Name: Geração de hidrogéis com base em colágeno 3-D para analisar o crescimento e o comportamento axonal durante o desenvolvimento do sistema nervoso (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Aprenda a gerar hidrogéis de colágeno 3-D para analisar crescimento e orientação axonal durante o desenvolvimento do sistema nervoso. Este método utiliza células COS-1 transfectadas e tecido embrionário de rato.

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Os autores agradecem a Tom Yohannan pelo Conselho editorial e M. segura-Feliu pela assistência técnica. Este trabalho foi financiado pelo programa CERCA e pela Comissão para universidades e pesquisa do departamento de inovação, universidades e empresa da Generalitat de Catalunya (SGR2017-648). Este trabalho foi financiado pelo Ministério espanhol de pesquisa, inovação e Universidade (MEICO) através de BFU2015-67777-R e e RTI2018-099773-B-100, a rede espanhola prion (PRIONET Spain AGL2017-90665-REDT), eo Instituto Carlos III, CIBERNED ( PRY-2018-2).

Todos os experimentos com animais foram realizados as diretrizes e protocolos do Comitê de ética para experimentação animal (CEEA) da Universidade de Barcelona, e o protocolo para o uso de roedores neste estudo foi revisado e aprovado pelo CEEA do Universidade de Barcelona (CEEA aprovação #276/16 e 141/15).
1. purificação do colagénio da cauda do rato
<ol><li>Colete adultos Sprague-Dawley caudas de ratos (8-9 semanas de idade) depois de sacrificar o animal seguindo as orientações éticas e enxaguar em 95% etanol. Coloque 2-4 caudas no gelo (4 ° c) e mantenha-os cobertos com gelo durante o processo.</li>
	<li>Para obter tendões da cauda, fixar a cauda nas vértebras mais caudais da cauda usando um hemostato e comprimir a cauda com um segundo hemostato posicionado em torno de 5-7 mm a partir do primeiro. Quebre a cauda girando-a agudamente com ambos os hemostats. Para fazer isso, dobre/desdobrar as vértebras várias vezes até que ele quebre.</li>
	<li>Puxe as vértebras lentamente com o hemostato para separar os tendões de sua bainha como ele sai. Neste momento, corte os tendões com pequenas tesouras. Mantenha estas partes do tendão em um prato de Petri estéril de 100 milímetros no gelo.</li>
	<li>Repita a fixação e deslize para o resto da cauda até que os tendões são totalmente extraídos.</li>
	<li>Repita os passos 1.2-1.4 para todas as caudas obtidas.</li>
	<li>Observe os tendões um microscópio. Descarte os vasos sanguíneos cortando com pequenas tesouras e segurando com fórceps fino reto para melhorar a pureza do tendão e enxaguar os tendões 3 vezes com água ultrapura.</li>
	<li>Colete 3-4 g de tendões molhados. Dissolver os tendões em 150 mL de 3% de ácido acético glacial a 4 ° c em um balão cônico de vidro de 200-250 mL para 24-36 h, agitação suave.</li>
	<li>Centrifugador a 20.000 x g por 1 h. Em paralelo, prepare a membrana da tubagem de diálise cortando uma peça de cerca de 10-15 cm de comprimento e ferva-a em água ultrapura contendo 1 mM de ácido etilenodiaminotraacético (EDTA) durante 15 min. Em seguida, enxague suavemente a membrana de diálise cuidadosamente com água ultrapura.</li>
	<li>Após a centrifugação, recolher o sobrenadante na membrana da tubagem de diálise por decantação. A pelota contem o material insolúvel ácido (proteínas não-collagenous) e o sobrenadante contem proteínas solúveis do colagénio.</li>
	<li>Dialyze o sobrenadante contra 2 L de estéril 0,1 x mínimo essencial águia média (MEM), pH 4,0 em um copo de vidro de 2-5 L. Dialyze por 3 dias. Mude a solução de 0.1 x MEM pelo menos duas vezes por dia verificando o pH em cada mudança antes de usar. Se o pH se tornou básico, modifique-o com algumas gotas de ácido acético a 0,1 M até que o pH seja 4,0.</li>
	<li>Após a diálise, adicione antibióticos (1,5 mL de penicilina/estreptomicina (Pen-Strep)) à solução de colágeno dialítico. Faça alíquotas de 5 mL da solução de colágeno e armazene a 4 ° c. Nota: A partir deste ponto, todos os procedimentos de manuseio devem ser realizados condições estéreis em uma capa de fluxo laminar.</li>
	<li>
Prossiga com o teste de gelação da solução de colágeno preparada seguindo os próximos passos.
	<ol>
<li>Uma vez que o colágeno de ações é geralmente muito concentrado, prepare 3 diluições de trabalho (75%, 50% e 25% de solução de colágeno), diluindo o estoque em 0,1 x MEM, pH 4,0. O volume final recomendado para cada diluição de trabalho é de 5 mL. Em cada condição, verifique a concentração proteica usando um ensaio colorimétrico protéico.</li>
		<li>Coloque vários tubos de centrifugação cônicos vazios de 1,5 mL (um para cada diluição de trabalho), tubos de 10x MEM, solução de bicarbonato de sódio a 7,5% e diferentes diluições de trabalho de colágeno no gelo. Aguarde até que estes sejam arrefecidos.</li>
		<li>Adicionar 40-50 μL de 10x MEM a um tubo de centrifugação a frio (4 ° c). Em seguida, misture suavemente com 7-8 μL de solução de bicarbonato de sódio.</li>
		<li>Adicione 310-330 μL de uma das diferentes diluições de colágeno a este tubo e misture suavemente com a pipeta evitando qualquer formação de bolhas. Manter a mistura de bicarbonato de colágeno-MEM-sódio no gelo (4 ° c) durante pelo menos 5 min.</li>
		<li>Pipete 10-25 μL da mistura para um prato de Petri de 35 mm.</li>
		<li>Coloque a placa de Petri na incubadora CO2 definida a 37 ° c até que a geladura do hidrogel (± 15-20 min) seja observada.</li>
		<li>Repita os passos 1.12.3-1.12.6 para as restantes diluições de colágeno em diferentes pratos de Petri.</li>
		<li>Selecione a diluição de trabalho do colagénio que rende os melhores resultados. Nota: O melhor hidrogel gelificada deve ter uma textura translúcida uniforme, cor cinzenta e não deve ser irregular ou stringy. Em nossa experiência, uma diluição de 3:1 (colágeno: 0,1 x MEM) gera os melhores resultados experimentais.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. preparação de agregados celulares (COS1) geneticamente modificados para secretar uma molécula candidata em hidrogéis de colágeno 3-D
<ol><li>Placa 2 x 106 COS1 células em pratos de Petri de 35 mm e incubar com meio de cultura completo composto por 100 ml de D-mem contendo 10% (Vol/Vol) de soro bovino fetal inativado por calor, 0,5% (WT/vol) de glutamina e 1% (WT/vol) Pen/Strep em uma cultura celular incubadora, a fim de atingir 70-80% de confluência durante a noite. Prepare um prato de Petri para cada procedimento do transfection.</li>
	<li>
O dia seguinte transfecção COS1 pilhas com o ADN que codifica a molécula do candidato (netrin-1 ou Sema3E) usando o método liposome-baseado do transfection que segue as instruções do fabricante.
	<ol>
<li>Para fazer isso, misture 250 μL de meio livre de soro e DNA (1-2 μg por condição) para um tubo de centrifugação de 1,5 mL (tubo de DNA) e misture. Incubar à temperatura ambiente (RT) durante 5 min. Prepare um segundo tubo (tubo lipossómico) adicionando 240 μL do meio livre de soro e 10 μL do reagente de transfecção lipossómica. Incubar em RT por 5 min.</li>
		<li>Após a incubação, adicione o conteúdo do tubo de DNA ao tubo lipossómico e misture suavemente. Agora incubar em RT por 15 min. Substitua o meio nas células cultivadas com 1,5 mL do meio livre de soro e adicione a mistura de DNA-lipossomas à placa de Petri lentamente Dropwise. Incubar por 3 h na incubadora da cultura da pilha do CO2 .</li>
	</ol>
</li>
	<li>Após 3 h de incubação do transfection, substitua o meio com o meio de cultura completo e incubar durante a noite na incubadora.</li>
	<li>No dia seguinte, enxágüe as células com 0,1 M Dulbecco ' s fosfato salina tamponado (D-PBS), tratar culturas com Trypsin-EDTA (800 μL por cada prato para 5-15 min na incubadora de CO2 ) e recolher células destacadas com 15 ml de meio de cultura completo.</li>
	<li>Centrifugar as células a 4 ° c a 130 x g durante 5 min. Após a centrifugação, remova a mídia e preserve a pelota contendo COS1 células no gelo.</li>
	<li>Repita os passos 1.12.3-1.12.6 para preparar a mistura de trabalho de colágeno.</li>
	<li>Adicionar 100-150 μL da mistura de colagénio à pelota das células transfectadas e misturar suavemente introduzindo e descendo e distribuindo 45-50 μL desta mistura numa placa de Petri (35 mm de diâmetro) para formar uma faixa uniforme de células colágenas de cerca de 1 a 1,5 cm de comprimento. Coloque o prato na incubadora a 37 ° c (5% CO2) até que a Geladura (± 15-20 min) seja observada.</li>
	<li>Prepare uma segunda tira contendo células de controle (transfection mock) em um segundo prato de cultura e placa-lo na incubadora (± 15-20 min) e quando a geladura é concluída adicionar 3-4 ml de aquecido (37 ° c) COS1 completo meio de cultura para cada prato contendo o gelificada as tiras das colagénio-pilhas e mantêm-nas na incubadora da cultura da pilha do CO2 . Depois disso, corte as tiras de células colágenas para gerar pequenas peças quadradas (400 a 500 μm de comprimento) usando um bisturi fino ou um helicóptero de tecido.</li>
	<li>Transfira todas as seções da mesma condição do transfection a um prato de Petri que contem 3-3.5 mL de meios de cultura neuronal (NCM) e verific um microscópio da dissecção a qualidade das partes. Mais uma vez, mantê-los na incubadora de cultura de células CO2 . Nota: O meio de cultura neuronal consiste em meio Neurobasal contendo 1-5% (Vol/Vol) de soro de cavalo inativado por calor, 2 mM de glutamina, 0,5% (WT/vol) de glicose, 1% (WT/vol) solução Pen-Strep e 0, 44% (WT/vol) NaHCO3. Assegure-se de que o pH esteja entre 7.2-7.3.</li>
</ol>3. geração de explante embrionário para a cultura
<ol><li>Esterilize as ferramentas cirúrgicas (tesouras, punho da lâmina do bisturi, fórceps reto e curvado) por autoclavagem depois das directrizes rotineiras da esterilização. Em paralelo, prepare 500 mL de solução equilibrada de sal de Hank-tampão de glicose e 4-5 pratos de Petri (100 mm de diâmetro) contendo 10 mL de HBSS-G. Coloque estas placas no gelo (4 ° c).</li>
	<li>Sacrifique o rato fêmea grávido (dia Embryonic 16,5) fora da área estéril, seguindo os procedimentos éticos aprovados. Corte os chifres do embrião com a tesoura da cavidade abdominal e coloc o em um grande prato de Petri que contem o HBSS-G frio.</li>
	<li>Coloque o prato na capa de fluxo laminar e extraia os embriões com fórceps reto. Coloque-os em um novo prato contendo HBSS-G frio. Em seguida, retire a pele do embrião usando fórceps pequeno e cuidadosamente dissecar o cérebro usando o fórceps curvo e reto. Coloque-os em um prato contendo HBSS-G frio.</li>
	<li>um microscópio dissecando, corte o cérebro ao meio ao longo da linha média para separar ambos os hemisférios com o bisturi ou a tesoura fina e remova o diencephalon, as meninges e os vasos sanguíneos das partes do cérebro com fórceps fino.</li>
	<li>Repita os passos 3.3-3.4 com o resto dos embriões. Não atrasar a dissecção por mais de 2 h para preservar a qualidade do tecido.</li>
	<li>Limpe todas as partes do picador de tecido com 100% de etanol (especialmente a placa de corte de politetrafluoroetileno (PTFE) e a lâmina de barbear). Mantenha o helicóptero do tecido na capa do fluxo laminar a iluminação UV por 15 minutos.</li>
	<li>Transfira cada peça de tecido (por exemplo, córtex com hipocampo) para a placa de corte do helicóptero do tecido. Para o hipocampo, coloque-o perpendicular à lâmina de barbear e obtenha secções de tecido de 450-500 μm de espessura.</li>
	<li>Prepare vários pratos de Petri de 35 mm com 3-4 mL de NCM completos e peças de tecido de transferência da placa de Chopper de tecido para os pratos de Petri. Muitos pratos podem ser necessários como regiões de interesse são dissecados.</li>
	<li>Termine a dissecção do tecido no NCM completo usando agulhas finas do tungstênio. Verifique a qualidade das fatias obtidas o microscópio de dissecação. Certifique-se de que as camadas são claramente identificáveis na óptica Darkfield e dissecar a região de interesse (por exemplo, região do CA do hipocampo) com agulhas de tungstênio. Descarte as fatias danificadas. Mantenha explantes do hipocampal no meio completo de NCM na incubadora do CO2 .</li>
</ol>4. preparação de co-culturas 3-D em hidrogéis de colágeno
<ol><li>Coloc diversas placas estéreis da cultura de 4 poços na capa do fluxo laminar e prepare uma mistura de trabalho do colagénio como indicada previamente nas etapas 1.12.2-1.12.6.</li>
	<li>Coloque 15-20 μL da mistura de hidrogel na parte inferior de um poço para produzir uma base de colágeno circular. Repita este passo para o resto dos poços. Não Prepare mais de cinco placas ao mesmo tempo para evitar a evaporação líquida excessiva da base do hidrogel.</li>
	<li>Mantenha os pratos na incubadora até que a gelação completa (± 15-20 min) seja observada e leve as placas para fora da incubadora somente quando a gelação estiver concluída. Verifique a qualidade do colágeno gelado.</li>
	<li>Transfira um pequeno pedaço de agregado celular COS1 com uma pipeta. Coloc o na base do hidrogel e coloc uma parte do tecido na mesma base com uma pipeta perto da parte de pilhas agregado em um explant-tamanho.</li>
	<li>Prepare uma nova mistura de colágeno de trabalho no gelo como nas etapas 1.12.2-1.12.6.</li>
	<li>Pipeta delicadamente 15-20 μL desta mistura nova e cubra o agregado do explante e da pilha. Um sanduíche-como A cultura do hidrogel será observado. Neste momento, re-orientar o explante com uma agulha de tungstênio multa (não toque no agregado celular COS1!), por isso enfrenta o agregado celular em ± 500-600 μm.</li>
	<li>Retorne a placa à incubadora até que a geladura esteja observada (± 10-15 min), e 0,5 mL do NCM completo suplementado com o suplemento de 2% B27 e mantenha culturas para 36 a 48 h na incubadora (37 ° c, 5% CO2).</li>
</ol>5. fixação das co-culturas agregadas do explant-Cell e do procedimento de Immunocytochemical
<ol><li>Após 36-48 h de incubação, remover o meio e enxaguar com 0,1 M fosfato tampão salino (PBS), pH 7,3. Posteriormente, fixar as culturas por 1 h com paraformaldeído 4% em tampão fosfato de 0,1 M (PB), pH 7,3, a 4 ° c.</li>
	<li>Retire o fixador e enxague suavemente as culturas 3-4 vezes (10-15 min cada) em 0,1 M PB, pH 7,3.</li>
	<li>Retire o sanduíche de hidrogel da parte inferior do poço com espátula ou pinça. Transfira o bloco de colágeno com um pincel fino para uma placa de cultura de 6 poços contendo 0,1 M de PBS com 0,5% de detergente não iônico.</li>
	<li>Incubar hidrogéis flutuantes livres na solução de bloqueio (10% de soro, 0,5% de surfactante não iônico e 0,2% de gelatina em 0,1 M PBS) para 2-3 h em RT com agitação suave.</li>
	<li>Enxágüe 3 vezes (10-15 min cada) com 0,1 M PBS contendo 0,5% de surfactante não iônico.</li>
	<li>Incubar com anticorpo primário diluído em PBS contendo 5% de soro, 0,5% de surfactante não iônico, 0,2% de gelatina e 0, 2% de azida sódica. Incubar com o anticorpo preliminar para 36-48 h em 4 ° c em um abanador. Nota: Geralmente um anticorpo de encontro à classe III β-tubulin (α-Tuj-1) (diluído 1:2000) é usado para definir o crescimento axonal em culturas do hidrogel 3-D.</li>
	<li>Após a incubação, enxague como na etapa 5,5.</li>
	<li>Incubar com anticorpo secundário para 4 h em RT (ou 6-7 h a 4 ° c) em um Shaker diluído em 5% soro, 0,5% surfactante não-iônico, e 0,2% gelatina. Um anticorpo biotinylated do anti-rato do cavalo (1:200 diluído) é usado neste experimento.</li>
	<li>Enxágüe culturas como em 5,5.</li>
	<li>Incubar as culturas durante 2 dias a 4 ° c com solução de complexo avidina-biotina (ABC) 1:100 diluída em PBS contendo 5% de soro, 0,5% de surfactante não iônico e 0,2% de gelatina. Alternativamente, use a peroxidase de rábano (HRP)-Tagged estreptavidina (diluído 1:300-400) no mesmo buffer.</li>
	<li>Enxágüe culturas como descrito em 5,5.</li>
	<li>Enxague as culturas várias vezes com 0,1 M tampão Tris-HCl, pH 7,6 por 1 h.</li>
	<li>Incubar as culturas com 0, 3% de 3,4 ′-diaminobenzidina hidrocloreto (DAB) solução em 0,1 M Tris-HCl, pH 7,6.</li>
	<li>Adicionar 5-8 μL de 1% H2o2 e aguarde 10-15 min. Monitore o desenvolvimento de DAB um microscópio usando um objetivo de 4-10x.</li>
	<li>Pare a reacção removendo a solução DAB com tampão Tris-HCl 0,1 M, pH 7,6.</li>
	<li>Enxágüe as culturas em PBS por 30 min (várias mudanças).</li>
	<li>Monte os hidrogéis em lâminas de vidro usando suportes de montagem aquosos.</li>
	<li>Analise o comprimento e a distribuição dos axônios dentro do hidrogel usando o plug-in de análise Sholl ou com o plug-in neuritej para o software ImageJ30.</li>
</ol>

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<li>Eyre, D. R., Weis, M., Hudson, D. M., Wu, J. J., Kim, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+3-hydroxyproline+%283Hyp%29-rich+motif+marks+the+triple-helical+C+terminus+of+tendon+type+I+collagen%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A novel 3-hydroxyproline (3Hyp)-rich motif marks the triple-helical C terminus of tendon type I collagen.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (10), 7732-7736 (2011).</li>
<li>Garnotel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+blood+monocytes+interact+with+type+I+collagen+through+alpha+x+beta+2+integrin+%28CD11c-CD18%2C+gp150-95%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Human blood monocytes interact with type I collagen through alpha x beta 2 integrin (CD11c-CD18, gp150-95).</a> Journal of Immunology. 164 (11), 5928-5934 (2000).</li>
<li>Montolio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+semaphorin+3A+inhibitor+blocks+axonal+chemorepulsion+and+enhances+axon+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+and+Biology%22%5BJournal%5D)">A semaphorin 3A inhibitor blocks axonal chemorepulsion and enhances axon regeneration.</a> Chemistry and Biology. 16 (7), 691-701 (2009).</li>
<li>Garcia-Gareta, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+gels+and+the+%27Bornstein+legacy%27%3A+from+a+substrate+for+tissue+culture+to+cell+culture+systems+and+biomaterials+for+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Collagen gels and the 'Bornstein legacy': from a substrate for tissue culture to cell culture systems and biomaterials for tissue regeneration.</a> Experimental Dermatology. 23 (7), 473-474 (2014).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O crescimento de axônios em desenvolvimento é principalmente invasivo e inclui a degradação e a remodelação do ECM. Usando o procedimento aqui apresentado, os pesquisadores podem obter uma matriz 3-D homogênea formada pelo colágeno tipo I natural, em que os axônios (ou células) podem responder a um gradiente químico secretado por células geneticamente modificadas como eles fazem in vivo. Diferentes respostas axonais a gradientes de pistas atraentes ou inibitórias (proteínas, lipídios, etc.) podem ser facilmente comparada...

Axônios neuronais, terminando em cones de crescimento axonal, migram longas distâncias através da matriz extracelular (ECM) do embrião sobre caminhos específicos para atingir seus alvos adequados. O cone de crescimento é a porção distal do AXON e é especializado para sentir o ambiente físico e molecular da célula1,2. Do ponto de vista molecular, os cones de crescimento são guiados por pelo menos quatro mecanismos moleculares diferentes: atração de contato, quimioatração, repulsão de contato e chemorepulsion desencadeada por diferentes pistas de orientação axonal3,4 , 5. º , 6. os processos mediados por contato podem ser parcialmente monitorados em culturas bidimensionais (2D) em substratos micropadronizados (por exemplo, com listras7,8 ou manchas9 contendo as moléculas). No entanto, axônios podem navegar para o seu alvo de forma não-diffusiva, sentindo várias moléculas atraentes e repulsivas de células guidepost no ambiente4,5,10. Aqui, nós descrevemos um método fácil da cultura 3-D para verific se uma molécula secretado induz efeitos chemorepulsive ou chemoattractive em axônios tornando-se.
Os primeiros estudos objetivaram determinar os efeitos das pistas de orientação AXON utilizadas culturas explantes em matrizes tridimensionais (3-D) para gerar gradientes simulando in vivo as condições11,12. Essa abordagem, juntamente com experimentos in vivo, permitiu a identificação de quatro grandes famílias de pistas de orientação: netrins, fendas, semaphorinas e ephrins4,5,6. Essas pistas moleculares e outros fatores13 são integrados pelos crescentes axônios, desencadeando a dinâmica dos complexos de adesão e as forças mecânicas transacionadoras através do citoesqueleto14,15,16. Para gerar gradientes moleculares em culturas 3-D para navegação axonal, pesquisadores pioneiros usaram substratos de coágulo plasmático17, que também foi utilizado para preparações organotípicas de fatia18. No entanto, em 1958, foi relatado um novo protocolo para a geração de hidrogéis de colágeno 3-D para estudar com os dispositivos da Maximow19, uma plataforma de cultura, utilizada em vários estudos adequados para observações microscópicas20. Outro estudo pioneiro relatou o gel de colágeno como uma ferramenta para incorporar fibroblastos humanos para estudar a diferenciação de fibroblastos em miofibroblastos em processos de cicatrização de feridas21. Paralelamente, Lumsden e Davies aplicaram colágeno da derme bovina para analisar o efeito putativo do fator de crescimento do nervo (NGF) na orientação das fibras nervosas sensoriais22. Com o desenvolvimento de novas plataformas de cultura (por exemplo, placas multipoços) por diferentes empresas e laboratórios, as culturas colágenas foram adaptadas a esses novos dispositivos6,23,24,25 ,26. Paralelamente, um extrato de material de ECM derivado da linhagem de células tumorais de Engelbreth-Holm-Swarm foi disponibilizado comercialmente para ampliar esses estudos27.
Recentemente, vários protocolos foram desenvolvidos para gerar gradientes moleculares com papéis putativos na orientação do AXON usando hidrogéis 3-D (por exemplo, colágeno, fibrina, etc.) 28. Alternativamente, a molécula candidata pode ser imobilizada em diferentes concentrações em uma matriz porosa (por exemplo, NGF29) ou gerada pela cultura em uma pequena região dos agregados de células hidrogel 3-D secretando a molécula para gerar um radial gradiente4,23,24,25,26. A última possibilidade será explicada neste protocolo.
O procedimento apresentado aqui é um método fácil, rápido e altamente reprodutível baseado na análise do crescimento axonal em culturas 3-D do hidrogel do cérebro embrionário do rato. Em comparação com outros métodos, o protocolo é bem adequado para pesquisadores não treinados e pode ser totalmente desenvolvido após um treinamento curto (1-2 semanas). Neste protocolo, Nós isolamos primeiramente o colagénio das caudas adultas do rato para gerar mais matrizes 3-D em que os agregados genetically-modificados da pilha são cultivados na frente do tecido neuronal embrionário. Estes agregados de células formam gradientes químicos radiais de uma molécula candidata que provoca uma resposta para os axônios crescentes. Finalmente, a avaliação dos efeitos da molécula em axônios crescentes pode ser facilmente realizada usando uma microscopia de contraste de fase ou, alternativamente, métodos imunocitróxicos.

<table><tbody><tr><td><forte>Material</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3,3&prime;-Diaminobenzidina tetracloridrato 10 mg comprimidos (DAB)</td><td>Sigma</td><td>D5905</td><td></td></tr><tr><td>Ratos Sprague-Dawley adultos (8 a 9 semanas de idade)&nbsp;</td><td>Criffa-Credo, Lyon, França</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Complexo Avidina-biotina-peroxidase (ABC)</td><td>Vector Labs</td><td>PK-4000</td><td></td></tr><tr><td>B27 suplemento sem soro 50x&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Kit de ensaio de proteína de ácido bicinchonínico (BCA)</td><td>Pierce</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>vetores de plasmídeo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>cDNA Linhas celulares COS1</td><td>ATTC</td><td>CRL-1570</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-glicose</td><td>Sigma</td><td>16325</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-glicose (solução a 45% em água) para meio neurobasal completo</td><td>Sigma</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>D-MEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium 1x) para meio de cultura COS1</td><td>Invitrogen</td><td>41966-029</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s solução salina tamponada com fosfato 10x (sem Ca2+ e Mg2++) (D-PBS) para culturas</td><td>Invitrogen</td><td>14200</td><td></td></tr><tr><td>Etanol&nbsp;</td><td>merck</td><td>108543</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilenodiaminotetracético sal dihidratado dissódico (EDTA)</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Mídia de montagem de fluorescência (por exemplo, Fluoromount-G ou similar)</td><td>Ciências de Microscopia Eletrônica (EMS)</td><td>17984-25</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina em pó&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético glacial (Panreac, cat. no. 211008)</td><td>Panreac</td><td>211008</td><td></td></tr><tr><td>Hank' s solução salina balanceada&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>24020083</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino inativado pelo calor&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>10108-165</td><td></td></tr><tr><td>Soro de cavalo inativado por calor&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>26050-088</td><td></td></tr><tr><td>Peróxido de hidrogênio (H2O2, 32 a 33% em água)</td><td>Sigma</td><td>316989</td><td></td></tr><tr><td>solução de L-glutamina 200 mM (100x) para meio neurobasal completo e COS1</td><td>Invitrogen</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>Camundongos fêmeas grávidas (dia embrionário 12,5 a 16,5; E12.5-16.5)&nbsp;</td><td>Criffa-Credo, Lyon, França</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Modified Minimum Essential Medium Eagle (MEM)</td><td>Invitrogen</td><td>11012-044</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonal contra classe III &beta;-tubulina (clone TUJ-1)</td><td>Biolegend</td><td>801201</td><td></td></tr><tr><td>N-2 suplemento 100x&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Meio neurobasal&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Merck</td><td>1,040,051,000</td><td></td></tr><tr><td>Solução de penicilina/estreptomicina 100x&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15140-22</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato 10x (PBS) para imunocitoquímica</td><td>Invitrogen</td><td>AM9624</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo secundário: cavalo biotinilado anti-camundongo&nbsp;</td><td>Vector Labs</td><td>BA-2000</td><td></td></tr><tr><td>Meio sem soro (Opti-MEM)</td><td>Invitrogen</td><td>11058-021</td><td></td></tr><tr><td>Azida sódica&nbsp;</td><td>Panreac</td><td>162712</td><td></td></tr><tr><td>Solução de bicarbonato de sódio 7,5%&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>25080-094</td><td></td></tr><tr><td>Grau de cultura estéril H2O&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>W3500</td><td></td></tr><tr><td>TritonTM X-100&nbsp;</td><td>Base Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Trizma&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (Tripsina (0,05% (peso/vol) com EDTA (1x)</td><td>Invitrogen</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td><forte>Equipamento</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 tesoura curva grande e 1 pequena para dissecção&nbsp;</td><td>Ferramentas finas Instrumentos ou tubos de centrífuga cônicos similares</td><td></td><td></td></tr><tr><td>de 1,5 mL&nbsp;</td><td>Eppendorf ou tubos de centrífuga cônicos similares</td><td></td><td></td></tr><tr><td>de 15 mL&nbsp;</td><td>Corning ou similar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 hemostatos&nbsp; &nbsp;</td><td>Ferramentas finas Instrumentos ou similares</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 pequenas tesouras de dissecação retas</td><td>Ferramentas finas Instrumentos ou similares</td> Tubos de centrífuga de <td></td><td></td></tr><tr><td>200 mL para centrifugação</td><td>Nalgene ou similar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Frascos</td><td></td><td></td><td></td>cônicos de vidro estéreis de 200</tr><tr><td>mL Copo</td><td></td><td></td><td></td>de vidro de 2 L</tr><tr><td>Placas de cultura de 4 e 6 poços&nbsp;</td><td>Nunc</td><td>176740 e 140675</td><td></td></tr><tr><td>Bombas de pipeta automáticas e pipetas plásticas estéreis descartáveis de 10 mL e 25 mL contendo filtro.</td><td>Gilson, Brand, Eppendorf ou similar&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetas automáticas, ponteiras de filtro estéreis e ponteiras estéreis atuais</td><td>Gilson, Eppendorf ou similar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga de bancada com rotor fixo angular&nbsp;</td><td>Eppendorf, Beckman Coulter ou similar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga refrigerada de bancada com rotor de balde oscilante (com adaptadores de tubo de 1,5, 15 e 50 mL)</td><td>Eppendorf, Beckman Coulter ou similar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de cultura de células a 37 &graus; C, 5% CO2 e 95% ar</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubo de diálise membrana de celulose</td><td>Sigma</td><td>D9402</td><td></td></tr><tr><td>Fechamentos de tubo de diálise&nbsp;</td><td>Pipetas</td><td></td> de vidro descartáveis Sigma Z37101-7 <td></td></tr><tr><td>Microscópio</td> de dissecação com óptica de campo escuro&nbsp;<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Olympus SZ51 ou similar&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga refrigerada de alta velocidade Beckman Coulter ou similar com rotor</td><td></td><td></td><td></td>fixo angular</tr><tr><td>Capuz</td><td></td><td></td><td></td>de fluxo laminar</tr><tr><td>Grande 100 mm, 60 mm e pequeno 35 mm &Oslash; placas de cultura de células&nbsp;</td><td>Nunc</td><td>&nbsp; 150679, 150288 e 150318, respectivamente</td><td></td></tr><tr><td>Agitador magnético e barras de rotação magnéticas</td><td>IKA ou similar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cortador de tecidos McIlwain</td><td>Mickle Laboratory Engineering</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Um par de pinças retas finas e um par de pinças curvas&nbsp;</td><td>Ferramentas finas Instrumentos ou similares</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de barbear para o picador</td><td></td><td></td><td></td>de tecidos</tr><tr><td>Bisturis (número 15 e 11)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dois pares de espátulas finas para transferência de colágeno e pedaços de tecido</td><td>Ferramentas finas Instrumentos ou similares</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

geração de hidrogéis com base em colágeno 3-d para analisar o crescimento e o comportamento axonal durante o desenvolvimento do sistema nervoso

Generation of 3-D Collagen-based Hydrogels to Analyze Axonal Growth and Behavior During Nervous System Development

Este protocolo usa o tipo natural mim colagénio para gerar o hidrogel tridimensional (3-D) para monitorar e analisar o crescimento axonal. O protocolo está centrado na cultura de pequenos pedaços de cérebros de roedores embrionários ou precoces no interior de um hidrogel 3-D formado pelo colágeno do tipo I derivado do tendão da cauda de rato com porosidade específica. Peças de tecido são cultivadas dentro do hidrogel e confrontados com fragmentos cerebrais específicos ou agregados celulares geneticamente modificados para produzir e secretar moléculas adequadas para a criação de um gradiente dentro da matriz porosa. As etapas deste protocolo são simples e reprodutíveis mas incluem etapas críticas a ser consideradas com cuidado durante seu desenvolvimento. Além disso, o comportamento de axônios crescentes pode ser monitorado e analisado diretamente usando um microscópio de fase-contraste ou um microscópio de fluorescência mono/multifóton após a fixação por métodos Immunocytochemical.

Aqui, nós apresentamos uma metodologia extensamente acessível para estudar o crescimento axonal em culturas do colagénio do hidrogel 3-D do sistema nervoso embrionário do rato. Para este fim, Nós isolamos o colagénio das caudas adultas do rato para gerar as matrizes 3-D em que nós cultivou agregados genetically-modificados da pilha que expressam netrin-1 ou Sema3E confrontado com o tecido neuronal embrionário (por exemplo, região do CA do hipocampo). Estes agregados da pilha deram forma a um inclinação radialmente distri...

Aqui, fornecemos um método para analisar o comportamento dos axônios crescentes em matrizes 3D, imitando seu desenvolvimento natural.

Geração de hidrogéis com base em colágeno 3-D para analisar o crescimento e o comportamento axonal durante o desenvolvimento do sistema nervoso

This protocol uses natural type I collagen to generate three-dimensional (3-D) hydrogel for monitoring and analyzing the axonal growth. The protocol is ...

Este método é útil para analisar o papel de algumas moléculas na orientação axonal e migração neuronal durante o desenvolvimento do sistema neurológico. A principal vantagem dessa técnica é que a análise dos resultados é rápida e simples e não requer softwares complexos, o que implicaria muito treinamento para pesquisadores. Demonstrando o procedimento estará Mirian Segura-Feliu, técnica do nosso laboratório e eu.Para iniciar a placa 200.000 células COS-1 em placas de Petri de 35 milímetros e incubar com meio de cultura completa em uma incubadora de cultura celular, a fim de ler 70 a 80% de confluência durante a noite. No dia seguinte, transfeccionar células COS-1 com o DNA codificando a molécula candidata usando o método de transfecção à base de lipososom. Misture primeiro 250 microliters de meio livre de soro e dna de um a 2 microgramas em um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro e incubar à temperatura ambiente por cinco minutos.Para preparar um tubo lipossômico, adicione 240 microliters do meio sem soro e 10 microliters de reagente de transfecção liposômica, e incubar à temperatura ambiente por cinco minutos. Após a incubação, adicione o conteúdo do tubo de DNA ao tubo lipsômico. Misture delicadamente e incubar à temperatura ambiente por 15 minutos.Substitua o meio nas células cultivadas por 1,5 mililitros do meio livre de soro. Adicione a mistura de lipossomos de DNA lentamente e solte sábia às células. Incubar na incubadora de cultura celular de dióxido de carbono por três horas.Após a incubação concluída, substitua o meio pelo meio de cultura completa e incubar durante a noite na incubadora. No dia seguinte, enxágue as células com PBS molar 0,1 molar Dulbecco. Adicione 800 microliters trypsin EDTA por cada prato e incubar por cinco a 15 minutos na incubadora de dióxido de carbono.Colete células separadas com dois mililitros de cultura completa em um tubo de centrífuga de 15 mililitros e adicione 10 mililitros do mesmo meio. Centrifugar as células a 4 graus celsius a 130 vezes g durante cinco minutos. Remova o supernatante e preserve a pelota contendo células COS-1 no gelo.Depois de preparar a mistura de trabalho de colágeno, adicione 100 a 150 microliters da mistura de colágeno à pelota das células transfeinadas e misture suavemente por pipetar para cima e para baixo. Espalhe de 45 a 50 microliters de mistura de pelotas de célula de colágeno em uma placa de Petri de 35 milímetros para formar uma banda uniforme de células de colágeno, aproximadamente de um a 1,5 centímetros de comprimento. Coloque o prato na incubadora a 37 graus celsius e 5% de dióxido de carbono até que a gelação seja observada.Prepare uma segunda tira contendo células de controle em um segundo prato de cultura e coloque-a na incubadora. Quando a gelação estiver concluída, adicione três a quatro mililitros de 37 graus celsius aquecidos cos-1 meio de cultura completa para cada prato contendo as tiras de célula de colágeno gelada e colocá-los na incubadora. Use um bisturi fino ou um helicóptero de tecido para cortar as tiras das células de colágeno para gerar pequenos pedaços quadrados, de 400 a 500 micrômetros de comprimento.Transfira todas as seções da mesma condição de transfecção para uma placa de Petri contendo de três a 3,5 mililitros de mídia de cultura neuronal. Verifique em um microscópio dissecando a qualidade das peças e coloque os pratos na incubadora. Use uma tesoura para cortar chifres de embrião no dia embrionário 16.5 da cavidade abdominal de um rato fêmea grávida sacrificado e colocá-los em uma grande placa de Petri contendo tampão HBSSg frio.Coloque o prato na capa de fluxo laminar e use fórceps retos para extrair os embriões e colocá-los em um novo prato contendo HBBSg frio. Com pequenas fórceps, remova a pele e, em seguida, com fórceps curvados e retos, disseque cuidadosamente o cérebro e coloque em um prato contendo HBSSg frio. Sob um microscópio dissecando, usando um bisturi ou uma tesoura fina, corte o cérebro ao meio ao longo da linha média para separar ambos os hemisférios.Em seguida, remova o diencephalon e com fórceps finos, remova meninges e vasos sanguíneos dos pedaços cerebrais. Use 100% de etanol para limpar todas as partes do helicóptero de tecido, especialmente a placa de corte PTFE e a lâmina de barbear e mantenha o helicóptero de tecido no capô do fluxo laminar sob iluminação UV por 15 minutos. Transfira cada peça de tecido para a placa de corte do helicóptero de tecido.Depois que o tecido for cortado, transfira as peças das placas de Petri de 35 milímetros preenchidas com três a quatro mililitros de NCM completo. Usando agulhas de tungstênio finas, finalize a dissecção do tecido em NCM completo. Verifique a qualidade das fatias obtidas sob o microscópio dissecando, certificando-se de que as camadas são claramente identificáveis na óptica do campo escuro e disseque a região de interesse com agulhas de tungstênio.Mantenha as peças de boa qualidade em meio NCM completo na incubadora de dióxido de carbono. A demonstração visual é fundamental nas etapas relacionadas à preparação das coculturas que facilitam a compreensão do processo. Coloque várias placas de cultura estéreis no capô de fluxo laminar e prepare uma mistura de trabalho de colágeno como anteriormente.Adicione 15 a 20 microliters da mistura de hidrogel no fundo de cada poço para produzir uma base circular de colágeno. Coloque os pratos na incubadora até que a gelação completa seja observada. E verifique a qualidade do colágeno gelado.Com uma pipeta, transfira um pequeno pedaço de célula COS-1 agregado para a base de hidrogel, em seguida, use uma pipeta para colocar uma peça de tecido na mesma base, perto do pedaço de células agregado a uma distância de um tamanho de explant. Depois de preparar uma nova mistura de colágeno de trabalho no gelo, gentilmente pipeta 15 a 20 microliters desta nova mistura para cobrir a explanta e o agregado celular, fazendo um sanduíche como a cultura hidrogel. Use uma agulha de tungstênio fina para reorientar a explanta para que ela fique de frente para o agregado celular de 500 a 600 micrômetros.Devolva a placa à incubadora até que a gelação seja observada e adicione 0,5 mililitros de NCM completo suplementado com suplemento B27 de 2%e mantenha culturas por 36 a 48 horas na incubadora. Quando os axônios hipocampais foram confrontados com Netrin-1, eles cresceram preferencialmente para a fonte de Netrin-1, indicando que Netrin-1 age como uma molécula atraente para esses axônios. Na condição de controle, ou transfecção simulada, todos os axônios cresceram radialmente, sem qualquer preferência direcional.Quando os axônios hipocampais foram confrontados com células secretas Sema3E, a maioria delas cresceu em frente ao agregado celular, indicando que o Sema3E age como uma molécula repulsiva de quimioterapia para esses axônios. Esta representação esquemática do método de resposta axonal e quantificação mostra que, em condições de controle, os axônios foram igualmente distribuídos em quadrantes proximais e distais, mostrados com crescimento radial. Isso indicou uma razão distal proximal ou DP de um.Quando as explanações apresentaram aumento do número de axônios no quadrante proximal em comparação com o distal, indicando a atração da quimioterapia, a razão de DP foi maior que um. Quando o número de axônios foi maior no quadrante distal do que no proximal, indicando repulsão de quimioterapia, a razão de DP foi menor que um. Seguindo esse método, os pesquisadores podem obter informações essenciais sobre o papel de algumas moléculas durante o desenvolvimento neuronal, o que nos permite estabelecer um ponto de partida para explorar melhor as funções.Embora essa técnica seja útil no desenvolvimento neuronal como esta é, ela também poderia ser aplicada na triagem farmacológica, angiogênese e engenharia de tecidos como estratégias.

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Research

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Neuroscience

Neurociência

É descrito um método para a preparação de uma matriz de 3-dimensional constituído por colagénio do tipo I e fibroblastos humanos primários. Este gel organotípica serve como um substrato útil para avaliar a migração celular invasiva porque imita características básicas de estroma de tecido e é susceptível de muitas formas de microscopia.

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Demonstramos como dissecar e cultura pinto gânglio statoacoustic E4 e E6 explantes medula espinhal. Explantes são cultivados sob condições sem soro em gel de colágeno 3D por 24 horas. Neuritos resposta é testado com o meio do fator de crescimento suplementado com proteína e revestido contas.

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Este vídeo demonstra um método para gerar andaimes tridimensionais de astrócitos dentro de microcolunas de hidrogel. O interior das microcolunas é revestido com colágeno. São introduzidos astrócitos, que aderem ao colágeno e, com posterior incubação, se automontam em um andaime tridimensional.

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Neste trabalho, apresentamos uma técnica para a fabricação rápida de tecidos vasculares vivos por cultura direta de colágeno, células musculares lisas e células endoteliais. Além disso, um novo protocolo para a caracterização mecânica de tecidos vasculares projetados é descrito.

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A percepção das ações complexas do cérebro requer ferramentas avançadas de pesquisa. Aqui, demonstramos um novo modelo de engenharia 3D baseado em colágeno de seda de tecido neural semelhante à arquitetura do cérebro. O modelo pode ser usado para estudar a montagem da rede neuronal, orientação axonal, interações célula-célula e atividade elétrica.

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O colágeno é um componente central da ECM, e fornece pistas essenciais para diversos processos celulares que vão desde a migração para diferenciação e proliferação. Fornecidas aqui é um protocolo para a incorporação de células dentro de hidrogéis de colágeno 3D, e uma técnica mais avançada para a geração de matrizes de colágeno randomizados ou alinhadas utilizando microcanais PDMS.

Preparação de 3D colágeno Géis e microcanais para o estudo das interações 3D<em&gt; In Vivo</em

Vamos mostrar o desenvolvimento de feixes Self montados, tridimensionais do somata hamartomas alinhado longitudinalmente e processos dentro de um invólucro de biomaterial romance. Estas engenharia "vida andaimes", exibindo o diâmetro do mícron-escala ainda estendendo centímetros de comprimento, pode servir como teste-camas para estudar os mecanismos do desenvolvimento neurológico ou facilitar Epilepsias pelo diretor de migração neuronal e/ou axonal Pathfinding.

Engenharia de tecidos tridimensionais alinhado Astrocyte redes para recapitular os mecanismos do desenvolvimento e facilitar a regeneração do sistema nervoso

Neste documento, apresentamos um protocolo para a cultura 3D do rato as células da glia derivado do cérebro, incluindo astrócitos, oligodendrócitos e micróglia. Vamos demonstrar a cultura de células primárias, síntese de hidrogel de ácido hialurônico methacrylated (HAMA), encapsulamento HAMAphoto-polimerização e celular e amostra de processamento de imagem microscópica confocal e varredura de elétrons.

Melhorado o hidrogel 3D culturas de células gliais primárias para In Vitro modelagem de Neuroinflammation

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Geração de hidrogéis com base em colágeno 3-D para analisar o crescimento e o comportamento axonal durante o desenvolvimento do sistema nervoso (Vídeo) | JoVE Journal

Geração de hidrogéis com base em colágeno 3-D para analisar o crescimento e o comportamento axonal durante o desenvolvimento do sistema nervoso

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