Name: Combinando análise de SDS-PAGE não redutora e reticulação química para detectar complexos multiméricos estabilizados por ligações de dissulfeto em células de mamíferos na cultura (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-02T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: Aprenda a analisar complexos proteicos multiméricos estabilizados por ligações dissulfeto em células U-2 OS usando SDS-PAGE não redutora combinada com reticulação química. Este método rápido e econômico auxilia pesquisadores em bioquímica celular.

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Agradecemos imensamente os esforços desenvolvidos pelo Dr. Jennifer Fischer para a purificação do anticorpo policlonal dUTPase e Kerri Ciccaglione para todos os seus esforços para ajudar a editar este manuscrito. Esta pesquisa foi parcialmente apoiada por uma subvenção da Fundação de saúde de Nova Jersey (Grant #PC 11-18).

1. bloqueando os resíduos de cisteína livre usando Iodoacetamida
<ol><li>Cresça as pilhas U-2 do ósmio em um prato de 6 cm2 a 50%-a confluência de 60% no meio essencial mínimo com glicose elevada que contem o soro bovino fetal de 10% e o piruvato de sódio de 1% em 37 ° c em 5% co2.</li>
	<li>Fazer um estoque fresco de 10 mM iodoacetamida apenas antes de usar, em seguida, descartar qualquer reagente não utilizado.</li>
	<li>Adicione a iodoacetamida de concentração final de 0,1 mM diretamente nos meios de cultura celular. Agitar suavemente o prato à temperatura ambiente durante 2 min.</li>
</ol>2. colhendo as células
<ol><li>Aspirar a mídia das células.</li>
	<li>Lave as células com 5 mL de soro fisiológico com tampão fosfato frio (PBS) três vezes. Aspirar a solução de lavagem PBS final e adicionar 1 mL de PBS frio.</li>
	<li>Raspar as células da parte inferior do prato usando um raspador de células. Usando uma pipeta de 1 mL elaborar o PBS e suspensão celular e dispensar todo o líquido em um 1,5 mL tubo de microcentrífuga.</li>
	<li>Gire as pilhas em 7.500 x g por três minutos a 4 ° c. Aspirar o PBS, deixando o pellet celular para trás. A pelota da pilha pode ser armazenada em-80 ° c até o processamento</li>
</ol>3. extração de proteína
<ol><li>Prepare 100 μL de um tampão de Lise 1x diluído em ddH2O (ver tabela de materiais). Adicionar fluoreto de fenilmetilsulfonila (PMSF) imediatamente antes de usar para uma concentração final de 1 mM.</li>
	<li>Adicionar 50 μL do tampão de Lise 1x diretamente à pelota celular e suspender. Incubar isto no gelo durante 5 min.</li>
	<li>SONICATE para 8 s usando o modo de pulso constante em 40% (ver tabela de materiais para sonicator; ajustar conforme necessário para sonicators diferentes), mantendo o extrato no gelo.</li>
	<li>Gire o extrato a 4 ° c por 5 min em 16.000 x g. O sobrenadante é a fração protéica solúvel. A análise de Bradford pode ser executada para determinar a concentração da proteína se desejada.</li>
</ol>4. preparação da amostra
<ol><li>Tomar 10 μL do extrato de proteína solúvel e adicionar 10 μL de um tampão de amostra SDS de Laemmli 1x (4% SDS, 20% de glicerol, 0, 4% de bromofenol azul e 0,125 M Tris-HCl, pH 6,8). Não adicione nenhum reagente redutor.</li>
	<li>Mantenha as amostras no gelo se a análise SDS PAGE será realizada naquele dia; para o armazenamento a longo prazo,-20 ° c é apropriado. Logo antes de executar o gel, aqueça a amostra por 5 min a 85 ° c.</li>
</ol>5. in vivo formaldeído cross-linking de proteínas endógenas em células U-2 OS
<ol><li>Aumente as células U-2 do sistema operacional em um 175 cm2 frasco para 70% – 80% de confluência (ver seção 1).</li>
	<li>
Realize a reação de reticulação de formaldeído
	<ol>
<li>Em uma capa de fumaça, alíquota uma solução de formaldeído 37% comprado de fontes comerciais. Adicionar o fixador de formaldeído diretamente ao meio para uma concentração final de 1% e incubar à temperatura ambiente com agitação suave por 15 min.</li>
		<li>Para saciar a reação, adicionar 1,25 M glicina a uma concentração final de 0,125 M e incubar à temperatura ambiente com agitação suave em um roqueiro por 5 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lave as células com 5 mL de PBS frio três vezes. Aspirar a solução de lavagem PBS final e adicionar 10 mL de PBS. Raspar as células da parte inferior do balão usando um raspador de células.</li>
	<li>Usando uma pipeta de 10 mL, desenhe o PBS e a suspensão celular e dispense todo o líquido em um tubo de centrífuga cônico de 15 mL. Gire as células em 500 x g por 2 min a 4 ° c. Aspirar o PBS, deixando o pellet celular para trás.</li>
</ol>6. fraccionamento dos núcleos
<ol><li>Prepare 10 mL de tampão de homogeneização: 0,25 M sacarose, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES e 0,5% BSA em pH 7,4. Adicione PMSF imediatamente antes de usar para uma concentração final de 1 mM e 3mL de amortecedor de suspensão de núcleos (0,1% Triton X-100 em PBS).</li>
	<li>Adicione o amortecedor da homogeneização de 5 mL diretamente à pelota da pilha e suspenda completamente. Centrifugue a suspensão em 500 x g por 2 min a 4 ° c e descarte o sobrenadante.</li>
	<li>Suspenda a pelota em 5 mL de tampão de homogeneização. Use um homogeneizador apertado-encaixe do vidro-Teflon, dounce Homogeneize pilhas em 10 cursos/500 rpm.</li>
	<li>Centrifugue a suspensão a 1.500 x g durante 10 min a 4 ° c e, em seguida, descarte o sobrenadante. Nota: Use o sobrenadante para o isolamento de mitmitoas por centrifugação em 10.000 x g por 10 min.</li>
	<li>Suspenda o pellet em 1 mL núcleos amortecedor de suspensão e incubar no gelo por 10 min.</li>
	<li>Centrifugue em 600 x g por 10 min. descarte o sobrenadante.</li>
	<li>Suspenda o pellet em 1 mL núcleos amortecedor de suspensão e centrífuga novamente. Descarte o sobrenadante. A pelota final será núcleos isolados.</li>
</ol>7. extração de proteína
<ol><li>Repita a seção 4, exceto adicionando 25 μL do tampão da lise 1x diretamente ao pellet da pilha que suspende então.</li>
</ol>8. preparação da amostra
<ol><li>Prepare duas amostras para SDS-PAGE tomando 10 μL cada um do extrato solúvel da proteína e adicione 10 μL do tampão da SDS-amostra de 2x Laemmli e 1 μL do 2-mercaptoethanol (BME).</li>
	<li>Aqueça uma amostra por 5 min a 37 ° c e a segunda amostra por 15 min a 98 ° c para inverter a ligação cruzada de formaldeído.</li>
</ol>9. análise SDS-PAGE
<ol><li>Prepare 1 L de tampão running da Tris-glicina 1x (25 milímetros Tris, 192 milímetros de Glycine, 0,1% (w/v) SDS).</li>
	<li>
Configure o dispositivo de execução SDS-PAGE. Nota: este protocolo utiliza um 16% pré-moldado TGX SDS-PAGE. De notar, qualquer percentagem de gel pode ser usado.<ol>
<li>Por o protocolo do fabricante, abra o pacote que o gel é armazenado dentro e remova a gaveta.</li>
		<li>Retire o pente que está alinhando os poços e a fita da parte inferior da gaveta.</li>
		<li>Coloque o gel no aparelho em funcionamento.</li>
		<li>Encha a câmara com o tampão de funcionamento 1x até que os poços estejam submersos no líquido. Usando um Pipet plástico, enxague para fora os poços com o amortecedor running.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloque as amostras no gel juntamente com 10 μL de marcador padrão pré-esforcido.</li>
	<li>Execute o gel em 200 V até que a parte dianteira da tintura esteja aproximadamente 1 cm da parte inferior do gel.</li>
</ol>10. borrão ocidental
<ol><li>Preparar 1 L de tampão de transferência 1x (25 mM Tris, 192 mM Glycine, 20% metanol) e conservar a 4 ° c até ao seu uso.</li>
	<li>Retire cuidadosamente o gel e abra a gaveta. Usando uma navalha, cuidadosamente cortar e descartar o gel de empilhamento. Pegue o gel usando um canto e coloque-o em uma bandeja com tampão de transferência, permitindo que ele balanç suavemente por 5 min.</li>
	<li>Enquanto o gel está balançando, coloque um bloco de gelo (armazenado em-20 ° c) no tanque de transferência e adicione o buffer de transferência para 3/4 completo.</li>
	<li>Molhe a membrana do fluoreto do polivinilideno (PVDF) mergulhando o no metanol de 100% para 30 s.</li>
	<li>Uma vez que os 5 min passaram, prepare-se para configurar a transferência em uma bandeja com buffer de transferência. O buffer de transferência deve ser suficiente para submergir completamente a mancha. Configurar a transferência blot da seguinte forma: na parte inferior, na parte inferior do suporte da gaveta (preto); Então uma esponja grossa, papel de blotting grosso extra, o gel do poliacrilamida, uma membrana de PVDF, papel de blotting grosso extra, e uma esponja grossa; em seguida, finalmente, a parte superior do suporte da gaveta (branco) na parte superior.</li>
	<li>Trave a gaveta e coloc a unidade no tanque de transferência com a membrana de PVDF para o ânodo positivo e o gel para o negativo. Cubra a unidade com o buffer de transferência até que sua transferência esteja completamente submersa.</li>
	<li>Coloque a unidade no topo de uma placa de agitação. Adicione uma barra de agitação para a unidade e começar a mexer em 125 RPM.</li>
	<li>Executar em 100 V por 60 min.</li>
	<li>Enquanto a transferência está sendo executada, prepare uma solução de 5% de leite em pó dissolvido em soro fisiológico com tampão Tris, com Tween-20, pH 7,5 (TBST).</li>
	<li>Desmontar a unidade e remover a membrana, observando que lado estava em contato com o gel; Assegure-se de que este lado permaneça na bandeja para as etapas restantes.</li>
	<li>Mergulhe a membrana por 2 min em salina Tris-tamponada (TBS) seguida bloqueando a membrana incubando em 5 mL da solução de leite-TBST de 5% por 30 minutos na temperatura ambiente.</li>
	<li>Substitua o leite por uma solução fresca de 4 mL de leite-TBST a 5% e adicione o anticorpo primário à diluição adequada (neste caso, a nossa diluição é 1:2000 para o anticorpo dUTPase) e incubar durante a noite com balanço suave a 4 ° c.</li>
	<li>No dia seguinte, retire a mancha do balancim de 4 ° c para um balancim de temperatura ambiente, descartando a solução de anticorpos primários.</li>
	<li>Faça três lavagens rápidas com TBST, usando o suficiente líquido para submergir completamente o borrão, seguido por 3 lavagens, 5 min cada, balançando lentamente.</li>
	<li>Após a última lavagem, adicionar 5 mL da solução de leite-TBST de 5% e agitar o Borrão por 15 minutos e depois descartar.</li>
	<li>Adicionar anticorpo secundário diluído em 5% de leite-TBST na concentração desejada. (Neste caso, 1:5000 diluição do anti-coelho de cabra diluído em 5 mL de solução de 5% de leite-TBST)</li>
	<li>Incubar à temperatura ambiente, balançando por 1 h, em seguida, descartar a solução.</li>
	<li>Faça três lavagens rápidas com TBST seguido por 3 lavagens, 5 min cada, balançando lentamente, em seguida, descartar a lavagem final e adicionar 5 mL de TBS.</li>
	<li>Prepare uma mistura 1:1 de soluções de detecção quimioluminescente ECL (1 mL de cada reagente para um volume final de 2 mL) e adicione-a diretamente à mancha incubando por 1 min.</li>
	<li>Retire a membrana usando pinças e DAB o canto com uma limpeza de laboratório, removendo qualquer solução em excesso. Coloc a membrana no envoltório do psiquiatra e coloc o lado da proteína acima em uma gaveta do raio x.</li>
	<li>Expor a membrana de filme de raios-x. O tempo de exposição variará.</li>
</ol>

<ol><li>Klomsiri, C., Karplus, P. A., Poole, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cysteine-based+redox+switches+in+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+and+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Cysteine-based redox switches in enzymes.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 14 (6), 1065-1077 (2011).</li>
<li>Antelmann, H., Helmann, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiol-based+redox+switches+and+gene+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+and+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Thiol-based redox switches and gene regulation.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 14 (6), 1049-1063 (2011).</li>
<li>Brandes, N., Schmitt, S., Jakob, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiol-based+redox+switches+in+eukaryotic+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+and+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Thiol-based redox switches in eukaryotic proteins.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 11 (5), 997-1014 (2009).</li>
<li>Groitl, B., Jakob, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiol-based+redox+switches%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Thiol-based redox switches.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1844 (8), 1335-1343 (2014).</li>
<li>Stern, B. D., Wilson, M., Jagus, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+nonreducing+SDS-PAGE+for+monitoring+renaturation+of+recombinant+protein+synthesis+initiation+factor%2C+eIF-4+alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">Use of nonreducing SDS-PAGE for monitoring renaturation of recombinant protein synthesis initiation factor, eIF-4 alpha.</a> Protein Expression and Purification. 4 (4), 320-327 (1993).</li>
<li>Gorman, J. J., Wallis, T. P., Pitt, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+disulfide+bond+determination+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrometry+Reviews%22%5BJournal%5D)">Protein disulfide bond determination by mass spectrometry.</a> Mass Spectrometry Reviews. 21 (3), 183-216 (2002).</li>
<li>Li, X., Yang, X., Hoang, V., Liu, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Protein+Disulfide+Linkages+by+MS+In-Source+Dissociation+Comparing+to+CID+and+ETD+Tandem+MS%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+for+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Characterization of Protein Disulfide Linkages by MS In-Source Dissociation Comparing to CID and ETD Tandem MS.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. , (2018).</li>
<li>Kelly, S. M., Price, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+circular+dichroism+in+the+investigation+of+protein+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protein+and+Peptide+Science%22%5BJournal%5D)">The use of circular dichroism in the investigation of protein structure and function.</a> Current Protein and Peptide Science. 1 (4), 349-384 (2000).</li>
<li>Klockenbusch, C., Kast, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+formaldehyde+cross-linking+for+protein+interaction+analysis+of+non-tagged+integrin+beta1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedicine+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Optimization of formaldehyde cross-linking for protein interaction analysis of non-tagged integrin beta1.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2010, 927585(2010).</li>
<li>Gavrilov, A., Razin, S. V., Cavalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+formaldehyde+cross-linking%3A+it+is+time+for+black+box+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Functional+Genomics%22%5BJournal%5D)">In vivo formaldehyde cross-linking: it is time for black box analysis.</a> Briefings in Functional Genomics. 14 (2), 163-165 (2015).</li>
<li>Rotoli, S. M., Jones, J. L., Caradonna, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cysteine+residues+contribute+to+the+dimerization+and+enzymatic+activity+of+human+nuclear+dUTP+nucleotidohydrolase+%28nDut%29%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Cysteine residues contribute to the dimerization and enzymatic activity of human nuclear dUTP nucleotidohydrolase (nDut).</a> Protein Science. , (2018).</li>
<li>Caradonna, S., Muller-Weeks, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nature+of+enzymes+involved+in+uracil-DNA+repair%3A+isoform+characteristics+of+proteins+responsible+for+nuclear+and+mitochondrial+genomic+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protein+and+Peptide+Science%22%5BJournal%5D)">The nature of enzymes involved in uracil-DNA repair: isoform characteristics of proteins responsible for nuclear and mitochondrial genomic integrity.</a> Current Protein and Peptide Science. 2 (4), 335-347 (2001).</li>
<li>Macpherson, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noxious+compounds+activate+TRPA1+ion+channels+through+covalent+modification+of+cysteines%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Noxious compounds activate TRPA1 ion channels through covalent modification of cysteines.</a> Nature. 445 (7127), 541-545 (2007).</li>
<li>Carey, M. F., Peterson, C. L., Smale, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation+%28ChIP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation (ChIP).</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (9), (2009).</li>
</ol>

Os autores declaram não ter conflitos de interesse com o conteúdo deste manuscrito.

O método esboçado aqui dá um protocolo reto-forward para a análise de complexos multimérica estabilizados através dos LINKAGES do dissulfide. Este protocolo pode facilmente ser adaptado a outras linhas da cultura de pilha, tecidos e organismos permitindo uma escala de aplicações larga.
Um passo importante neste procedimento é garantir que as ligações dissulfeto não são uma consequência do procedimento de extração. Qualquer resíduo de cisteína livre pode ser bloqueado usando iodoacetamida<sup c...

As ligações de dissulfeto têm sido conhecidas por muito tempo para estabilizar a estrutura de muitas proteínas. Em trabalhos recentes, esse vínculo também foi classificado como uma modificação pós-translacional reversível, atuando como um "interruptor redox" baseado em cisteína, permitindo a modulação da função protéica, localização e interação1,2, 3,4. Assim, é importante ser capaz de estudar esta modificação. Um método simples para analisar esses complexos multiméricos estabilizados com cisteína é através da análise de SDS-PAGE não redutora5. A análise de SDS-PAGE é uma técnica usada em muitos laboratórios, onde os resultados podem ser obtidos e interpretados rapidamente, fàcilmente, e com custos mínimos, e são vantajosos sobre outras técnicas usadas para identificar ligações do dissulfide tais como a espectrometria maciça6 ,7 e Dicroísmo circular8.
Uma etapa importante em determinar se este método é uma técnica apropriada a ajudar em um estudo é examinar completamente a seqüência preliminar da proteína do interesse para segurar lá é resíduo do cisteína (s) atual. Outro passo útil é Pesquisar quaisquer estruturas de cristais anteriores publicadas ou usar uma aplicação de Bioinformática para explorar a estrutura tridimensional da proteína de interesse para visualizar onde os resíduos de cisteína podem ser localizados. Se o resíduo (s) está presente na superfície exterior pode ser um candidato melhor para formar uma ligação dissulfeto em vez de um resíduo de cisteína enterrado no interior da estrutura. No entanto, é importante notar que as proteínas podem sofrer alterações estruturais em interações de substrato ou interações proteína-proteína, permitindo que esses resíduos, em seguida, tornar-se exposto ao ambiente também.
Os complexos multimérica identificados podem então ser verificados com cross-linking químico usando o formaldehyde. O formaldehyde é um cross-linker ideal para esta técnica da verificação devido à permeabilidade elevada da pilha e à extensão cross-linking curta de ~ 2-3 Å, assegurando a deteção de interações específicas da proteína-proteína9,10. Aqui, este método é ilustrado analisando-se a isoforma nuclear de dUTPase da linha de células de osteossarcoma óssea humana U-2 OS11. No entanto, este protocolo pode ser adaptado para outras linhas celulares, tecidos e organismos.

<table><tbody><tr><td>16% de géis TGX pré-fabricados</td><td>ThermoFisher</td><td>Xp00160</td><td></td></tr><tr><td>175 cm2 </td><td>Cell star</td><td>658175</td><td></td></tr><tr><td>18CO</td><td>ATCC</td><td>CRL-1459</td><td></td></tr><tr><td>6 cm2</td><td>prato VWR</td><td>10861-588</td><td></td></tr><tr><td>A549</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td></td></tr><tr><td>Kit de detecção de ECL Amersham</td><td>GE</td><td></td><td></td>16817200</tr><tr><td>Aparelho de transferência de manchas</td><td>Biorad</td><td>153BR76789</td><td></td></tr><tr><td>BME</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Reagente de proteína Bradford</td><td>Biorad</td><td>5000006</td><td></td></tr><tr><td>Azul</td><td></td><td></td><td></td>de Bromofenol</tr><tr><td>BSA</td><td>Sinalização celular</td><td>99985</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de lise celular</td><td>Sinalização celular</td><td>9803</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendor</td><td>5415D</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>Broca</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M101</td><td></td></tr><tr><td>Aparelho de eletroforese</td><td>Invitrogen</td><td>A25977</td><td></td></tr><tr><td>Papel mata-borrão ocidental extra grosso</td><td>ThermoFisher</td><td>88610</td><td></td></tr><tr><td>Fetal soro bovino</td><td>Gibco</td><td>1932693</td><td></td></tr><tr><td>Formaldeído</td><td>ThermoFisher</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>Homogeneizador</td><td></td><td></td><td></td>de vidro-teflon</tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>65516</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>RPI</td><td>636050</td><td></td></tr><tr><td>Bloco de calor</td><td>Denville</td><td>10285-D</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H0527</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorídrico</td><td>VWR</td><td>2018010431</td><td></td></tr><tr><td>Iodoacetamida</td><td>ThermoFisher</td><td>90034</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Kimtech</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Pharmco</td><td>339000000</td><td></td></tr><tr><td>Leite em pó desnatado</td><td>Sinalização celular</td><td>99995</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3813</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma Aldrich</td><td>329-98-6</td><td></td></tr><tr><td>Posi-click tube</td><td>Denville</td><td>C2170</td><td></td></tr><tr><td>Fonte de alimentação</td><td>Biorad</td><td>200120</td><td></td></tr><tr><td>Marcador Prestained</td><td>ThermoFisher</td><td>26619</td><td></td></tr><tr><td>Membrana PVDF</td><td>Biorad</td><td>162-0177</td><td></td></tr><tr><td>Rocker</td><td>Reliable Scientific</td><td>55</td><td></td></tr><tr><td>Saos2</td><td>ATCC</td><td>HTB-85</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Biorad</td><td>161-0302</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo secundário</td><td>Sinalização celular</td><td>70748</td><td></td></tr><tr><td>Raspador de células pequenas</td><td>Tygon</td><td>S-50HL classe VI</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>RPI</td><td>S23020</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sódio</td><td>Gibco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Branson</td><td>450</td><td></td></tr><tr><td>Almofada de esponja para borrar</td><td>Invitrogen</td><td>E19051</td><td></td></tr><tr><td>Placa de agitação</td><td>Corning</td><td>PC353</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S-1888</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>RPI</td><td>T60040</td><td></td></tr><tr><td>Tris Salino Tamponado, com Tween 20, pH 7,5</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SRE0031</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Glycine tampão de corrida</td><td>VWR</td><td>J61006</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>U-2 OS</td><td>ATCC</td><td>HTB-96</td><td></td></tr><tr><td>Filme de raio-X</td><td>ThermoFisher</td><td>34090</td><td></td></tr></tbody></table>

combinando análise de sds-page não redutora e reticulação química para detectar complexos multiméricos estabilizados por ligações de dissulfeto em células de mamíferos na cultura

Combining Non-reducing SDS-PAGE Analysis and Chemical Crosslinking to Detect Multimeric Complexes Stabilized by Disulfide Linkages in Mammalian Cells in Culture

As estruturas de muitas proteínas são estabilizadas através de ligações de dissulfeto covalente. Em trabalhos recentes, esse vínculo também foi classificado como uma modificação pós-translacional. Assim, é importante ser capaz de estudar esta modificação em células vivas. Um método simples para analisar estes complexos multimérica cisteína-estabilizados é através de um método de duas etapas de não-reduzindo a análise SDS-PAGE e o cross-linking do formaldehyde. Este método de duas etapas é vantajoso como o primeiro passo para desvendar complexos multiméricos estabilizados por ligações dissulfeto devido à sua facilidade técnica e baixo custo de operação. Aqui, a linha celular do osteosarcoma do osso humano U-2 ósmio é usada para ilustrar este método analisando especificamente o isoforma nuclear de dUTPase.

A dUTPase nuclear forma uma articulação dissulfeto intermolecular formando uma configuração de dímero estável através da interação de dois resíduos de cisteína posicionados no terceiro aminoácido de cada proteína monomérica11. Isto é demonstrado na Figura 1a, B. Para garantir que essa articulação dissulfeto não foi uma interação não específica devido a anormalidades migratórias no ambiente não reduzido, a inclusão de u...

As ligações de dissulfeto têm sido conhecidas por muito tempo para estabilizar a estrutura de muitas proteínas. Um método simples para analisar complexos multimérica estabilizados por estas ligações é através da análise de SDS-PAGE não-reduzindo. Aqui, este método é ilustrado analisando-se a isoforma nuclear de dUTPase da linha de células de osteossarcoma óssea humana U-2 OS.

Combinando análise de SDS-PAGE não redutora e reticulação química para detectar complexos multiméricos estabilizados por ligações de dissulfeto em células de mamíferos na cultura

The structures of many proteins are stabilized through covalent disulfide linkages. In recent work, this bond has also been classified as a ...

Foi bem estabelecido que as estruturas de muitas proteínas estão estabilizadas em ligações de dissulfeto covalente. Em trabalhos recentes, este vínculo foi classificado como uma modificação pós-translacional. Assim, é importante ser capaz de identificar complexos multimer estabilizados por cisteína em células vivas usando um método rápido e simples.A principal vantagem dessa técnica é que os resultados podem ser obtidos e interpretados de forma rápida, fácil e com custo mínimo. Para começar, cresça células de OS U-2 em um prato de seis centímetros quadrados em Mínimo Essencial Médio High Glicose, suplementado com 10% FBS e 1% piruvato de sódio a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono. Faça um estoque fresco de iodoacetamida de 10 milimôe pouco antes de usar.Depois que as células atingirem 50 a 60% de confluência, adicione 0,1 milimão de concentração final iodoacetamida diretamente à mídia de cultura celular. Balance suavemente o prato em temperatura ambiente por dois minutos. Em seguida, aspire a mídia das células, e lave as células com cinco mililitros de PBS frio três vezes.Aspire a solução final de lavagem PBS e adicione um mililitro de PBS frio. Raspe as células do fundo do prato usando um raspador de células. Usando uma pipeta de um mililitro, elas desenhe a PBS e a suspensão celular e distribua todo o líquido em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.Gire as células a 7.500 vezes g em quatro graus Celsius por três minutos. Aspire o PBS deixando a pelota de celular para trás. A pelota celular pode ser armazenada a menos 80 graus Celsius até o processamento.Para extrair a proteína, prepare 100 microliters de um tampão de lise 1X diluído em água dupla destilada. Adicione PMSF imediatamente antes de usar a uma concentração final de um mililitro. Em seguida, adicione 50 microliters do tampão de 1X lysis diretamente à pelota celular e suspenda novamente.Incubar o extrato no gelo por cinco minutos. Sonicate por oito segundos usando o modo de pulso constante a 40% mantendo o extrato no gelo. Gire o extrato a quatro graus Celsius e 16.000 vezes g por cinco minutos.Realize a análise de Bradford para determinar a concentração proteica, se desejar. Para preparar a amostra, pegue 10 microliters do extrato de proteína solúvel e adicione 10 microliters de um tampão amostral de SDS laemmli 1X. Mantenha as amostras no gelo.Aqueça a amostra a 85 graus Celsius durante cinco minutos antes de executar o gel. Para iniciar a ligação cruzada do formaldeído, cresça células de SO U-2 em um frasco de 175 centímetros quadrados para 70 a 80% de confluência. Em um capô de fumaça adicione o formaldeído fixador diretamente ao meio a uma concentração final de 1% e incubar à temperatura ambiente com agitação suave por 15 minutos.Para saciar a reação adicione 1,25 glicina molar a uma concentração final de 0,125 molar e incubar à temperatura ambiente com agitação suave em um roqueiro por cinco minutos. Lave as células com cinco mililitros de PBS frio três vezes. Aspire a solução final de lavagem PBS e adicione 10 mililitros de PBS.Raspe as células do fundo do frasco usando um raspador de células. Usando uma pipeta de 10 mililitros, elas desenhe a PBS e a suspensão celular e distribua todo o líquido em um tubo de centrífuga cônica de 15 mililitros. Gire as células a 500 vezes g e quatro graus Celsius por dois minutos.Aspire o PBS deixando a pelota de celular para trás. Prepare 10 mililitros do tampão de homogeneização adicionando 0,25 de sacarose molar, um EDTA mililitro, 10 mililitros HEPES e 0,5%BSA no pH 7.4. Imediatamente antes do uso, adicione PMSF a uma concentração final de um mililitro e três mililitros do buffer de suspensão dos núcleos.Adicione cinco mililitros do tampão de homogeneização diretamente à pelota celular e resuspend completamente. Centrifugar a suspensão a 500 vezes g e quatro graus Celsius por dois minutos. Após a centrifugação, descarte o supernasciente e resuspenque a pelota em cinco mililitros do tampão de homogeneização.Em seguida, com um vidro apertado, o homogeneizador Teflon homogeneiza as células a 10 tempos por 500 RPM e centrifugar a suspensão a 1.500 vezes g e quatro graus Celsius por 10 minutos. Após a centrifugação descarte o supernasce. Resuspenda a pelota em um mililitro do tampão de suspensão dos núcleos e incubar no gelo por 10 minutos.Após a incubação, centrífuga a 600 vezes g por 10 minutos. Após a centrifugação, descarte o supernasciente, resuspenque a pelota em um mililitro do tampão de suspensão dos núcleos e centrífuga novamente. A última pelota será os núcleos isolados.Extrair as proteínas como descrito antes de adicionar 25 microlitadores do tampão de 1X lysis diretamente à pelota celular. Em seguida, prepare duas amostras para a PÁGINA SDS, pegando 10 microliters cada um do extrato de proteína solúvel e adicione 10 microliters de tampão amostral 2X Laemmli SDS e um microliters de BME. Aqueça uma amostra a 37 graus Celsius por cinco minutos e a segunda amostra a 98 graus Celsius por 15 minutos para reverter o cruzamento do formaldeído.Prepare um litro de tampão de corrida 1X Tris-glicina misturando 25 mililitros Tris, 192 milimolar de glicina e 0,1% de peso por volume SD. Em seguida, configure o aparelho de execução do SDS PAGE. Abra o pacote TGX SDS-PAGE 16% pré-moldado de acordo com o protocolo do fabricante e remova o. Remova o pente que está forrando os poços e a fita da parte inferior do e coloque o gel no aparelho de corrida.Encha a câmara com o tampão de 1X funcionando até que os poços estejam submersos em líquido. Usando uma pipeta de plástico enxágue os poços com tampão de corrida. Carregue as amostras no gel junto com 10 microliters do marcador padrão pré-manchado.Por fim, execute o gel a 200 volts até que a frente de corante esteja a aproximadamente um centímetro da parte inferior do gel. Uma análise ocidental de extratos celulares totais na ausência de agente redutor de BME demonstrou uma formação multimérica complexa em diferentes populações de células humanas. O complexo desapareceu com a adição de BME em todas as quatro linhas celulares examinadas, indicando a presença de uma ligação dissulfeto.A confirmação monomérica de dUTPase em células humanas no momento da colheita é uma combinação de pelo menos três dos isóformes de dUTPase: a isoforme mitocondrial, a isoforma nuclear e uma versão truncada anotada em M24. O isoforme mitocondrial usado como controle não formou uma ligação dissulfeto e migrou para o peso molecular previsto para a proteína monomérica. A inter ligação do formaldeído do dUTPase nuclear demonstrou formação multimérica do complexo.Quando o cross-link foi invertido incubando a amostra a 95 graus Celsius por 15 minutos, o complexo foi desestabilizado e pôde ser visualizado em seu estado monomérico. Adicionar iodoacetamida é um passo importante neste procedimento para bloquear os resíduos livres de cisteína e garantir que as ligações de dissulfeto não sejam uma consequência do procedimento de extração. É importante lembrar de não adicionar nenhum agente redutor, como BME ou DDT às suas amostras SDS-PAGE, pois elas reduzirão quaisquer ligações de dissulfeto presentes em sua amostra.

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Research

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