Name: Inativação química da E3 ubiquitina ligase Cereblon por Homo-PROTACs à base de Pomalidomida (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Aprenda a sintetizar homo-PROTACs baseados em pomalidomida para inativar a E3 ubiquitina ligase Cereblon (CRBN). Esta plataforma permite direcionar proteínas intracelulares anteriormente inacessíveis para degradação.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho foi apoiado pelo Deutsche Forschungsgemeinschaft (Emmy-Noether Program Kr-3886/2-1 e SFB-1074 para J.K.; FOR2372 para a)

1. preparação de moléculas PROTAC
Atenção: por favor, consulte todas as fichas de dados de segurança (MSDS) relevantes antes de usar. Diversos dos produtos químicos usados nestas sínteses são tóxicos e carcinogénicos. Por favor, use todas as práticas de segurança apropriadas e equipamentos de proteção pessoal.
<ol><li>Preparação de carbamato de tert-butyl N-(2, 6-dioxo-3-piperidyl) (composto 1)
	<ol>
<li>Adicionar 1, 1 '-carbonildiimidazol (1,95 g, 12 mmol) e uma quantidade catalítica de 4-(dimetilamino) piridina (5 mg) a uma mistura de BOC-GLN-OH (2,46 g, 10 mmol) em THF (50 mL) em 100 mL balão de fundo redondo com um stir bar e equipado com um condensador de refluxo Aqueça no reflux por 10 h ao agitar até que uma solução desobstruída esteja dada forma.</li>
		<li>Retire o solvente pressão reduzida com um evaporador rotativo, adicione EtOAc (200 mL) e transfira-o para um funil separatório. Lave a camada orgânica com H2O (50 ml) e salmoura (50 ml) e seque-a sobre na2so4.</li>
		<li>Filtre a solução através de uma almofada curta de sílica gel (5 cm de diâmetro e 5 cm de altura) e Eluar com um volume adicional (200 mL) de EtOAc.</li>
		<li>Evate o solvente e seque o sólido incolor obtido no vacuo.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação de carbamato de tert-butil N-(1-metil-2, 6-dioxo-3-piperidilo) (composto 2)
	<ol>
<li>Combine composto 1 (2,28 g, 10 mmol) com carbonato de potássio fresado (2,76 g, 20 mmol) e Dmf (25 ml) em um balão de fundo redondo de 100 ml. Adicionar Iodometano (1,42 g, 0,62 mL, 10 mmol) gota-sábio usando uma seringa e equipar o balão com um septo de borracha perfurado. Coloque o vaso de reação em um banho de ultrasonication para 2 h.</li>
		<li>Diluir a mistura de reacção com EtOAc (100 mL) e transferi-la para um funil separatório. Lave a camada orgânica com 1 N NaOH (2x 25 mL), H2O (25 ml), e salmoura (25 ml), e seque-o sobre na2so4.</li>
		<li>Filtre e evate o solvente. Purificar o produto por cromatografia em coluna sobre gel de sílica (6 cm de diâmetro da coluna e 20 cm de altura) usando éter de petróleo/EtOAc (2:1).</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação de 2-(2, 6-dioxopiperidina-3-yl)-4-fluoroisoindolina-1,3-diona (composto 3)
	<ol>
<li>Combine 3-fluorophthalic anidrido (1,25 g, 7,5 mmol), glutarimida 1 (1,14 g, 5 mmol) e uma solução de acetato de sódio (0,50 g, 6,0 mmol) em ácido acético glacial (20 ml) em um balão de fundo redondo de 50 ml com uma barra de agitação e equipado com um condensador de refluxo. Aqueça a mistura a 120 ° c durante 6 h.</li>
		<li>Após o resfriamento, despeje a mistura roxa em H2o (100 ml) e mexa por 10 min. colete o sólido formado por filtração, lave com h2o (3 × 5 ml) e éter de petróleo (3 × 5 ml) e seque em vacuo.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação de 4-fluoro-2-(1-metil-2, 6-dioxopiperidina-3-yl) Isoindolina-1,3-diona (composto 4)
	<ol>
<li>Combine 3-fluorophthalic anidrido (1,25 g, 7,5 mmol), glutarimida 2 (1,21 g, 5 mmol) e uma solução de acetato de sódio (0,50 g, 6,0 mmol) em ácido acético glacial (20 ml) em um balão de fundo redondo de 100 ml com uma barra de agitação e equipado com um condensador de refluxo. Aqueça a mistura a 120 ° c durante 6 h.</li>
		<li>Após o resfriamento, despeje a mistura roxa em H2o (100 ml) e mexa por 10 min. colete o sólido formado por filtração, lave com h2o (3 × 5 ml) e éter de petróleo (3 × 5 ml) e seque em vacuo.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação de tert-butil N-[2-[2-[2-[[2-(2,6-dioxo-3-piperidyl)-1,3-dioxo-isoindolin-4-yl] amino] etoxi] etoxi] etil] carbamato (composto 7)
	<ol>
<li>Carregue um balão de fundo redondo de 50 mL com tert-butil N-[2-[2-(2-aminoetoxi) etoxi] etil] carbamato (5, 0,41 g, 1,65 mmol), composto 3 (0,41 g, 1,50 mmol), Dmf seco (10 ml) e dipea (0,39 g, 0,51 ml, 3,0 mmol). Equipar com uma barra de agitação e um condensador de refluxo. Calor atmosfera de argônio a 90 ° c por 10 h.</li>
		<li>Após refrigerar à temperatura ambiente, despeje a mistura verde escura no H2O (100 ml) e extraia com etoac (3x 50 ml) em um funil funil. Lave as camadas orgânicas combinadas com H2O (50 ml) e salmoura (50 ml), seque sobre na2so4, filtre e concentre-se em vacuo.</li>
		<li>Purify o produto cru pela cromatografia da coluna sobre o gel de silicone (diâmetro da coluna de 3 cm e altura de 60 cm) usando um inclinação do éter do petróleo/EtOAc (1:1 a 1:2).</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação de homodímero (composto 8)
	<ol>
<li>Combine o vinculador α, ω-diamina 6 (0,22 g, 0,22 ml, 1,50 mmol), dipea (1, 5 ml, 6, 0 mmol) e uma solução de 3 (0,83 g, 3, 0 MMOL) em DMSO seco (20 ml) em um balão de fundo redondo de 50 ml com uma barra de agitação e equipado com um condensador de refluxo. Aqueça a atmosfera do argônio em 90 ° c por 18 h.</li>
		<li>Após refrigerar à temperatura ambiente, despeje a mistura verde escura no H2O (100 ml) e extraia com etoac (3x 50 ml) em um funil funil. Lave as camadas orgânicas combinadas com H2O (50 ml) e salmoura (50 ml), seque sobre na2assim4, filtre e concentre-se em vacuo.
</li>
		<li>Purify o produto cru pela cromatografia da coluna sobre o gel de silicone (diâmetro da coluna de 3 cm e altura de 50 cm) usando um inclinação do éter/EtOAc do petróleo (1:2) ao EtOAc.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação de heterodímero (composto 9)
	<ol>
<li>Dissolver o composto 7 (0,83 g, 1,65 mmol) em ch seco2CL2 (10 ml). Adicionar ácido trifluoroacético (10 mL) e agitar a mistura amarela a 40 ° c durante 2 h num balão fechado de 50 mL de fundo redondo.</li>
		<li>Retire os voláteis e coevate com CH2CL2 (4x 5 ml). Seque o resíduo em vacuo por 10 h.</li>
		<li>Redissolva o material em DMF seco (20 mL). Adicionar composto 4 (0,44 g, 1,50 mmol) e dipea (0,78 g, 1, 5 mL, 6, 0 mmol) e equipar o balão com um condensador de refluxo. Calor atmosfera de argônio a 90 ° c por 10 h.</li>
		<li>Após refrigerar à temperatura ambiente, despeje a mistura verde escura no H2O (100 ml) e extraia com etoac (3x 50 ml) em um funil funil. Lave as camadas orgânicas combinadas com NaHCO saturado3 (50 ml), h2o (50 ml), 10% khso4 (50 ml), H2o (50 mL), e salmoura (50 ml), seque sobre na2so4, filtre e concentre-se em vacuo.</li>
		<li>Purify o produto cru pela cromatografia da coluna sobre o gel de silicone (diâmetro da coluna de 3 cm e altura de 50 cm) usando um inclinação do éter/EtOAc do petróleo (1:2) ao EtOAc.</li>
		<li>Elucidar e verificar a estrutura da molécula (Figura 5a composto 8, 5b composto 9) por 1H RMN e 13C NMR espectros em DMSO-d6 em uma ressonância magnética nuclear (RMN) Espectrômetro. Verifique se a pureza de ambos os compostos é superior a 97% por meio de cromatografia líquida-espectrometria de massas (LC-MS), aplicando uma detecção de matriz de diodos (DAD) a 220 – 500 nm.</li>
	</ol></li>
</ol>2. validação funcional de moléculas PROTAC
<ol><li>Análise do borrão ocidental da degradação de CRBN por PROTACs Nota: os efeitos do composto8e composto9no nível da proteína de CRBN foram testados pela análise ocidental do borrão. Além disso, o impacto nos níveis de IKZF1 e IKZF3 também pode ser confirmado (A Figura 6).<ol><li>
Preparação da amostra
		<ol>
<li>Dissolva os compostos 8 e 9, lenalidomida (Len), Pomalidomida (POM), MG132, e mln-4924 no DMSO em uma concentração de 10 mm, alíquota e armazene a-80 ° c até o uso mais adicional.</li>
			<li>Semente 1 x 106 MM1S células em uma placa de 6 poços com 2,5 ml de mídia e tratar células com 100 nm ou 1 μm composto 8 ou 9 para 24 h.</li>
			<li>Colha pilhas após o tratamento e centrifugue em 700 x g, 5 min, 4 ° c. Lave a pelota da pilha com o frio 1X PBS para remover os meios restantes, centrifugador em 700 x g, 5 min, 4 ° c, e descarte o sobrenadante. Repita este passo uma vez.</li>
			<li>Células de lyse em tampão de lise (25 mM Tris HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1 mM EDTA, 5% glicerol, 1x protease & inibidor da fosfatase cocktail) por 10 min no gelo, centrífuga em 320 x g por 10 min, 4 ° c. Sobrenadante da colheita e determine a concentração da proteína por um ensaio ácido ácido da proteína (ensaio de BCA) de acordo com o protocolo do fabricante.</li>
			<li>Proteínas de desnaturamento (15 – 30 μg/amostra) com tampão de carga de 1x LDS (5% 2-Mercaptoetanol) e ferver 10 min, 75 ° c.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
SDS-PÁGINA
		<ol>
<li>Fixe o sanduíche do gel com um gel de separação de 10% [tampão do gel de 4 mL 3x (Tris/HCl de 3 M, 0,3% (p/v) dodecilsulfato de sódio (SDS), pH 8,45), 4 mL de acrilamida 30%, 2,52 mL de glicerol 50%, 1,395 mL H2O, 75 μl 11% persulfato de amônio (APS) e 9,75 ΜL de TEMED] e um gel de empilhamento de 4% [1,992 mL 3x tampão de gel, 0,792 mL 30% acrilamida, 3,168 mL H2O, 36 μl 11% APS e 6 ΜL de TEMED] numa unidade de montagem de eléctrodos. Remover pentes, poços nivelado com tampão de cátodos (100 milímetros Tris/HCl, Tricine de 100 milímetros, 0,1% (w/v) SDS), e amostras da carga.</li>
			<li>Encha o tampão do ânodo (100 milímetros Tris/HCl, pH 8,9) no tanque. Carregue a amostra da proteína da etapa 2.1.1.4 e funcione SDS-PAGE em 70 V, 20 minutos, seguidos por 115 V, 150 minutos na tensão constante.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Immunoblotting e deteção de CRBN, de IKZF1 e de IKZF3
		<ol>
<li>Ativar membrana de PVDF (0,45 μm) em 100% metanol por 1 min. equilibrar a membrana e separar O gel em 1x tampão de transferência [10x tampão de transferência (192 mM glicina, 25 mM TRIS-base/HCl, 900 mL H2O), 20% metanol, 0,1% SDS, pH 8,3].</li>
			<li>Monte a gaveta blotting de acordo com o protocolo do fabricante. Gel de transferência em 180 mA por 90 min.</li>
			<li>Membrana de lavagem 3x em 1x TBS-T (25 mM Tris/HCl, 150 mM NaCl, pH 7,6, 0,1% Tween 20) por 5 – 10 min cada à temperatura ambiente. Membrana do bloco no leite nonfat-dried de 5% (NFDM), TBS-T para 1 h na temperatura ambiente. Lave a membrana 3x em 1X TBS-T durante 5 – 10 min cada à temperatura ambiente.</li>
			<li>Incubar a membrana com anticorpo preliminar para CRBN (1:500 em 5% BSA, TBS-T) com agitação delicada em 4 ° c, durante a noite.</li>
			<li>Lave a membrana 3x em 1X TBS-T durante 5 – 10 min cada à temperatura ambiente. Incubar membrana com anti-mouse (1:10.000 em 5% NFDM, TBS-T) ou anti-coelho (1:5.000 em 5% NFDM, TBS-T) anticorpo secundário acoplado à peroxidase de rábano HRP (1 h à temperatura ambiente.)</li>
			<li>Lave a membrana 2x em 1X TBS-T durante 5 – 10 min cada à temperatura ambiente. Repita este passo duas vezes com 1x TBS.</li>
			<li>Incubar a membrana por 2 min com solução de substrato HRP de acordo com os protocolos do fabricante e detecte quimioluminescência em um dispositivo de detecção de quimioluminescência.</li>
			<li>Lave a membrana 1x em 1X TBS por 5 – 10 min cada à temperatura ambiente. Para a liberação de anticorpos, descasque a membrana no amortecedor de descascamento disponível comercialmente por 15 minutos. Lave a membrana 3x em 1X TBS por 5 – 10 minutos cada na temperatura ambiente.</li>
			<li>Reblock a membrana no leite nonfat-dried de 5%, TBS-T para 1 h na temperatura ambiente. Lave a membrana 3x em 1x TBS-T para 5 – 10 min cada em temperatura ambiente e resonda com IKZF1, IKZF3 ou tubulina de acordo com a etapa 2.1.3.4.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Experimentos de competição com MG132, MLN4942 ou pomalidomida Nota: para confirmar se a crbn é degradada através da via ubiquitina-Proteassoma, realizamos experimentos de competição com o inibidor do Proteassoma MG132 e um inibidor da enzima ativadora de Cullin (NAE) MLN4942 (Figura 7).<ol>
<li>Semente 1 x 106 MM1S células por poço em uma placa de 6 poços. Pré-tratamento de células com 10 μM MG132, 10 μM MLN4942, ou lenalidomida (100x), e incubar 1 h a 37 ° c, 5% CO2.</li>
		<li>Adicionar 100 nM composto 8 para 3 h a 37 ° c, 5% co2.</li>
		<li>Colha pilhas para o borrão ocidental de acordo com a etapa 2.1.1.</li>
	</ol></li>
	<li>Ensaios de viabilidade celular em linhas celulares de mieloma múltiplo Nota: Este ensaio é utilizado para testar o impacto na viabilidade celular e, adicionalmente, antagonizar o efeito de IMiDs em células de mieloma múltiplo por pré-tratamento das células com composto 8 (Figura 8, Figura 9A, B).<ol>
<li>Semente 5 x 104 MM1S Cells por bem em uma placa 96-well em triplica biológicos para o ensaio da viabilidade. Para a análise de Western blot, semente 1 x 106 MM1S células por poço em uma placa de 6 poços em triplicates biológicos.</li>
		<li>Trate as células com DMSO ou 100 nM, 1 μM ou 10 μM composto 8, composto 9 ou pomalidomida e incubar por 24 h, 48 h ou 96 h a 37 ° c, 5% co2. Para experimentos de resgate, trate células com 100 nM composto 8 para 3 h, antes ou depois da adição de 1 μm de pomalidomida e incubar por 96 h.</li>
		<li>Medida 96-bem luminescência da placa com um ensaio luminescentes da viabilidade da pilha, de acordo com o protocolo do fabricante em um leitor da placa ou pilhas da colheita da placa 6-well para a análise ocidental do borrão.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Ito, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+primary+target+of+thalidomide+teratogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of a primary target of thalidomide teratogenicity.</a> Science. 327 (5971), 1345-1350 (2010).</li>
<li>Lopez-Girona, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cereblon+is+a+direct+protein+target+for+immunomodulatory+and+antiproliferative+activities+of+lenalidomide+and+pomalidomide%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Cereblon is a direct protein target for immunomodulatory and antiproliferative activities of lenalidomide and pomalidomide.</a> Leukemia. 26 (11), 2326-2335 (2012).</li>
<li>Fischer, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+DDB1-CRBN+E3+ubiquitin+ligase+in+complex+with+thalidomide%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the DDB1-CRBN E3 ubiquitin ligase in complex with thalidomide.</a> Nature. 512 (7512), 49-53 (2014).</li>
<li>Gandhi, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomodulatory+agents+lenalidomide+and+pomalidomide+co-stimulate+T+cells+by+inducing+degradation+of+T+cell+repressors+Ikaros+and+Aiolos+via+modulation+of+the+E3+ubiquitin+ligase+complex+CRL4%28CRBN%29%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Haematology%22%5BJournal%5D)">Immunomodulatory agents lenalidomide and pomalidomide co-stimulate T cells by inducing degradation of T cell repressors Ikaros and Aiolos via modulation of the E3 ubiquitin ligase complex CRL4(CRBN).</a> British Journal of Haematology. 164 (6), 811-821 (2014).</li>
<li>Kronke, J., Hurst, S. N., Ebert, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lenalidomide+induces+degradation+of+IKZF1+and+IKZF3%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Lenalidomide induces degradation of IKZF1 and IKZF3.</a> Oncoimmunology. 3 (7), e941742(2014).</li>
<li>Lu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+myeloma+drug+lenalidomide+promotes+the+cereblon-dependent+destruction+of+Ikaros+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The myeloma drug lenalidomide promotes the cereblon-dependent destruction of Ikaros proteins.</a> Science. 343 (6168), 305-309 (2014).</li>
<li>Zhu, Y. X., Kortuem, K. M., Stewart, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+of+action+of+immune-modulatory+drugs+thalidomide%2C+lenalidomide+and+pomalidomide+in+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+%26+Lymphona%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism of action of immune-modulatory drugs thalidomide, lenalidomide and pomalidomide in multiple myeloma.</a> Leukemia & Lymphona. 54 (4), 683-687 (2013).</li>
<li>Chamberlain, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+human+Cereblon-DDB1-lenalidomide+complex+reveals+basis+for+responsiveness+to+thalidomide+analogs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structure of the human Cereblon-DDB1-lenalidomide complex reveals basis for responsiveness to thalidomide analogs.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 21 (9), 803-809 (2014).</li>
<li>Donovan, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thalidomide+promotes+degradation+of+SALL4%2C+a+transcription+factor+implicated+in+Duane+Radial+Ray+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Thalidomide promotes degradation of SALL4, a transcription factor implicated in Duane Radial Ray syndrome.</a> eLife. 7, (2018).</li>
<li>Matyskiela, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SALL4+mediates+teratogenicity+as+a+thalidomide-dependent+cereblon+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">SALL4 mediates teratogenicity as a thalidomide-dependent cereblon substrate.</a> Nature Chemical Biology. 14 (10), 981-987 (2018).</li>
<li>Kronke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lenalidomide+induces+ubiquitination+and+degradation+of+CK1alpha+in+del%285q%29+MDS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Lenalidomide induces ubiquitination and degradation of CK1alpha in del(5q) MDS.</a> Nature. 523 (7559), 183-188 (2015).</li>
<li>Sakamoto, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protacs%3A+chimeric+molecules+that+target+proteins+to+the+Skp1-Cullin-F+box+complex+for+ubiquitination+and+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Protacs: chimeric molecules that target proteins to the Skp1-Cullin-F box complex for ubiquitination and degradation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (15), 8554-8559 (2001).</li>
<li>Sakamoto, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+Protacs+to+target+cancer-promoting+proteins+for+ubiquitination+and+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Development of Protacs to target cancer-promoting proteins for ubiquitination and degradation.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 2 (12), 1350-1358 (2003).</li>
<li>Schneekloth, J. S. Jr, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+genetic+control+of+protein+levels%3A+selective+in+vivo+targeted+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Chemical genetic control of protein levels: selective in vivo targeted degradation.</a> Journal of the American Chemical Society. 126 (12), 3748-3754 (2004).</li>
<li>Gu, S., Cui, D., Chen, X., Xiong, X., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PROTACs%3A+An+Emerging+Targeting+Technique+for+Protein+Degradation+in+Drug+Discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">PROTACs: An Emerging Targeting Technique for Protein Degradation in Drug Discovery.</a> Bioessays. 40 (4), e1700247(2018).</li>
<li>Collins, I., Wang, H., Caldwell, J. J., Chopra, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+approaches+to+targeted+protein+degradation+through+modulation+of+the+ubiquitin-proteasome+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Chemical approaches to targeted protein degradation through modulation of the ubiquitin-proteasome pathway.</a> Biochemical Journal. 474 (7), 1127-1147 (2017).</li>
<li>Neklesa, T. K., Winkler, J. D., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+protein+degradation+by+PROTACs%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Targeted protein degradation by PROTACs.</a> Pharmacology & Therapeutics. 174, 138-144 (2017).</li>
<li>Winter, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phthalimide+conjugation+as+a+strategy+for+in+vivo+target+protein+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Phthalimide conjugation as a strategy for in vivo target protein degradation.</a> Science. 348 (6241), 1376-1381 (2015).</li>
<li>Maniaci, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homo-PROTACs%3A+bivalent+small-molecule+dimerizers+of+the+VHL+E3+ubiquitin+ligase+to+induce+self-degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Homo-PROTACs: bivalent small-molecule dimerizers of the VHL E3 ubiquitin ligase to induce self-degradation.</a> Nature Communications. 8 (1), 830(2017).</li>
<li>Crew, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+Characterization+of+Von+Hippel-Lindau-Recruiting+Proteolysis+Targeting+Chimeras+%28PROTACs%29+of+TANK-Binding+Kinase+1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification and Characterization of Von Hippel-Lindau-Recruiting Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) of TANK-Binding Kinase 1.</a> Journal of Medicinal Chemistry. , (2017).</li>
<li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hijacking+the+E3+Ubiquitin+Ligase+Cereblon+to+Efficiently+Target+BRD4%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">Hijacking the E3 Ubiquitin Ligase Cereblon to Efficiently Target BRD4.</a> Chemistry & Biology. 22 (6), 755-763 (2015).</li>
<li>Steinebach, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PROTAC-mediated+crosstalk+between+E3+ligases%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">PROTAC-mediated crosstalk between E3 ligases.</a> Chemical Communications. 55 (12), 1821-1824 (2019).</li>
<li>Tinworth, C. P., Lithgow, H., Churcher, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule-mediated+protein+knockdown+as+a+new+approach+to+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Medchemcomm%22%5BJournal%5D)">Small molecule-mediated protein knockdown as a new approach to drug discovery.</a> Medchemcomm. 7 (12), 2206-2216 (2016).</li>
<li>Steinebach, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homo-PROTACs+for+the+Chemical+Knockdown+of+Cereblon%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Homo-PROTACs for the Chemical Knockdown of Cereblon.</a> ACS Chemical Biology. 13 (9), 2771-2782 (2018).</li>
<li>Ambrozak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+Antiangiogenic+Properties+of+Tetrafluorophthalimido+and+Tetrafluorobenzamido+Barbituric+Acids%5BTitle%5D)+AND+%22ChemMedChem%22%5BJournal%5D)">Synthesis and Antiangiogenic Properties of Tetrafluorophthalimido and Tetrafluorobenzamido Barbituric Acids.</a> ChemMedChem. 11 (23), 2621-2629 (2016).</li>
<li>Zhou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+a+Small-Molecule+Degrader+of+Bromodomain+and+Extra-Terminal+%28BET%29+Proteins+with+Picomolar+Cellular+Potencies+and+Capable+of+Achieving+Tumor+Regression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Discovery of a Small-Molecule Degrader of Bromodomain and Extra-Terminal (BET) Proteins with Picomolar Cellular Potencies and Capable of Achieving Tumor Regression.</a> Journal of Medicinal Chemistry. , (2017).</li>
<li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolysis+Targeting+Chimeras+%28PROTACs%29+of+Anaplastic+Lymphoma+Kinase+%28ALK%29%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) of Anaplastic Lymphoma Kinase (ALK).</a> European Journal of Medicinal Chemistry. 151, 304-314 (2018).</li>
<li>Runcie, A. C., Chan, K. H., Zengerle, M., Ciulli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+genetics+approaches+for+selective+intervention+in+epigenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Chemical genetics approaches for selective intervention in epigenetics.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 33, 186-194 (2016).</li>
<li>Kronke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lenalidomide+causes+selective+degradation+of+IKZF1+and+IKZF3+in+multiple+myeloma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lenalidomide causes selective degradation of IKZF1 and IKZF3 in multiple myeloma cells.</a> Science. 343 (6168), 301-305 (2014).</li>
<li>Eichner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomodulatory+drugs+disrupt+the+cereblon-CD147-MCT1+axis+to+exert+antitumor+activity+and+teratogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Immunomodulatory drugs disrupt the cereblon-CD147-MCT1 axis to exert antitumor activity and teratogenicity.</a> Nature Medicine. 22 (7), 735-743 (2016).</li>
<li>Zhu, Y. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cereblon+expression+is+required+for+the+antimyeloma+activity+of+lenalidomide+and+pomalidomide%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Cereblon expression is required for the antimyeloma activity of lenalidomide and pomalidomide.</a> Blood. 118 (18), 4771-4779 (2011).</li>
<li>Kortum, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+sequencing+of+refractory+myeloma+reveals+a+high+incidence+of+mutations+in+CRBN+and+Ras+pathway+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Targeted sequencing of refractory myeloma reveals a high incidence of mutations in CRBN and Ras pathway genes.</a> Blood. 128 (9), 1226-1233 (2016).</li>
<li>Gil, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cereblon+deficiency+confers+resistance+against+polymicrobial+sepsis+by+the+activation+of+AMP+activated+protein+kinase+and+heme-oxygenase-1%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Cereblon deficiency confers resistance against polymicrobial sepsis by the activation of AMP activated protein kinase and heme-oxygenase-1.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 495 (1), 976-981 (2018).</li>
<li>Kim, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cereblon+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Archiv%3A+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cereblon in health and disease.</a> Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 468 (8), 1299-1309 (2016).</li>
<li>Lee, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+the+cereblon+gene+enhances+hepatic+AMPK+activity+and+prevents+high-fat+diet-induced+obesity+and+insulin+resistance+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Disruption of the cereblon gene enhances hepatic AMPK activity and prevents high-fat diet-induced obesity and insulin resistance in mice.</a> Diabetes. 62 (6), 1855-1864 (2013).</li>
</ol>

Os autores não declaram um potencial conflito financeiro de interesse.

O projeto de tais Homo-protacs como descrito aqui para crbn confia na afinidade específica do pomalidomida ao crbn, que foi utilizado com sucesso em protacs heterobifunctional numerosos e conduziu ao desenvolvimento de ProTac 8 como altamente degradador seletivo de CRBN. A especificidade de nossa molécula já foi confirmada por análises proteômicas24. Para nocaute geneticamente negociado, exclusão e validação de efeitos colaterais é desafiador e demorado. Além disso, um knockdown q...

Os fármacos imunomoduladores (IMiDs) talidomida e seus análogos, lenalidomida e pomalidomida, todos aprovados para o tratamento do mieloma múltiplo, ligam-se ao E3 ubiquitina ligase Cereblon (CRBN), um adaptador de substrato para cullin4A-RING E3 ligase de ubiquitina (CRL4crbn)1,2,3. A vinculação de imids aumenta a afinidade deCRL4 crbn aos fatores de transcrição linfoide Ikaros (IKZF1) e Aiolos (IKZF3), levando à sua ubiquitinação e degradação (Figura 1)4,5, 6 anos de , 7 anos de , 8. Since IKZF1 e IKZF3 são essenciais para pilhas múltiplas do mieloma, seus resultados da inactivação na inibição do crescimento. SALL4 foi encontrado recentemente como um neosubstrato Imid-induzido adicional do crbn que é provável responsável para o teratogenicidade e a catástrofe assim chamada de Contergan nos 1950s causados por talidomida9,10. Em contraste, a caseína quinase 1 α (CK1α) é um substrato específico da lenalidomida de CRBN que está implicado no efeito terapêutico na síndrome mielodisplásica com deleções do cromossomo 5q11.
A capacidade de pequenas moléculas para atingir uma proteína específica para a degradação é uma implicação emocionante para o desenvolvimento de drogas modernas. Embora o mecanismo de talidomida e seus análogos foi descoberto após seu primeiro uso em seres humanos, assim chamado PROteólise targeting Chimeras (protacs) foram projetados para direcionar especificamente uma proteína de interesse (POI) (Figura 2)12,13,14,15,16,17,18. Protacs são as moléculas heterobifuncionais que consistem em um ligante específico para o POI conectado através de um linker a um ligante de uma ligase da ubiquitina E3 como crbn ou von-Hippel-Lindau (VHL)18,19,20, 21,22. Protacs induzem a formação de um complexo ternário transitório, direcionando o POI para a ligase da ubiquitina E3, resultando em sua ubiquitinação e degradação degradação. As principais vantagens do PROTACs sobre os inibidores convencionais é que a ligação a um POI é suficiente, em vez de sua inibição e, portanto, PROTACs pode potencialmente alvo de um espectro muito maior de proteínas, incluindo aqueles que foram considerados undruggable como fatores de transcrição15. Além disso, as moléculas quiméricas atuam catalisando e, portanto, têm uma alta potência. Após a transferência do ubiquitin ao POI, o complexo ternário dissocia e está disponível para a formação de complexos novos. Assim, as concentrações muito baixas de PROTAC são suficientes para a degradação da proteína-alvo23.
Aqui nós descrevemos a síntese de um pomalidomide-pomalidomide conjugado Homo-ProTac (composto 8) que recruta crbn para a degradação DSE24. A ligase da ubiquitina E3 CRBN atua como recrutador e alvo ao mesmo tempo (Figura 3). Para validar nossos dados, também sintetizamos um controle de ligação negativa (composto 9). Nossos dados confirmam que o recém-sintetizado Homo-PROTAC é específico para a degradação de CRBN e tem somente efeitos mínimos em outras proteínas.

<table><tbody><tr><td>1,1'-Carbonildiimidazol</td><td>TCI produtos químicos</td><td>C0119</td><td></td></tr><tr><td>2,2&prime;-(etilenodioxi)-bis(etilamina)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>385506</td><td>Composto</td>6-2-Mercaptoetanol</tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>3-Anidrido ftálico, 98%</td> <td>Alfa Aesar</td><td>A12275</td><td></td></tr><tr><td>4-Dimetilaminopiridina, 99%</td> <td>Acros</td><td>148270250</td><td></td></tr><tr><td>Acrilamídeos Tóxicos&ouml; sung/ Bisacrylamid (30%/0,8%)</td><td>Carl Roth</td><td>3029.1</td><td></td></tr><tr><td>Aiolos (D1C1E) mAB</td><td>Cell signaling</td><td>15103S</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-CRBN produzido em coelho</td><td>Sigma</td><td>HPA045910</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-coelho IgG ligado a HRP</td><td>Sigma</td><td>7074S</td><td></td></tr><tr><td>Persulfato de amônio</td><td>Roth</td><td>9592.2</td><td></td></tr><tr><td>Boc-Gln-OH</td><td>TCI produtos químicos</td><td>B1649</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906-100G</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo Ensaio de viabilidade de células luminescentes</td><td>Promega</td><td>G7571</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc XRS+</td><td>Bio-Rad</td><td>1708265</td><td></td></tr><tr><td>DMF, anidro, 99,8</td>% <td>Acros</td><td>348435000</td><td>Extra Seco sobre Peneira Molecular</td></tr><tr><td>DMSO, anidro, 99,7</td>% <td>Acros</td><td>348445000</td><td>Extra Seco sobre Peneira Molecular</td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15523-1L-R</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-rato (HRP conjugado)</td> <td>Santa Cruz biotecnologia</td><td>sc-2005</td><td></td></tr><tr><td>Halt Protease & Inibidor de Fosfatase Coquetel de uso único (100X)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>1861280</td><td></td></tr><tr><td>Ikaros (D6N9Y) Sinalização de células Mab</td><td></td><td>14859S</td><td></td></tr><tr><td>Membrana de transferência ImmobilonP (0,45&micro; m)</td> <td>Merck</td><td>IPVH000010</td><td></td></tr><tr><td>Iodometano, 99%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>I8507</td><td>Metanol altamente tóxico</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32213-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>Mg132</td><td>Selleckchem</td><td>S2619</td><td></td></tr><tr><td>Mini Célula de transferência eletroforética Trans-Blot</td><td>Bio-Rad</td><td>1703930</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Célula de Eletroforese Vertical</td><td>Bio-Rad</td><td>1658004</td><td></td></tr><tr><td>MLN4942</td><td>biomol (jacaré)</td><td>Cay15217-1</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonal anti-alfa;-tubulina produzido em camundongo (B512)</td><td>Sigma</td><td>T5168</td><td></td></tr><tr><td>N-etildiisopropilamina, 99%</td> <td>Alfa Aesar</td><td>A11801</td><td></td></tr><tr><td>Leite em pó desnatado</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A0830,0500</td><td></td></tr><tr><td>Nunc F96 MicroWell White Placa de poliestireno</td><td>Thermo Scientific</td><td>136101</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)</td><td>Thermo Scientific</td><td>NP0008</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Pomalidomida</td><td>Selleckchem</td><td>S1567</td><td></td></tr><tr><td>RestoreTM Western Blot Stripping Buffer</td><td>Thermo Scientific</td><td>46430</td><td></td></tr><tr><td>sódio dodecil sulfato</td><td>Carl Roth</td><td>183.1</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539-500g</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Carl Roth</td><td>2367.3</td><td></td></tr><tr><td>terc-butil N- [2- [2- (2-aminoetoxi) etoxi] etil] carbamato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>89761</td><td>Composto 5</td></tr><tr><td>Tricina</td><td>Carl Roth</td><td>6977.4</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503-1kg</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7949-500ml</td><td></td></tr><tr><td>WesternBright ECL spray</td><td>Advansta</td><td>K-12049-D50</td><td></td></tr></tbody></table>

inativação química da e3 ubiquitina ligase cereblon por homo-protacs à base de pomalidomida

Chemical Inactivation of the E3 Ubiquitin Ligase Cereblon by Pomalidomide-based Homo-PROTACs

Os fármacos imunomoduladores (IMiDs) talidomida e seus análogos, lenalidomida e pomalidomida, todos os fármacos aprovados pela FDA para o tratamento do mieloma múltiplo, induzem a ubiquitinação e degradação dos fatores de transcrição linfoide Ikaros (IKZF1) e Aiolos (IKZF3) através da ligase da ubiquitina do Cereblon (crbn) E3 para a degradação degradação. Imids têm sido utilizados recentemente para a geração de proteólise bifuncional visando quimeras (protacs) para direcionar outras proteínas para a ubiquitinação e degradação degradação pela ligase da crbn E3. Foram projetados e sintetizados os PROTACs homobifuncionais à base de pomalidomida e analisados sua capacidade de induzir a ubiquitinação e degradação autodirigida de CRBN. Aqui, o CRBN serve como ambos, a ligase da ubiquitina E3 e o alvo ao mesmo tempo. O composto de Homo-PROTAC 8 degrada o crbn com uma potência elevada com somente efeitos permanecendo mínimos em IKZF1 e em IKZF3. A inactivação de crbn pelo composto 8 não teve nenhum efeito na viabilidade da pilha e na proliferação de linhas de pilha múltiplas diferentes do mieloma. Este Homo-ProTac AB roga os efeitos de imids em pilhas múltiplas do mieloma. Portanto, nossos compostos à base de pomalidomida bacteriana podem ajudar a identificar os substratos endógenos e as funções fisiológicas da crbn e investigar o mecanismo molecular dos imids.

Aqui nós descrevemos o projeto, a síntese e a avaliação biológica de um ProTac bacteriana do pomalidomide-baseado para a degradação de CRBN. Nosso ProTac interage simultaneamente com duas moléculas de crbn e forma complexos ternários que induz a degradação de autoubiquitinação e degradação de crbn com apenas efeitos remanescentes mínimos sobre os neosubstratos induzidos por pomalidomida IKZF1 ou IKZF3.
De uma série de moléculas ...

Este trabalho descreve a síntese e caracterização de um Homo-PROTAC bifuncional, com base em pomalidomida, como uma nova abordagem para induzir a ubiquitinação e a degradação do E3 ubiquitina ligase Cereblon (CRBN), alvo de análogos da talidomida.

Inativação química da E3 ubiquitina ligase Cereblon por Homo-PROTACs à base de Pomalidomida

The immunomodulatory drugs (IMiDs) thalidomide and its analogs, lenalidomide and pomalidomide, all FDA approved drugs for the treatment of multiple ...

Nossos PROTACs homodimeric são os primeiros inibidores químicos do Cereblon e podem ajudar a elucidar ainda mais o mecanismo molecular dos análogos da talidomida, bem como para investigar a função fisiológica de Cereblon. Esta nova tecnologia de plataforma PROTAC pode ser altamente útil para direcionar especificamente proteínas de interesse que de outra forma são consideradas inalcláveis. Só a inibição do CRBN não tem atividade anti-tumor.No entanto, os degradadores do CRBN podem ter implicações clínicas na obesidade, doenças infecciosas e outros transtornos. A síntese é desafiadora e é difícil encontrar conectores e apego ideal para gerar degradadores de proteína eficazes ao projetar um composto PROTAC. Para começar, coloque 2,46 gramas de L-glutamina protegida por Boc e 50 mililitros de tetrahidrofuran em um frasco de fundo redondo de 100 mililitros, e mexa a 800 rpm por um minuto.Em seguida, adicione 1,95 gramas de 1, 1'carbonyldiimidazol e uma quantidade catalítica de 4 piridinas. Continue mexendo por 10 horas no refluxo para obter uma solução incolor clara do composto glutarimídeo. Deixe a solução esfriar à temperatura ambiente e remova o solvente com um evaporador rotativo.Redissolve o resíduo em 200 mililitros de acetato de etila e despeje-o em um funil separador. Lave a camada orgânica com 50 mililitros cada de água deionizada e salmoura, e seque a camada orgânica sobre sulfato de sódio. A gravidade filtra a solução através do gel de sílica para remover o dessecante e, em seguida, enxágue o gel de sílica com 200 mililitros de acetato de etila.Remova o solvente do filtrado sob vácuo para obter o composto 1 como um sólido incolor. Seque o produto sob vácuo durante a noite antes de usá-lo. Em seguida, dissolva 0,50 gramas de acetato de sódio em 20 mililitros de ácido acético glacial em um frasco de fundo redondo de 100 mililitros equipado com uma barra de agitação.Adicione 1,25 gramas de anidrido fluorofálico e 1,14 gramas de glutarimida e mexa no refluxo por seis horas para obter uma solução roxa do Composto 3. Deixe a mistura esfriar até a temperatura ambiente, e depois despeje-a em 100 mililitros de água desionizada e mexa por 10 minutos para precipitar o Composto 3. Recolher o sólido por filtragem, lavá-lo com água e éter de petróleo, e secá-lo sob vácuo por dois dias.Em seguida, coloque 0,83 gramas de Composto Três e 20 mililitros de sulfóxido de dimetil seco em um frasco schlenk de 50 mililitros e mexa por dois minutos. Adicione 0,22 gramas de alfa ômega diamine linker Composto 6, e 1,05 mililitros de N, N-diisopropylethylamina e mexa a mistura sob argônio a 90 graus celsius por 18 horas para obter Homodimer 8 em uma mistura verde escura. Deixe a mistura esfriar à temperatura ambiente e despeje-a em 100 mililitros de água deionizada.Extraia o produto em três porções de 50 mililitros de acetato etílico, combine as camadas orgânicas e lave-as com 50 mililitros cada de água e salmoura. Seque a camada orgânica lavada sobre sulfato de sódio, filtre o dessecante e remova o solvente sob vácuo. Redissolve o resíduo em uma quantidade mínima de solvente de cromatografia e aplique em uma coluna de gel de sílica para purificação.Colete as frações fluorescentes do produto, combine-as e remova o solvente para obter o Homodimer 8 como um sólido amarelo. Para começar, dissolva 2,28 gramas de Glutarimide 1 em 25 mililitros de dimetilformamida em um frasco de fundo redondo de 100 mililitros. Suspenda 2,76 gramas de carbonato de potássio moído nesta solução.Em seguida, desenhe 0,62 mililitros de iodometano em uma seringa equipada com uma agulha de calibre 20. Adicione o iodometano em termos de queda ao longo de 10 segundos. Roe o frasco com um septo de borracha, e adicione uma agulha de ventilação.Sonicar a mistura por duas horas à temperatura ambiente para obter o Composto glutarimídeo 2. Diluir a mistura com 50 mililitros de acetato etílico e despeje-a em um funil separador. Enxágüe o frasco no funil com outros 50 mililitros de acetato etílico.Trabalhe o produto e purifique-o com cromatografia de coluna de gel de sílica para obter Glutarimide 2 como um sólido incolor. Compare os tempos de retenção dos Compostos glutarimídeos 1 e 2 para confirmar que a n-metilação foi bem sucedida. Para iniciar a validação, trate múltiplas células de mieloma com os compostos de interesse.Isole as proteínas relevantes e prepare amostras para uma análise de Western Blot da degradação da proteína. Em seguida, prepare um sanduíche de gel para SDS-PAGE e encha o tanque tampão de ânodo com uma solução de pH 8.9 tris-HCl. Carregue as amostras de proteína no gel e execute-as a 70 Volts por 20 minutos, seguidas por 115 volts por 150 minutos.Em seguida, prepare o tampão de transferência 1x para imunoblotting e mova cuidadosamente o gel de seu para o buffer de transferência para equilibrar. Você tem que ter muito cuidado quando você remover o gel da fita para equilíbrio, porque ele pode estourar e amassar muito rapidamente. Mergulhe uma membrana de difluoreto de polivinida de 0,45 micrômetro em metanol puro por pelo menos 20 segundos para ativá-lo e, em seguida, imergi-lo em 1x tampão de transferência.Deixe o gel e a membrana equilibrarem por 10 minutos. Em seguida, monte o Western Blotting e aplique 180 miliamperes por 90 minutos para transferir as proteínas para a membrana. Depois, visualize as proteínas imunosteando.Para avaliar os efeitos sobre a viabilidade celular, primeiro, sementes 50.000 células de mieloma múltiplo por poço de uma placa de 96 poços em triplicado biológico. Adicione a cada poço 100 microliters de mídia contendo DMSO, ou um 0.1, um ou 10 micromolar de Composto 8, Composto 9 ou pomalidomida. Para realizar o experimento de resgate de viabilidade celular, em vez disso, trate as células com uma solução de 100 nanomolars do Composto 8 por três horas, antes ou depois de adicionar uma solução micromolar de pomalidomida.Incubar as células por 24, 48 ou 96 horas a 37 graus celsius em uma atmosfera de dióxido de carbono de 5%, e medir a viabilidade celular com um ensaio luminescente. A estrutura do homodimeric PROTAC 8 foi confirmada com próton e carbono NMR. O HEterodimerico PROTAC 9 foi sintetizado como um controle negativo, pois a metilação N dentro da porção de glutarimida resulta em perda de Cereblon, ou CRBN, capacidade de ligação.O homo PROTAC 8 induziu a degradação proteosômica do CRBN quase completa com efeitos mínimos sobre os fatores de transcrição linfoide IKZF1 e IKZF3. Em contraste, o hetero PROTAC 9 apresentou comportamento semelhante aos pomalidomides. A degradação do CRBN induzido pelo composto 8 pode ser bloqueada por um inibidor direto do proteasome, ou indiretamente bloqueada pela inibição da rede.As células pré-tratadas com composto 8 resistiram significativamente aos efeitos da pomalidomida no IKZF1 e IKZF3. A degradação do CRBN induzido composto 8 teve muito menos efeito na viabilidade celular de mieloma múltiplo após 96 horas do que a degradação do IKZF1 e do IKZF3 do Composto 9 e pomalidomida. Múltiplas células de mieloma pré-tratadas com composto 8 apresentaram viabilidade significativamente maior quando expostas à pomalidomida do que células não tratadas, sugerindo que o Composto 8 poderia ser usado para imitar a resistência a medicamentos IMiD imunomodulatórios.Descobrimos que o Composto 8 induz a degradação proteassômica completa do Cereblon, não tem efeitos colaterais na viabilidade e proliferação celular IKZF1 e IKZF3. Estender a tecnologia do projeto para outros alvos tem potencial para inativar e rastrear proteínas relacionadas ao câncer e outras doenças. Ao adaptar esta técnica para outras drogas e proteínas, deve-se investigar cuidadosamente as estruturas moleculares da droga e o alvo proteico para escolher os conectores e acessórios ideais.Os IMiDs não funcionarão em camundongos por causa de uma mutação pontual no Cereblon, mas existe um modelo de rato transgênico que pode ser usado para estudos em animais. Como a pomalimida é uma talidomida analógica, que é altamente teratogênica, não recomendamos gestantes que trabalham com essas drogas.

chemical-inactivation-e3-ubiquitin-ligase-cereblon-pomalidomide-based

Research

JoVE Journal

Chemistry

Química

A actividade citotóxica do fenantridina PJ-34 em células de cancro sujeitos a mitose foi documentada em tempo real por meio de imagem confocal vivo. PJ-34 erradicou o câncer de mama humano MDA-MB-231 células abrigam extra-centrossomas na mitose. Ao contrário de mitose bi-focal normal, o Extra-centrossomas não foram agrupados nos dois pólos do fuso na presença de PJ-34.

A morte celular associada com mitose anormal observado por imagem confocal em células vivas Câncer

Avaliar a potência dos produtos químicos ambientais e drogas, a ser enzimaticamente adutos bioactivated gerando covalent DNA e intermediários, é um campo importante no desenvolvimento do câncer e seu tratamento. Métodos são descritos para ativação composta para formar que adutos de DNA, bem como técnicas para a sua detecção e quantificação.

Formação de ligações covalente DNA adutos por agentes cancerígenos ativados enzimaticamente drogas In Vitro e sua determinação por 32P-postlabeling

Este papel utiliza um ensaio de fluxo cytometry-baseado para bibliotecas de tela de inibidores químicos para a identificação de inibidores e os alvos que influenciam a sinalização do receptor de células T. Os métodos descritos aqui também podem ser expandidos para as sessões de alta produtividade.

Identificação de mediadores do Receptor de células T através da triagem de bibliotecas de inibidor químico de sinalização

Este protocolo visa estabelecer proteomas específicos de ubiquitina (Ub) e ubiquitina (Ubls), a fim de identificar alterações desse tipo de modificações pós-translacional (PTMs), associadas a uma condição específica, como tratamento ou fenótipo.

Perfil de Ubiquitin e Ubiquitin-like Modificações pós-translacionais dependentes e identificação de alterações significativas

Este protocolo descreve a detecção luminescente quantitativa da cinética de degradação de proteínas em células vivas que foram modificadas usando CRISPR/Cas9 para expressar a etiqueta de detecção endógena livre de anticorpos fundida a uma proteína-alvo. Instruções detalhadas para calcular e obter parâmetros quantitativos de degradação, taxa, Dmax, DC 50 e Dmax50 estão incluídas.

Perfil celular de alto rendimento de compostos de degradação de proteínas direcionadas usando linhas celulares CRISPR HiBiT

Aqui, descrevemos um bioensaio usando brometo de 3-(4′,5′-dimetiltiazol-2′-il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT) para testar oximas espirocíclicos previamente sintetizados.

Síntese Espirocíclica Funcionalizada de Heterociclos e Ensaio de Citotoxicidade

O presente protocolo destaca um método modificado para detectar e quantificar ligações cruzadas DNA-proteína (DPCs) e suas modificações pós-traducionais (MPTs), incluindo ubiquitilação, SUMOilação e ADP-ribosilação induzida por inibidores de topoisomerase e por formaldeído, permitindo assim o estudo da formação e reparo de DPCs e suas MPTs.

Detecção quantitativa de ligações cruzadas DNA-proteína e suas modificações pós-traducionais

Este artigo relata a construção de células knockout da proteína E associada a centrômeros (CENP-E) usando o sistema CRISPR/Cas9 e três estratégias de triagem baseadas em fenótipos. Utilizamos a linhagem celular knockout do CENP-E para estabelecer uma nova abordagem para validar a especificidade e toxicidade dos inibidores do CENP-E, o que é útil para o desenvolvimento de fármacos e pesquisa biológica.

Geração de Linhagens Celulares Knockout da Proteína Associada ao Centrômero-E CENP-E-/- utilizando o Sistema CRISPR/Cas9

Descrevemos protocolos para a caracterização biofísica da formação de complexos ternários induzidos por proteólise visando quimeras (PROTACS) que envolvem os ligases ubiquitina Von Hippel-Lindau E3 ligase (BVS) e Cereblon (CRBN).  Os métodos biofísicos aqui ilustrados incluem ressonância plasmônica de superfície (SPR), interferometria de biocamada (BLI) e calorimetria de titulação isotérmica (ITC).

Desenvolvimento e aplicação de ensaios biofísicos para avaliação da formação de complexos ternários induzidos por proteólise visando quimeras (PROTACS)

Descrevemos detalhes experimentais para a síntese de partículas e reconfiguráveis ​​estampados a partir de duas dimensões (2D) precursores. Esta metodologia pode ser utilizada para criar partículas, em uma variedade de formas, incluindo poliedros e dispositivos de preensão em escalas de comprimento variando entre o micro escala de centímetro.

Origami Inspirado Auto-montagem de Partículas estampados e Reconfigurável

Aprenda a sintetizar homo-PROTACs baseados em pomalidomida para inativar a E3 ubiquitina ligase Cereblon (CRBN). Esta plataforma permite direcionar proteínas intracelulares anteriormente inacessíveis para degradação.

Inativação química da E3 ubiquitina ligase Cereblon por Homo-PROTACs à base de Pomalidomida

Explorar mais vídeos