Electroretinogram gravação no Zebrafish Larval usando eletrodo de esponja-ponta em forma de Cone de romance A
27 de março de 2019
Aqui, apresentamos um protocolo que simplifica a medição de luz electroretinogram evocado respostas de zebrafish larval. Um eletrodo de esponja-ponta cónica romance pode ajudar a tornar o estudo de desenvolvimento visual no zebrafish larval usando o electroretinogram ERG mais fácil de conseguir com resultados confiáveis e menor custo.
Este protocolo ajuda a simplificar as medidas de eletroretinogramas ou ERGs em zebrafish larval que fornece uma leitura funcional importante do desenvolvimento visual e modelos de doenças genéticas. As pontas de esponja macia de gravação de eletrodos usados neste protocolo são fáceis de fabricar usando materiais econômicos e prontamente disponíveis e evita danos potenciais aos olhos larvais. O eletrodo mais macio com ponta de esponja pode facilitar repetidas medições de ERG do mesmo olho.
Indivíduos novos neste procedimento podem achar difícil trabalhar sob a iluminação vermelha fraca que é usada durante todo o procedimento. Mas é importante que a adaptação sombria seja mantida. Para preparar o eletrodo de gravação de esponja em forma de cone, corte a extremidade de uma extensão de chumbo eletrodo de platina e use um bisturi para remover 10 milímetros do revestimento de isolamento de politetrafluoroetileno externo da nova extremidade da extensão.
Corte um pedaço de 40 milímetros de um fio de prata de 0,3 milímetros de diâmetro e entrelaça o fio de prata com o fio interno exposto para fixar o fio com segurança ao chumbo do eletrodo. Encarnar a junta com fita isolante deixando um comprimento de aproximadamente 15 milímetros de fio de prata exposto. Conecte outro fio ao terminal negativo da bateria e mergulhe a outra extremidade do fio no soro fisiológico.
Mergulhe o fio de prata exposto em soro fisiológico normal e conecte a outra extremidade ao terminal positivo de uma fonte de corrente direta de nove volts. Após 60 segundos, coloque o fio no tecido absorvente para secar. Enquanto isso, corte um quadrado de 20 por 20 milímetros de esponja de acetato de polivinyl em uma forma de cone e saturar a esponja em uma vez tampão de Ringer.
Sob um microscópio leve com uma barra de escala na ocular, use uma lâmina de bisturi para moldar o ápice do cone a aproximadamente 40 micrômetros de diâmetro. Seque o ar da esponja em forma de cone em papel de tecido absorvente até ficar sólido. Antes de inserir o fio de prata na esponja de acetato de polivinil em forma de cone sólido seco através da base do cone, usando fita adesiva para isolar qualquer excesso de metal exposto para reduzir artefatos fotovoltaicos.
No dia do experimento, mergulhe o eletrodo de ponta esponja no tampão de Ringer por 15 minutos para saturar totalmente a esponja. Pelo menos oito horas antes das gravações, coloque não mais do que 20 larvas de zebrafish em um único tubo de 15 mililitros sem tampa e envolto em papel alumínio em uma incubadora escura. No final da incubação, despeje o zebrafish adaptado à escuridão em uma placa de petri sob iluminação vermelha fraca de um diodo emissor de luz.
Para preparar a plataforma de esponja, corte um pedaço de esponja de acetato de polivinyl aproximadamente igual em espessura à profundidade de uma placa de petri de 35 milímetros para que a esponja se encaixe perfeitamente dentro da placa. Faça um pequeno corte verticalmente através de uma extremidade da esponja para acomodar o fio de prata do eletrodo de referência e mergulhe a esponja no tampão de Ringer de peixe dourado até que a esponja esteja saturada. Em seguida, coloque a esponja em uma placa de petri de 35 milímetros limpa e use uma toalha de papel para absorver o líquido extra até que nenhuma solução exale da esponja em resposta a uma prensa de dedo leve.
Para posicionar o animal para o experimento, use uma pipeta Pasteur de três milímetros para transferir uma larva anestesiada para um quadrado de três por três centímetros de papel toalha e use fórceps para colocar o quadrado na esponja umedeçada. Usando uma escova fina encharcada no tampão de Ringer, ajuste a posição da larva com um olho voltado para cima e para longe de qualquer líquido na toalha sob a larva. Esmalte o corpo larval com gel ocular hidratante para manter o animal hidratado durante toda a gravação do eletroretinograma.
E coloque o prato em uma pequena plataforma aquecida à água em frente ao estímulo leve da tigela ganzfeld situado dentro de uma gaiola faraday. Insira o eletrodo de referência no corte feito na esponja da plataforma. E conectar um eletrodo terrestre obtido comercialmente à jaula de Faraday.
Conecte o eletrodo de gravação a um suporte de eletrodo e fixe o suporte no braço estereotipado de um micromanipulador. Usando uma pipeta Pasteur de três milímetros, ressaturar a ponta da esponja do eletrodo com uma gota da solução de Ringer e posicionar o microscópio na gaiola de Faraday sobre a plataforma de eletroretinograma. Use a ponta de um tecido absorvente para remover qualquer excesso de líquido da ponta da esponja de eletrodo e sob o microscópio, posicione o eletrodo ativo para que a ponta da esponja toque suavemente a superfície córnea central do olho de zebrafish larval.
Em seguida, mova a tigela ganzfeld em direção à plataforma de esponja tomando cuidado para que a larva esteja coberta pela tigela e feche a gaiola para reduzir o ruído eletromagnético estranho. A sensibilidade da retina de zebrafish larval para dimmer pisca com a idade. Como as ondas a e b não são reconhecíveis em intensidades inferiores a menos 1,61 log candela segundo por metro quadrado a quatro dias após a fertilização, enquanto sinais claros são detectáveis nessas intensidades nas larvas mais antigas.
A amplitude da onda B aumenta significativamente entre quatro e cinco pós-fertilização. Aos sete dias, o sinal a 2,48 log candela segundo por metro quadrado é maior em comparação com os dias cinco e seis pós-fertilização. Os tempos implícitos de ondas A e B tornam-se significativamente mais rápidos após cinco dias após a fertilização.
No geral, esses resultados demonstram um amadurecimento na função de retina de zebrafish entre quatro a sete dias após a fertilização. Para executar com sucesso este protocolo é fundamental que as esponjas estejam totalmente saturadas com fluido, o que ajuda a manter a condutividade do eletrodo de gravação e reduz os níveis de ruído. Se a onda a for de interesse particular, tratamentos farmacológicos podem ser aplicados para bloquear o componente de onda B, expondo assim a onda A completa.
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Visão Geral
Este protocolo ajuda a simplificar as medições de eletroretinogramas (ERGs) em larvas de peixe-zebra, fornecendo uma leitura funcional importante do desenvolvimento visual e de modelos de doenças genéticas. O uso de um novo eletrodo com ponta de esponja em formato cônico facilita resultados confiáveis e é economicamente eficiente.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Eletrfisiologia
- Desenvolvimento Visual
Contexto
- Os eletroretinogramas (ERGs) são cruciais para avaliar a função visual.
- Alevinos de peixe-zebra servem como modelo para estudar o desenvolvimento visual.
- Métodos tradicionais podem correr o risco de danificar os olhos delicados dos alevinos.
- Eletrodos com ponta de esponja macia podem reduzir esse risco.
Objetivo do Estudo
- Para simplificar a medição de ERGs em peixes-zebra larvais.
- Para fornecer um método confiável para estudar o desenvolvimento visual.
- Para permitir medições repetidas sem prejudicar os indivíduos.
Métodos Utilizados
- Preparação de eletrodos gravadores em forma de cone feitos de esponja.
- Uso de iluminação vermelha fraca para manter a adaptação ao escuro.
- Confecção de eletrodos a partir de materiais econômicos.
- Gravação de ERGs do mesmo olho várias vezes.
Resultados Principais
- Os eletrodos de ponta esponjosa são fáceis de fabricar e usar.
- Eles evitam danos aos olhos de alevinos de peixe-zebra.
- Medições repetidas de ERG facilitadas fornecem resultados consistentes.
- Mantém-se a adaptação ao escuro é crucial para leituras precisas.
Conclusões
- O protocolo fornece um método confiável e econômico para medições de ERG.
- Ele aprimora o estudo do desenvolvimento visual em peixes-zebra.
- Pesquisas futuras podem se beneficiar dessa abordagem simplificada.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este protocolo fornece um método econômico e reproduzível para avaliação funcional do desenvolvimento visual em larvas de peixe-zebra, um modelo-chave para validação de alvos na descoberta de fármacos em neurociência. O novo eletrodo de ponta de esponja reduz barreiras técnicas e danos teciduais, permitindo leituras confiáveis de ERG que apoiam a desoneração mecanicista de vias retinianas. Sua simplicidade facilita a padronização do ensaio entre laboratórios, melhorando a confiabilidade preditiva na triagem de função visual em estágios iniciais.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de vias funcionais da retina por meio de medições das ondas a e b, apoiando testes de hipóteses sobre alvos em neurociência visual.
- Valor Operacional: Utiliza materiais econômicos e facilmente disponíveis, reduzindo as barreiras para o estabelecimento de ensaios de ERG em fluxos de trabalho de validação de alvos.
- Valor Preditivo: Fornece leituras eletrofisiológicas quantitativas e repetíveis que ajudam a reduzir os riscos associados a suposições mecanicistas sobre os efeitos de genes ou compostos no processamento retiniano.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaio
- Valor Científico: Gera amplitudes e tempos implícitos das ondas a e b consistentes como biomarcadores quantitativos da maturação e função retiniana.
- Valor Operacional: A facilidade de fabricação e manipulação do eletrodo favorece a reprodutibilidade e escalabilidade do ensaio para triagem de média escala.
- Prontidão do Ensaio: Permite avaliação confiável de compostos ao fornecer gravações estáveis e não invasivas, adequadas para estudos longitudinais no mesmo olho larval.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Apoia a modelagem relevante para doenças ao acompanhar a maturação visual funcional entre 4 e 7 dias após a fertilização, alinhando-se com janelas críticas em modelos de doenças genéticas.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Permite o isolamento farmacológico dos componentes da onda a para dissecar as contribuições dos fotorreceptores versus células bipolares, melhorando a especificidade do alvo.
- Utilidade Pré-clínica: Oferece detecção sensível de alterações funcionais ao longo das fases de desenvolvimento, auxiliando nas avaliações de resposta à dose e de curso temporal.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método insere-se no continuum de descoberta que vai da validação de alvos até a avaliação pré-clínica, oferecendo uma conexão funcional entre a manipulação genética e o desfecho fenotípico na pesquisa do sistema visual.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses mediante a medição de respostas eletrofisiológicas da retina a estímulos luminosos, esclarecendo a atividade das vias em peixes-zebra em desenvolvimento.
- Triagem: Fornece resultados padronizados de ERG com baixo ruído, permitindo comparações entre condições genéticas ou tratamentos.
- Análise: Oferece variáveis dependentes mensuráveis (amplitude da onda a, amplitude da onda b, tempos implícitos) para comparação estatística da função retiniana.
- Pesquisa Translacional: Relaciona alterações eletrofisiológicas do desenvolvimento a modelos de doenças, apoiando o alinhamento de biomarcadores em disfunções visuais.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável e de baixo custo para testes de ERG, que pode ser compartilhada entre projetos que estudam genes retinianos, toxinas ou candidatos terapêuticos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança na validação do alvo por meio da medição direta e funcional da atividade neural retiniana.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade e reduz a variabilidade por meio da padronização da preparação dos eletrodos e das condições de gravação em ambiente escuro adaptado.
- Valor Estratégico: Aprimora as decisões de avançar ou interromper projetos ao fornecer dados funcionais precoces sobre a integridade do sistema visual, reduzindo o risco de desistência em fases tardias.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de compostos ou alvos genéticos com base em resultados funcionais visuais objetivos.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em eletrofisiologia e manejo de peixe-zebra para manter a integridade do sinal.
- Depende de equipamentos básicos de eletrônica e microscopia para a fabricação de eletrodos e aquisição de sinais.
- Necessita protocolos padronizados de adaptação à escuridão e perfusão com solução salina entre os usuários para garantir comparabilidade.
- As considerações de adaptação incluem o ajuste do tamanho do eletrodo e da composição da solução salina para diferentes idades larvais ou espécies.
- As limitações práticas incluem a sensibilidade aos níveis de saturação do eletrodo e à luz ambiente, que devem ser controladas para minimizar o ruído.
