 mL e deixe a água secar. Um tubo por amostra de água será necessário. Além disso, prepare um tubo contendo 10 mLs de água destilada estéril por amostra coletada.Para a solução de leite desnatado pré-floculada, prepare um tubo contendo o leite desnatado, um saco plástico de zíper contendo o sal marinho e uma garrafa plástica contendo a água destilada. Para ajuste de pH, prepare um tubo contendo o ácido cítrico, um tubo contendo o hidróxido de sódio e dois recipientes plásticos com 25 e 50 mLs de água destilada. Para cada amostra de água a ser testada, prepare um sachê condicionante adicionando os sais do mar e o ácido cítrico a um saco plástico de zíper, e uma solução de preservação adicionando o tampão de lise, e conservante de ácido nucleico, a um tubo de 5 mL.Por fim, prepare quatro sachês neutralizantes, adicionando detergente de potência a quatro sacos plásticos de zíper. Para cada amostra de água a ser extraída, prepare um tubo de cinco mL contendo partículas magnéticas e etanol, e três tubos de 2 mL contendo 500, 600 e 200 microliters de tampões de lavagem um, dois e três, respectivamente, e um tubo contendo tampão de eluição. Duas extrações diferentes de ácido nucleico podem ser analisadas simultaneamente em cada ensaio pcr se um termociclador Newell for usado.Para todos os ensaios da PCR, prepare a água da biologia molecular. Prepare misturas contendo dois primers e uma prova específica para cada vírus alvo de acordo com os volumes e concentrações descritos no protocolo. Para cada vírus, adicione os volumes indicados em tubos de um a oito de uma bandeja de tubos.Corte a tira, dividindo-a em duas tiras. Tubos de um a cinco e tubos de seis a oito. Para cada vírus, suspensões de DNA secos de ar contendo 10 a 5, 10 a 7 e 10 a 9 e cópias conhecidas pré-feitas em tubos seis, sete e oito.Este protocolo de concentração baseia-se no princípio da floculação orgânica pelo qual o baixo pH e a condição de alta condutividade leva as proteínas do leite desnatado a se organizarem em flocs que os vírus absorvem. Uma vez que os flocs são resolvidos, eles podem ser facilmente coletados. Colete uma amostra de água de 10 litros em um balde de fundo plano fornecido com uma tampa.Se coletar de um cano, deixe a água correr por alguns segundos antes de coletar a água. É importante usar baldes claros para visualizar pelotas. Procure um espaço plano em um lugar fresco longe da luz solar direta Coloque um agitador magnético conectado a uma bateria sob o suporte do balde e coloque o balde contendo a amostra de água em cada suporte.Reconsidere o ácido cítrico e o hidróxido de sódio e agite até que sejam completamente dissolvidos. Despeje 500 mLs de água destilada em um saco de stand-up e coloque o saco em um agitador magnético. Adicione o conteúdo de um sachê de sal marinho e o conteúdo de um tubo de leite desnatado e mexa por cinco minutos em velocidade média.Ajuste o pH do leite desnatado floculado usando ácido cítrico e hidróxido de sódio a um pH entre 3,4 e 3,6. Desligue o agitador magnético e certifique-se de que os flocos estejam visíveis. Uma lanterna pode ajudar a visualizar os flocos.Jogue um ímã de agitação na água. Coloque o agitador magnético na velocidade máxima e ligue-o. Adicione 10 mLs de água destilada a um tubo controlado pelo processo.Inverta-o algumas vezes e despeje a solução na água. Despeje o conteúdo de uma amostra condicionando sachê na água e mexa por cinco minutos. Certifique-se de que o pH da amostra de água, que deve ser entre 3,4 e 3,6.Ajuste o pH se necessário. Adicione 100 mLs de solução de leite desnatado pré-floculado, sele o balde com a tampa e deixe a água mexendo por oito horas em velocidade mínima. Depois de oito horas, desligue o agitador magnético e deixe os flocos se contentarem por pelo menos cinco horas extras.Com um sistema baseado no uso de um controlador de pipeta, um tubo plástico e um par de pipetas, descarte o supernasciente, tomando cuidado para não perturbar os flocos no fundo do balde. Quando o nível da água estiver prestes a atingir o ímã de agitação, aperte o tubo de plástico para parar o fluxo de água e afaste a pipeta do balde. Agite o balde para resuspensar os flocs e despejá-los em um saco plástico stand-up.Deixe os flocs se contentarem com uma hora extra. Aspire cuidadosamente a água sobrenatante usando uma pipeta evitando perturbar os flocos. Aspire os flocs usando uma pipeta e transfira-os para um tubo cônico.Observe o volume final do concentrado amostral e transfira 1 mL para um tubo contendo a solução conservante. A suspensão pode ser usada para realizar a extração de ácido nucleico no campo, ou enviar para um laboratório de referência para análise posterior. A água descartada durante a coleta dos flocos deve ser tratada antes do descarte.Adicione o conteúdo de um sachê de agente neutralizante ao balde contendo a água descartada. Misture a água e deixe-a parada por trinta minutos. Em seguida, descarte a água tratada como lixo geral.As partículas magnéticas podem ser transferidas de um tubo para outro usando uma pipeta magnética. Acostume-se com o funcionamento de uma pipeta magnética antes de realizar a extração. Disponha os tubos que contenham o reagente necessário para extração em um rack.Ou seja, da esquerda para a direita: tampão de ligação, buffers de lavagem e tampão de eluição. Transfira 1 mL de concentrado amostral para o tubo contendo o tampão de ligação usando uma pipeta de plástico descartável. Inverta o tubo dez vezes para otimizar a solução.Incubar a solução à temperatura ambiente por dez minutos enquanto mistura continuamente usando um orbital solo ou manualmente. Colete as partículas magnéticas usando uma pipeta magnética e uma ponta limpa que pode ser reutilizada para os três tampões de lavagem e solte as partículas magnéticas no tubo contendo tampão de lavagem um. Lave-os agitando suavemente a solução com a ponta por trinta segundos e colete-as.Repita este procedimento de lavagem para lavar tampões dois e três. Colete as partículas magnéticas na lavagem do tampão três e solte-as no tubo contendo o tampão de elução. Em seguida, descarte a ponta.Incubar a solução à temperatura ambiente por cinco minutos enquanto se mistura continuamente usando o orbital solo. Substitua a ponta da pipeta magnética por qualquer uma e colete todas as partículas magnéticas do tampão de eluição. Descarte a ponta com as partículas presas.O ácido nucleico permanece no tampão de elução, que deve ser armazenado para análise ou envio posterior. Use uma tira de cinco tubos e uma de três tubos preparada para detectar adenovírus humanos. Adicione água, mistura de PCR e extração de ácido nucleico aos tubos de um a cinco, de acordo com o protocolo.Depois, adicione água e mistura PCR aos tubos de seis a oito. Coloque ambas as tiras no termociclador e selecione a execução apropriada. Uma vez concluída a execução, colete os resultados e analise os dados obtidos.Somente quando os testes virais resultaram em negativo, a detecção de MS2 deve ser realizada. Use tiras de tubo preparadas para detecção de MS2 e selecione o perfil térmico apropriado para o PCR. A extração de ácido nucleico magnético VirWaTest foi comparada ao QIAgen viral RNA, imitado por testar amostras de água cravadas com adenovírus humanos e MS2.O valor p do teste de redução mostra recuperações virais significativamente maiores usando o VirWaTest do que o QiAgen como um método de extração para ambos os vírus testados. O método desenvolvido para concentração viral foi testado no campo com a colaboração de equipes de lavagem da Oxfam localizadas em Bangui, República Centro-Africana e em Pedernales, Equador, que coletaram amostras de água, concentraram-nas aplicando o método de concentração desenvolvido, e as enviaram ao laboratório em Barcelona para extração nucleica de ácido e quantificação viral. No Equador, os adenovírus humanos foram detectados em todas as amostras testadas, enquanto uma em cada cinco amostras coletadas e concentradas em Bangui deu positivo para adenovírus humanos.O método desenvolvido mostrou-se útil quando foi avaliado por equipes de lavagem da Oxfam Intermon em Bangui, República Centro-Africana e por outra equipe em Pedernales, Equador. O VirWaTest pode fazer parte de um sistema de alerta antecipado ou pode ser usado em investigação de surtos por organizações envolvidas em saneamento de água. Este equipamento facilita a análise de patógenos virais na água e a melhoria do manejo da segurança hídrica com o objetivo de reduzir incidentes de doenças virais em contextos de crise humanitária.

virwatest-point-use-method-for-detection-viruses-water

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

A taxa de rotatividade de vírus em sistemas marinhos e de água doce pode ser estimado por uma redução e técnica recorrência. Os dados permitem aos pesquisadores inferir as taxas de mortalidade do vírus mediada microbiana em sistemas aquáticos.

Estimar as taxas de produção de vírus em Sistemas Aquáticos

O estudo descreve um método de baixo custo para a identificação da fonte de contaminação fecal / urinária ou contaminação por nitratos na água usando qPCR para a quantificação específica de vírus de DNA humano / suínos / bovinos, adenovírus e polyomaviruses, propostos como ferramentas de MST.

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Source: Fout, G. S., Cashdollar, J. L. EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the use of a total culturable virus assay to quantify infectious viruses in water samples. It outlines host cell inoculation, observation of cytopathic effect, and statistical quantification of infectious virus concentration.

Quantifying Infectious Viruses in Water Samples Using an In Vitro Total Culturable Virus Assay

Uma abordagem foi desenvolvida para identificar condições ideais de concentração viral para amostras de água de pequeno volume usando picos de adenovírus humano. As técnicas descritas aqui são usadas para identificar parâmetros de concentração para outros alvos virais e aplicadas à experimentação de concentração viral em larga escala.

Um Procedimento volume pequeno para Concentração Viral da Água

O método EPA 1615 usa um filtro eletropositivo para concentrar enterovírus e norovírus em águas ambientais e potáveis. Este manuscrito descreve o procedimento de coleta de amostras para análises do Método 1615.

EPA Método 1615. Medição de Enterovirus e Norovirus Ocorrência na água pela cultura e RT-qPCR. I. Recolha de amostras de vírus

Aqui apresentamos um procedimento para medir o total de vírus cultiváveis usando a linha de células renais Buffalo Green Monkey. O procedimento fornece uma ferramenta padronizada para medir a ocorrência de vírus infecciosos em águas ambientais e potáveis.

EPA Método 1615. A medição do Enterovirus e Norovirus Ocorrência na água por cultura e RT-qPCR. II. De ensaio total de Vírus cultiváveis

Aqui apresentamos um procedimento para quantificar enterovírus e norovírus em águas ambientais e potáveis usando PCR quantitativo de transcrição reversa. A recuperação média do vírus das águas subterrâneas com este procedimento padronizado do Método EPA 1615 foi de 20% para o poliovírus e 30% para o norovírus murino.

EPA Método 1615. Medição de Enterovirus e Norovirus Ocorrência na água por cultura e RT-qPCR. Parte III. Detecção de vírus por RT-qPCR

Um ânion trocar o método à base de resina, adaptado para amostragem de bioaerosol baseado em choque de vírus é demonstrada o líquido. Quando acoplado com deteção molecular a jusante, o método permite a fácil e sensível de detecção de vírus de Bioaerossóis.

Detecção de vírus de Bioaerossóis usando resina de troca de ânion

A concentração de vírus a partir de amostras ambientais de água e efluentes é uma tarefa desafiadora, realizada principalmente para a identificação e quantificação de vírus. Embora vários métodos de concentração viral tenham sido desenvolvidos e testados, demonstramos aqui a eficácia da ultrafiltração e floculação de leite desnatado para vírus de RNA com diferentes tipos de amostras.

Concentração de Partículas de Vírus de Amostras Ambientais de Água e Efluentes Usando Floculação e Ultrafiltração de Leite Desnatado

Aprenda o método VirWaTest para detecção de vírus entéricos em amostras de água usando concentração viral e extração de ácido nucleico. Esta técnica portátil melhora a segurança hídrica em contextos humanitários.

VirWaTest, um método de ponto de uso para a detecção de vírus em amostras de água

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