Padronização tridimensional de biofilmes projetados com uma Bioimpressora do-it-yourself
16 de maio de 2019
Este artigo descreve um método de transformar uma impressora 3D comercial de baixo custo em uma impressora 3D bacteriana que pode facilitar a impressão de biofilmes padronizados. Todos os aspectos necessários da preparação da bioimpressora e da biostinta são descritos, bem como métodos de verificação para avaliar a formação de biofilmes.
Bioimpressão 3D com bactérias é uma técnica recém-desenvolvida. Este protocolo fornece uma maneira fácil de construir biofilmes projetados impressos em 3D com bactérias. A principal vantagem desta técnica é a capacidade de produzir biofilmes impressos em 3D usando uma impressora 3D barata.
Uma possível aplicação da nossa impressora 3D é criar biofilmes de modelos reprodutíveis que podem ser usados para desenvolver novas terapias antibacterianas. Nossa abordagem de impressão 3D pode ser aplicada a qualquer tipo de bactéria compatível com nosso bioink à base de alginato. A preparação do bioink e dos substratos de impressão são procedimentos bastante padrão, enquanto o processo de impressão 3D, especialmente a calibração do eixo Z é uma etapa crucial que requer alguma prática.
A calibração da altura de acesso definida influenciará a resolução da nossa impressora 3D, e depende fortemente da experiência pessoal. Este procedimento requer ajustes manuais, e é difícil ser descrito em um formato escrito. Conecte uma ponta de pipeta de 200 microliteres a um comprimento de tubo de silicone e monte a ponta da pipeta na cabeça da extrusora da impressora 3D como um substituto para o extrusor original.
Em seguida, adicione quatro mililitros de uma solução de cloreto de cálcio molar de cinco molares a 400 mililitros de 1% de ágar dissolvido no caldo Luria-Bertani, e suplementá-lo com os antibióticos e indutores apropriados. Em seguida, dispense 20 mililitros da solução de ágar LB em cada placa de 150 milímetros por 15 milímetros de Petri. Seque o prato por 30 minutos em temperatura ambiente, com a tampa meio aberta.
Prepare uma solução de alginato de 3% de sódio e aqueça-a ao ponto de ebulição três vezes para esterilizar a solução. Em seguida, armazene a solução estéril a quatro graus Celsius até que ela seja usada. Para preparar o componente bacteriano do bioink, crie bactérias E.coli carregando plasmídeos para expressão de GFP constitutiva em 50 mililitros de meio LB contendo antibióticos.
Agite a cultura a 250 RPM e 37 graus Celsius durante a noite. Após o crescimento da cultura durante a noite, pelota as bactérias por cinco minutos a 3.220 vezes a gravidade e, em seguida, remova o supernasce. Resuspend a bactéria pelota em 10 mililitros de meio LB, e adicione 10 mililitros de 3%de alginato de sódio.
Conecte a impressora 3D a um computador e abra o software de impressão 3D. Clique no botão Home para os eixos X, Y e Z, para mover a cabeça de impressão para a posição inicial. Para cada impressão, coloque um substrato de impressão preparado em um determinado local na cama de impressão.
Levante a cabeça de impressão para uma altura de mais de 22 milímetros sob controle manual, de modo que não colida com a borda da placa de Petri durante o movimento. Posicione a cabeça de impressão sobre a parte superior da placa e mova-a para baixo até que a ponta da pipeta entre em contato com a superfície de impressão. Atribua esta posição do eixo Z como Z1, a altura da superfície de impressão.
Em seguida, levante a cabeça de impressão e mova-a manualmente para fora da área da placa. Se a distância de trabalho entre a cabeça de impressão e a superfície da placa for definida como Z2, digite a altura da superfície de impressão mais a distância de trabalho no programa de impressão como o valor Z durante a impressão. Carregue um arquivo de código G pré-programado contendo comandos para imprimir a forma desejada.
Em cada linha de comando, a posição da cabeça de impressão pode ser alterada nos eixos X, Y e ou Z. Certifique-se de inserir o valor Z durante todas as etapas de impressão como a altura da superfície de impressão mais a distância de trabalho. Carregue o biointo líquido em seringas e monte-os na bomba de seringa da bioimpressora 3D.
Em seguida, defina a velocidade de extrusão para 0,3 mililitros por hora. Imprima o bioink no substrato de impressão clicando no botão Imprimir. Aguarde para iniciar a bomba de seringa até que a impressão tenha começado, e antes que a cabeça de impressão entre em contato com a superfície de impressão.
Durante a impressão, controle o movimento da cabeça de impressão inteiramente pelo software. Pare a bomba de seringa assim que a cabeça de impressão chegar ao último ponto de impressão, caso contrário, o excesso de bioink cairá sobre o substrato de impressão e reduzirá a resolução de impressão. Para a construção de estruturas 3D, todos os movimentos da cabeça de impressão são controlados no editor de código G.
Para aumentar a altura de impressão para a segunda camada, digite a altura de impressão da primeira camada e aumente o valor Z no código em 0,2 milímetros. Depois disso, aumente o valor Z em 0,1 milímetro, quando se mover para uma camada superior. Incubar as amostras impressas à temperatura ambiente por três a seis dias para permitir a produção dos componentes do biofilme, como as fibras de Curli.
Em seguida, coloque a placa em um scanner fluorescente e imagem as placas. Para dissolver a matriz de alginato, adicione 20 mililitros de uma solução de citrato de sódio molar de 0,5 no pH 7, ao substrato impresso. Incubar a placa em temperatura ambiente por duas horas enquanto treme a 30 rpm.
Em seguida, descarte o líquido e a imagem das placas novamente, para comparar com as imagens das placas antes e depois do tratamento citrato. A bioimpressora 3D pode criar bactérias encapsulando hidrogéis em uma variedade de formas bidimensionais e tridimensionais. Essas formas impressas podem então ser usadas para avaliar se a formação de biofilme foi bem sucedida ou se a matriz de alginato é completamente dissolvida usando uma solução de citrato de sódio.
No caso do bioink sem o plasmídeo de produção curli indutível, o padrão impresso foi completamente dissolvido após o tratamento de citrato de sódio, significando que nenhuma rede de Curli biofilm havia se formado. As bactérias que continham o plasmídeo de produção indutível de Curli não foram dissolvidas após o tratamento de citrato de sódio, indicando que as bactérias impressas foram capazes de formar uma rede Curli extensa o suficiente para estabilizar o padrão impresso de bactérias. Para construir estruturas em várias camadas, camadas adicionais podem ser impressas controlando o editor de código G.
O aumento do número de camadas impressas em uma amostra fez com que a largura e a altura das estruturas impressas aumentassem gradualmente. Quando a E.coli projetada para produzir indutilmente proteínas Curli foram impressas em estruturas multicamadas, o tratamento de citrato de sódio não dissolveu as amostras, enquanto estruturas multicamadas contendo E.coli não produtoras de Curli foram dissolvidas. As partes mais críticas do procedimento de impressão 3D são a calibração do eixo Z e a coordenação de iniciar a impressão e iniciar a bomba de seringa.
O bioink desenvolvido para este processo é bastante macio, com baixa dureza. Outra modificação poderia ser feita no bioink, a fim de fornecer e melhorar a estabilidade mecânica. Esta técnica de impressão 3D permite a produção de biofilmes com excelentes propriedades mecânicas, o que pode permitir a fabricação de materiais biomiméticos.
Ao manusear essas bactérias, use proteção adequada, como luvas.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um método para transformar uma impressora 3D comercial de baixo custo em uma impressora bacteriana 3D capaz de imprimir biofilmes padronizados. Detalha a preparação da bioimpressora, do bio-tinta e dos métodos de verificação para avaliar a formação de biofilmes.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Bioprintagem 3D
- Microbiologia
- Bioengenharia
Contexto
- A bioprintagem 3D com bactérias é uma técnica emergente.
- Este método permite a construção de biofilmes projetados.
- Utiliza uma impressora 3D caseira de baixo custo.
- As aplicações incluem o desenvolvimento de novas terapias antibacterianas.
Objetivo do Estudo
- Criar biofilmes modelo reprodutíveis.
- Facilitar o desenvolvimento de terapias antibacterianas.
- Demonstrar a versatilidade da impressão 3D com diversas bactérias compatíveis.
Métodos Utilizados
- Preparação da bio-tinta à base de alginato.
- Calibração do eixo Z da impressora 3D.
- Procedimentos padrão para impressão de substratos.
- Métodos de verificação para formação de biofilme.
Resultados Principais
- Impressão bem-sucedida de biofilmes padronizados.
- Compatibilidade demonstrada com diversas bactérias.
- Reprodutibilidade estabelecida de biofilmes modelo.
- Oferecimento de uma solução economicamente viável para engenharia de biofilmes.
Conclusões
- O método melhora o acesso à tecnologia de bioprintagem 3D.
- Abre caminhos para pesquisas em terapias antibacterianas.
- Recomenda-se a otimização adicional do processo de impressão.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este método permite sistemas modelo de biofilme reproduzíveis e modificáveis para o desenvolvimento de terapias antibacterianas e aplicações ambientais. Ao fornecer uma plataforma acessível e de baixo custo para a fabricação de biofilmes com controle espacial, ele apoia a validação precoce de alvos e a redução de riscos mecanicistas em pipelines de descoberta de antimicrobianos. A abordagem facilita a confiança preditiva em mecanismos relacionados a biofilmes sem exigir infraestrutura especializada em bioprintagem.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite investigar os mecanismos de formação de biofilmes por meio da expressão induzível de proteínas da matriz, como a Curli.
- Valor Operacional: Apoia a verificação de hipóteses sobre fatores genéticos e ambientais que influenciam a estabilidade do biofilme e a resistência a antibióticos.
- Valor Preditivo: Fornece uma saída quantificável de biofilme por meio da resistência à dissolução por citrato de sódio, permitindo decisões de prosseguir ou interromper em relação a vias-alvo.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Gera substratos padronizados e com padrões espaciais de biofilme para triagem consistente de compostos contra fenótipos associados a biofilmes.
- Valor Operacional: Utiliza bioensaio à base de alginato compatível com diversas bactérias, permitindo adaptação do ensaio entre diferentes cepas-alvo sem necessidade de reformulação.
- Escalabilidade: Permite a produção de estruturas multicamadas com ajustes incrementais no eixo Z, possibilitando formatos de triagem de resposta à dose e de curso temporal.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Translacional: Produz modelos de biofilme que imitam a resistência a antibióticos mediada pela matriz extracelular, relevantes para testes pré-clínicos de eficácia.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Permite a visualização de componentes do biofilme (por exemplo, fibras de curli) por meio de imagem de fluorescência antes e após a dissolução da matriz, confirmando o engajamento do alvo.
- Continuidade: Apoia a transição da modelagem de biofilme em escala de descoberta para avaliação pré-clínica de agentes antibiofilme.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta que vai da verificação da hipótese do alvo à otimização de compostos líderes, especialmente para programas antimicrobianos que focam na tolerância associada a biofilmes.
- Biologia da Descoberta: Testa hipóteses terapêuticas por meio da engenharia de cepas deficientes em biofilme e da avaliação da integridade estrutural após o tratamento.
- Triagem: Fornece formatos reprodutíveis de biofilme com leituras quantificáveis (por exemplo, fluorescência, resistência à dissolução) para avaliação de compostos de alto conteúdo.
- Análises: Permite a comparação da formação de biofilme entre diferentes condições por meio de imagens e extração bioquímica, apoiando a priorização baseada em dados.
- Pesquisa Translacional: Conecta modelos de biofilme in vitro à validação pré-clínica, demonstrando resistência fenotípica dependente da matriz.
- Reutilização Empresarial: Representa uma plataforma modular e adaptável, aplicável a diferentes alvos bacterianos e indicações relacionadas ao biofilme.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista na formação de biofilmes ao vincular a indução genética à produção da matriz e à estabilidade estrutural.
- Valor Operacional: Garante reprodutibilidade por meio da preparação padronizada de biotinta e impressão calibrada no eixo Z, minimizando a variabilidade entre ensaios.
- Valor Estratégico: Melhora a eficiência de capital ao permitir a geração de modelos de biofilmes em impressoras de consumo modificadas e de baixo custo.
- Impacto no Portfólio: Apoia o avanço ajustado ao risco ao identificar compostos que interrompem a matriz do biofilme sem afetar o crescimento planctônico.
Considerações de Implementação
- Requer conhecimento microbiológico para a preparação estéril do bioink e manipulação bacteriana sob diretrizes de biossegurança.
- Depende da calibração precisa do eixo Z e da sincronização do movimento da cabeça de impressão com a extrusão da bomba de seringa para manter a resolução.
- Necessita padronização da preparação do substrato (por exemplo, placas de ágar com cloreto de cálcio) e do tempo de indução para expressão consistente de proteínas em biofilmes.
- A adaptação a cepas bacterianas alternativas pode exigir otimização da concentração do indutor e da concentração de alginato para viabilidade e capacidade de impressão.
- As limitações práticas incluem a maciez do bioink e baixa tenacidade, o que pode restringir aplicações de testes mecânicos sem reticulação adicional ou modificação do polímero.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
0:04
Title
1:16
3D Printer and Substrate Preparation
2:00
Bio-ink Preparation
3:04
3D Printing Process
5:40
Growing and Testing the Effectiveness of Biofilm Production by E. coli
6:28
Results: Three-dimensional Patterning of Engineered Biofilms
7:50
Conclusion
