Padronização tridimensional de biofilmes projetados com uma Bioimpressora do-it-yourself

Bioimpressão 3D com bactérias é uma técnica recém-desenvolvida. Este protocolo fornece uma maneira fácil de construir biofilmes projetados impressos em 3D com bactérias. A principal vantagem desta técnica é a capacidade de produzir biofilmes impressos em 3D usando uma impressora 3D barata.

Uma possível aplicação da nossa impressora 3D é criar biofilmes de modelos reprodutíveis que podem ser usados para desenvolver novas terapias antibacterianas. Nossa abordagem de impressão 3D pode ser aplicada a qualquer tipo de bactéria compatível com nosso bioink à base de alginato. A preparação do bioink e dos substratos de impressão são procedimentos bastante padrão, enquanto o processo de impressão 3D, especialmente a calibração do eixo Z é uma etapa crucial que requer alguma prática.

A calibração da altura de acesso definida influenciará a resolução da nossa impressora 3D, e depende fortemente da experiência pessoal. Este procedimento requer ajustes manuais, e é difícil ser descrito em um formato escrito. Conecte uma ponta de pipeta de 200 microliteres a um comprimento de tubo de silicone e monte a ponta da pipeta na cabeça da extrusora da impressora 3D como um substituto para o extrusor original.

Em seguida, adicione quatro mililitros de uma solução de cloreto de cálcio molar de cinco molares a 400 mililitros de 1% de ágar dissolvido no caldo Luria-Bertani, e suplementá-lo com os antibióticos e indutores apropriados. Em seguida, dispense 20 mililitros da solução de ágar LB em cada placa de 150 milímetros por 15 milímetros de Petri. Seque o prato por 30 minutos em temperatura ambiente, com a tampa meio aberta.

Prepare uma solução de alginato de 3% de sódio e aqueça-a ao ponto de ebulição três vezes para esterilizar a solução. Em seguida, armazene a solução estéril a quatro graus Celsius até que ela seja usada. Para preparar o componente bacteriano do bioink, crie bactérias E.coli carregando plasmídeos para expressão de GFP constitutiva em 50 mililitros de meio LB contendo antibióticos.

Agite a cultura a 250 RPM e 37 graus Celsius durante a noite. Após o crescimento da cultura durante a noite, pelota as bactérias por cinco minutos a 3.220 vezes a gravidade e, em seguida, remova o supernasce. Resuspend a bactéria pelota em 10 mililitros de meio LB, e adicione 10 mililitros de 3%de alginato de sódio.

Conecte a impressora 3D a um computador e abra o software de impressão 3D. Clique no botão Home para os eixos X, Y e Z, para mover a cabeça de impressão para a posição inicial. Para cada impressão, coloque um substrato de impressão preparado em um determinado local na cama de impressão.

Levante a cabeça de impressão para uma altura de mais de 22 milímetros sob controle manual, de modo que não colida com a borda da placa de Petri durante o movimento. Posicione a cabeça de impressão sobre a parte superior da placa e mova-a para baixo até que a ponta da pipeta entre em contato com a superfície de impressão. Atribua esta posição do eixo Z como Z1, a altura da superfície de impressão.

Em seguida, levante a cabeça de impressão e mova-a manualmente para fora da área da placa. Se a distância de trabalho entre a cabeça de impressão e a superfície da placa for definida como Z2, digite a altura da superfície de impressão mais a distância de trabalho no programa de impressão como o valor Z durante a impressão. Carregue um arquivo de código G pré-programado contendo comandos para imprimir a forma desejada.

Em cada linha de comando, a posição da cabeça de impressão pode ser alterada nos eixos X, Y e ou Z. Certifique-se de inserir o valor Z durante todas as etapas de impressão como a altura da superfície de impressão mais a distância de trabalho. Carregue o biointo líquido em seringas e monte-os na bomba de seringa da bioimpressora 3D.

Em seguida, defina a velocidade de extrusão para 0,3 mililitros por hora. Imprima o bioink no substrato de impressão clicando no botão Imprimir. Aguarde para iniciar a bomba de seringa até que a impressão tenha começado, e antes que a cabeça de impressão entre em contato com a superfície de impressão.

Durante a impressão, controle o movimento da cabeça de impressão inteiramente pelo software. Pare a bomba de seringa assim que a cabeça de impressão chegar ao último ponto de impressão, caso contrário, o excesso de bioink cairá sobre o substrato de impressão e reduzirá a resolução de impressão. Para a construção de estruturas 3D, todos os movimentos da cabeça de impressão são controlados no editor de código G.

Para aumentar a altura de impressão para a segunda camada, digite a altura de impressão da primeira camada e aumente o valor Z no código em 0,2 milímetros. Depois disso, aumente o valor Z em 0,1 milímetro, quando se mover para uma camada superior. Incubar as amostras impressas à temperatura ambiente por três a seis dias para permitir a produção dos componentes do biofilme, como as fibras de Curli.

Em seguida, coloque a placa em um scanner fluorescente e imagem as placas. Para dissolver a matriz de alginato, adicione 20 mililitros de uma solução de citrato de sódio molar de 0,5 no pH 7, ao substrato impresso. Incubar a placa em temperatura ambiente por duas horas enquanto treme a 30 rpm.

Em seguida, descarte o líquido e a imagem das placas novamente, para comparar com as imagens das placas antes e depois do tratamento citrato. A bioimpressora 3D pode criar bactérias encapsulando hidrogéis em uma variedade de formas bidimensionais e tridimensionais. Essas formas impressas podem então ser usadas para avaliar se a formação de biofilme foi bem sucedida ou se a matriz de alginato é completamente dissolvida usando uma solução de citrato de sódio.

No caso do bioink sem o plasmídeo de produção curli indutível, o padrão impresso foi completamente dissolvido após o tratamento de citrato de sódio, significando que nenhuma rede de Curli biofilm havia se formado. As bactérias que continham o plasmídeo de produção indutível de Curli não foram dissolvidas após o tratamento de citrato de sódio, indicando que as bactérias impressas foram capazes de formar uma rede Curli extensa o suficiente para estabilizar o padrão impresso de bactérias. Para construir estruturas em várias camadas, camadas adicionais podem ser impressas controlando o editor de código G.

O aumento do número de camadas impressas em uma amostra fez com que a largura e a altura das estruturas impressas aumentassem gradualmente. Quando a E.coli projetada para produzir indutilmente proteínas Curli foram impressas em estruturas multicamadas, o tratamento de citrato de sódio não dissolveu as amostras, enquanto estruturas multicamadas contendo E.coli não produtoras de Curli foram dissolvidas. As partes mais críticas do procedimento de impressão 3D são a calibração do eixo Z e a coordenação de iniciar a impressão e iniciar a bomba de seringa.

O bioink desenvolvido para este processo é bastante macio, com baixa dureza. Outra modificação poderia ser feita no bioink, a fim de fornecer e melhorar a estabilidade mecânica. Esta técnica de impressão 3D permite a produção de biofilmes com excelentes propriedades mecânicas, o que pode permitir a fabricação de materiais biomiméticos.

Ao manusear essas bactérias, use proteção adequada, como luvas.