Name: Complexos artificiais de alongamento de RNA polimerase II para dissecar eventos co-transcricionais do processamento de RNA (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Aprenda a montar complexos de alongamento da RNA polimerase II usando oligonucleotídeos sintéticos e contas magnéticas. Este método permite estudar o processamento co-transcricional e a regulação da transcrição em biologia molecular.

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Agradecemos a S. Shuman por fornecer a enzima tampando de mamíferos cDNA. Este trabalho foi apoiado em parte por uma subvenção para o Instituto de pesquisa médica de Stowers do fundo de pesquisa médica de Helen Nelson na fundação da Comunidade da grande Kansas City.  Os dados originais subjacentes a este manuscrito podem ser acessados a partir do repositório de dados original do Stowers em http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1434.

1. montagem de complexos de alongamento artificial e pol II andando
<ol><li>Imobilize 1 nmol do oligo do ADN do não-molde que contem uma molécula de 3 ' biotina em grânulos magnéticos. Observação: as etapas a seguir podem ser feitas com antecedência para se preparar para experimentos futuros. Todas as sequências de oligo utilizadas neste protocolo são fornecidas na tabela 1. Os oligos de RNA são sintetizados com modificações de 5 '-trifosfato.<ol>
<li>Adicione 200 μL de grânulos magnéticos (10 mg/mL) a um tubo de ligação de baixa proteína 1,5 mL e, em seguida, coloque em um rack magnético por 2 min.</li>
		<li>Enquanto o tubo está no rack magnético, retire o líquido do tubo sem perturbar as contas. Para lavar os grânulos, retire o tubo do rack, adicione 1 mL de 5 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl, retorne o tubo para o rack, e retire a solução de lavagem após 2 min.</li>
		<li>Repita as lavas mais 2 vezes usando 200 μL do mesmo buffer.</li>
		<li>Ressuspender contas magnéticas em 400 μL de 10 mM de Tris-HCl pH 7,5, 1 mM EDTA, 2 M NaCl, tampão. Em seguida, misture com 380 μL de H2O e 20 μL de oligo de DNA biotinilado não modelo de 10 μm. Coloque o tubo sobre um pulverizador e incubar por 30 min à temperatura ambiente.</li>
		<li>Lavagem imobilizada não-template DNA oligo 3 vezes com 200 μL de 5 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl e, em seguida, 3 vezes com 200 μL de 20 mM HEPES-NaOH pH 7,9, 20% glicerol, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 0,5 mg/mL de albumina sérica bovina.</li>
		<li>Deixe o tubo durante a noite a 4 ° c para terminar o bloqueio de contas com BSA.</li>
		<li>No dia seguinte, colocar o tubo na cremalheira magnética, remover e descartar o líquido, e ressuspender contas em 200 μL de 20 mM HEPES-NaOH pH 7,9, 20% glicerol, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 0,5 mg/mL de albumina sérica bovina e transferência para um novo tubo. Para este modelo de DNA, a concentração final é de aproximadamente 5 μM. Nota: O tempo de incubação e a concentração de oligo precisam ser empiricamente determinados para cada oligo de DNA biotinilado. Este modelo deve fornecer o suficiente para 200 reações, e durar pelo menos 6 meses quando armazenado a 4 ° c.</li>
	</ol></li>
	<li>O RNA de Anneal e o molde do ADN oligos do oligonucleotide da vertente em uma relação do molar 2:1 (20 e 10 pmol, respectivamente) para obter o ADN: duplex do RNA.
	<ol>
<li>Configurar uma mistura de recozimento de 10 μL conforme descrito na tabela 2. Nota: 10 μL de mistura de recozimento são suficientes para 10 reacções. A mistura do recozimento pode ser escalada acima como necessário se mais ensaios devem ser executados.</li>
		<li>Realize as reações de recozimento em um termociclador usando o seguinte programa: 5 min a 45 ° c, seguidos por 12 ciclos de 2 min cada, começando a 43 ° c e diminuindo a temperatura 2 ° c por ciclo. Ocioso a 4 ° c. Nota: Este é um ponto de tempo flexível. O recozimento é terminado dentro de ~ 30 minutos mas pode ser deixado em 4 ° c por um período mais longo. No laboratório, as misturas do recozimento foram deixadas sentando-se para até 4 h sem observar nenhuma diminuição na eficiência da reação.</li>
		<li>Quando o RNA do recozimento ao ADN da vertente do molde, prepare bufferes para umas etapas mais atrasadas do protocolo. Os ingredientes necessários para preparar cada tampão para uma única reação com cada tampão são alistados nas tabelas 2 a 8. Escale as receitas por um fator de [Y (X + 1) + 1] para Wash e (X + 1) para todos os outros buffers. X = número de reacções a preparar; Y = número de passos de lavagem necessários (mínimo 3). Nota: Prepare todos os buffers frescos no dia do experimento. Não coloque os tubos no gelo após o PVA ter sido adicionado aos buffers. Adicionar pol II ou nucleotídeos para buffers direito antes de usar.</li>
	</ol></li>
	<li>Carga purificada RNA polimerase II para o DNA: híbrido de RNA.
	<ol>
<li>Misturar 1 pmol (1 μL) de DNA: RNA duplex com 13 μL de tampão pol II (a partir da tabela 3).</li>
		<li>Adicionar ~ 0, 2 unidades de RNA purificado pol II (1 μL) à mistura a partir do passo 1.3.1 e misture suavemente com pipetagem para cima e para baixo e mexendo com ponta de Pipet, sem introduzir bolhas. Incubar por 10 min a 30 ° c. Nota: Os volumes dados a partir de aqui são para uma única reação; aumentar conforme necessário para o número de reações no experimento. RNA Pol II purificado do fígado de rato como descrito10 é usado neste exemplo; no entanto, o RNA Pol II purificado de outras fontes, incluindo as células de mamíferos cultivadas ou levedura também pode ser usado3,4,5,11,12,13.</li>
	</ol></li>
	<li>Complete o complexo de alongamento por adição de DNA não-modelo biotinilado.
	<ol>
<li>Adicionar 5 pmol (1 μL) de oligo de DNA não-template imobilizado a 14 μL de tampão de DNA não modelo (da tabela 4), adicionar ao tubo da etapa 1.3.2 e incubar por 10 min a 37 ° c.</li>
		<li>Coloque a amostra em rack magnético por 2 min. Lave 1x com 30 μL de tampão de lavagem (da tabela 7) para remover pol II e oligos não incorporados.</li>
	</ol></li>
	<li>Gerar complexos de alongamento contendo RNA 23mers radiolabeled.
	<ol>
<li>Realize todas as incubações adicionais a 30 ° c. Adicione 1 μL de ATP de 15 μM e 10 μCi (1 μL) de [α-32P] UTP (3.000 CI/mmol) a 23 μL de tampão de pulso e use-o para suspender os grânulos magnéticos lavados. Atenção: O material radioactivo é perigoso. Certifique-se de usar o equipamento de proteção apropriado e siga todas as diretrizes de laboratório para uso seguro e descarte de material radioativo. Nota: Substitua UTP radiolabeled com 15 μM UTP quando o RNA radiolabeled não é necessário, como para experimentos ocidentais do borrão.</li>
		<li>Incubar a reação por 10 min para permitir a síntese de 23mers radiolabeled.</li>
		<li>Adicionar 1,5 μL de solução contendo 100 μM de ATP e 100 μM de Mix UTP a 3,5 μL de tampão de perseguição, adicionar ao tubo contendo complexos de alongamento pré-montados e incubar por 5 min para perseguir todas as transcrições nascentes em 23mers.</li>
		<li>Coloque a amostra em rack magnético por 2 min, retire o sobrenadante, lave uma vez com 30 μL de tampão de lavagem para remover nucleotídeos não incorporados e ressuspender em 30 μL de tampão de lavagem.</li>
		<li>Adicione 94 μL de mistura de parada com proteinase K e glicogênio (tabela 9) para encerrar reações ou proceder à seção 1,6 para gerar complexos de alongamento com transcrições mais longas ou seção 2 para realizar ensaios de nivelamento.</li>
	</ol></li>
	<li>Opcional Caminhe pol II para fazer transcrições de nucleotídeo 23, 25 e 29
	<ol>
<li>Siga o procedimento descrito nas etapas 1.2.1 a 1.5.4 para preparar complexos de alongamento contendo 23mers radiolabeled. Escale acima de 4 vezes para gerar 120 μL de complexos de alongamento lavado, que é bastante complexos para 4 reações.</li>
		<li>Etiqueta 3 novos tubos "23mer", "25mer" e "29mer". Transfira 30 μL de complexos de alongamento lavado para o tubo "23mer" e adicione 94 μL de mistura de paragem com proteinase K e glicogênio.</li>
		<li>Coloque o tubo contendo os restantes 90 μL de complexos de alongamento lavado no rack magnético por 2 min, retire o sobrenadante e reressuscitação de grânulos em 90 μL de BTB suplementado com 1,2 μL cada um dos 1,5 mM ATP e 1,5 mM CTP. Incubar por 10 min a 30 ° c.</li>
		<li>Depois de lavar uma vez com 90 μL de tampão de lavagem e ressuscitação em 90 μL de tampão de lavagem conforme descrito no passo 1.5.4, transfira 30 μL de complexos de alongamento para o tubo "25mer" e adicione 94 μL de mistura de paragem com proteinase K e glicogênio.</li>
		<li>Coloque o tubo contendo os restantes 60 μL de complexos de alongamento na cremalheira magnética durante 2 min, retire o sobrenadante e reressuscitação de grânulos em 60 μL de BTB suplementado com 0,8 μL cada um dos 1,5 mM ATP e 1,5 mM CTP.</li>
		<li>Incubar durante 10 min a 30 ° c, lave uma vez com 60 μL de tampão de lavagem como na secção 1.5.5, e ressuscitem em 60 μL de tampão de lavagem.</li>
		<li>Transfira 30 μL de uma amostra de 2x para o tubo "29mer" e adicione 94 μL de mistura de paragem com proteinase K e glicogênio ou prossiga para a secção 2 para realizar ensaios de nivelamento.</li>
		<li>Proceder à purificação e análise do RNA (secção 3).</li>
	</ol></li>
</ol>2. usando complexos de alongamento artificial para ensaio Cotranscriptional tampando
<ol><li>Gere complexos de alongamento lavados contendo 23mers, dimensionando o procedimento descrito nas etapas 1.2.1 a 1.5.5 13 vezes. Isto é suficiente para 12 reações + 1 extra.</li>
	<li>
Fosforilação de pol II CTD
	<ol>
<li>Coloque o tubo contendo complexos de alongamento lavado no rack magnético por 2 min, retire o sobrenadante, e ressuspender grânulos em 377 μL de BTB suplementado com 13 μL de 1,5 mM ATP.</li>
		<li>Prepare dois novos tubos, rotulados + H e-H, respectivamente. Para o tubo rotulado + H adicionar 3 μL de ~ 300 ng/μL TFIIH, e para o tubo rotulado-H adicionar 9 μL de 20 mM HEPES-NaOH pH 7,9, 20% glicerol, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 0,5 mg/mL de albumina sérica bovina. Nota: Nós usamos tipicamente TFIIH purified do fígado do rato, mas nós obtivemos resultados similares usando ~ 0,6 μg/reação de recombinação comercialmente-disponível Cdk7/cyclin H/MAT1 (CAK, que é o módulo da quinase de TFIIH). Consulte a tabela de materiais para obter informações.</li>
		<li>Adicionar 87 μL dos complexos de alongamento lavado do passo 2.2.1 ao tubo rotulado + H e 270 μL de complexos de alongamento lavado para o tubo rotulado-H. Incubar 10 min a 30 ° c.</li>
		<li>Coloque a amostra em rack magnético por 2 min. Para remover o excesso de nucleotídeos e proteínas não acopladas, lave complexos de alongamento em reações de + H e H com 90 μL ou 270 μL de tampão de lavagem, respectivamente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tampar de RNA
	<ol>
<li>Reressuscitar complexos de alongamento no tubo rotulado + H em 87 μL de mistura de tampamento (BTB suplementado com 50 μM GTP (tabela 10). Ressuscitar complexos de alongamento no tubo rotulado-H em 261 μL de mistura de tampamento.</li>
		<li>Prepare 4 novos tubos rotulados 5 ng CE + H, 5 ng CE, 15 ng CE, 45 ng CE. Diluir a enzima tampando (CE) em 20 mM HEPES-NaOH pH 7,9, 20% glicerol, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 0,5 mg/mL de albumina sérica bovina para preparar soluções contendo 5 ng CE/μl, 15 ng CE/μL, ou 45 ng CE/μL e dispensar 3 μL da solução apropriada em cada um dos 4 tubos.</li>
		<li>Prepare 12 novos tubos com 94 μL de tampão de parada (2.1.1) adicionados a cada um.</li>
		<li>Comece cada reação tampando adicionando 87 μL do complexo do alongamento tratado com o TFIIH ou não aos tubos etiquetados que contêm a enzima tampando. Incubar a 30 ° c num bloco de calor.</li>
		<li>Após 1, 2 ou 4 min, pare as reações Transferindo 30 μL de cada mistura de reacção para tubos contendo 94 μL de tampão de paragem. Purificar e analisar produtos de reação conforme descrito na seção 3.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. purificação e análise de RNA
<ol><li>Purify o RNA
	<ol>
<li>Incubar produtos de reacção em tampão de paragem durante 20 min à temperatura ambiente. Nota: Ponto de pausa. As amostras neste tampão foram mantidas para até 4 h sem perda ou degradação do RNA.</li>
		<li>Extraia uma vez com 124 μL de fenol: clorofórmio: álcool isoamílico (25:24:1) e uma vez com clorofórmio: álcool isoamílico (24:1). Atenção: O fenol é extremamente tóxico e é rapidamente absorvido pela pele. Use o equipamento de proteção apropriado. Nota: Para maximizar a recuperação do RNA durante a extração, use os tubos comercialmente disponíveis que contêm um gel high-density, que forma uma barreira estável entre fases aquosas e orgânicas. Consulte discussão e tabela de materiais.</li>
		<li>Transfira a fase aquosa (camada superior) para novos tubos contendo 12,4 μL de acetato de sódio a 3 M pH 5,2.</li>
	</ol></li>
	<li>Precipitação do etanol
	<ol>
<li>Adicionar 350 μL de 100% de etanol e misturar completamente por inversão.</li>
		<li>Incubar por pelo menos 10 min em gelo seco. Nota: Ponto de pausa. Por conveniência, pode-se parar aqui e concluir o procedimento no dia seguinte; no entanto, é possível prosseguir diretamente para a etapa 3,3 e executar o gel no mesmo dia. O RNA pode ser mantido em-80 ° c por um par dias antes do processamento mais adicional, mas não deixa por uns tempos mais longos.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação de amostras de RNA para eletroforese em gel
	<ol>
<li>Permita que as amostras descongele, misture invertendo 2-3 vezes, e centrifugue por 15 minutos em 21.000 x g, 4 ° c, em um centrifugador do tabletop. Enquanto isso, configure a mistura de gel desnaturante (secção 3.4.1).</li>
		<li>Remova cuidadosamente o etanol das amostras sem o pellet perturbador.</li>
		<li>Adicionar 500 μL de 70% etanol, inverter tubo um par de vezes para lavar a pelota, e depois centrifugar novamente a 21.000 x g por 5 min em qualquer temperatura ambiente ou 4 ° c.</li>
		<li>Remova o máximo de etanol possível e faça uma rotação rápida (5-10 s) dos tubos em uma centrífuga de tampo da mesa. Em seguida, com uma ponta de carregamento de gel, retire o último volume restante de etanol.</li>
		<li>Ar-seco pellet para 3 min em temperatura ambiente.</li>
		<li>Dissolva o RNA adicionando 4 μL de H2o à parte superior de cada pelota. Incubar 5 min à temperatura ambiente.</li>
		<li>Adicione 4 μL de corante de RNA 2x (ver tabela de materiais) à mistura e, em seguida, vórtice cada tubo durante alguns segundos para resuspender totalmente o RNA. Nota: A tintura do RNA que contem o formamida em vez da ureia é recomendada, desde que o último precipita em baixas temperaturas.</li>
		<li>Gire rapidamente os tubos e, em seguida, incubar-os a 70 ° c por 10 min em um bloco de calor.</li>
		<li>
Armazene os tubos no gelo seco até que apronte para carregar no gel. Nota: manter o RNA em gelo seco permite a flexibilidade para trabalhar em outros experimentos, enquanto o gel está polimerizando. As amostras não precisam ser reaquecidos após o descongelar. Entretanto, o RNA pode diretamente ser carregado após o aquecimento se o gel está pronto para funcionar.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparando o gel da Urea-página
	<ol>
<li>Para a mistura de gel de 40 mL, combine em um tubo cônico de 50 mL: 16,7 g de ureia, 15 mL de 40% bis: solução de acrilamida (19:1 ratio), 4 mL de 10x TBE (1 M de Tris-HCl, 1 M de borato de sódio, 20 mM de EDTA) e 8 mL de H2O. Este volume é suficiente para um gel de tamanho padrão (18 cm de altura x 16 cm de largura) com espaçadores de 1,0 mm. Atenção: A acrilamida é extremamente tóxica. Quando não houver nenhum risco da inalação quando estiver na solução, use sempre o revestimento, as luvas, e os vidros de segurança do laboratório ao segurar. Nota: Esta mistura é para moldar uma desnaturação 15% gel de poliacrilamida, que prontamente resolve RNA entre 15-50 NT. mude a concentração de bis/acrylamide como necessário para resolver transcritos diferentes do RNA de comprimentos diferentes.</li>
		<li>Coloc o tubo fechado que contem a mistura do gel em um pulverizador até que o urea esteja dissolvido inteiramente.</li>
		<li>Configurar a estação de fundição de gel com placas de vidro, espaçadores de 1 mm e um pente de 15 poços.</li>
		<li>Trabalhando rapidamente, adicione 40 μL de TEMED e 400 μL de solução de persulfato de amónio a 10% para solução de gel e misture bem. Usando um Pipet de 25 mL, derrame a solução do gel entre placas, pente da inserção, e permita que o gel polimerize pelo menos 2 h. Nota: Se o gel é derramado mais de 2 h antes de usar, uma vez que tem polimerizado cobri-lo com toalha de papel úmido (deixando o pente no lugar) e enrole com plástico envoltório para impedi-lo de secar.</li>
	</ol></li>
	<li>Desnaturação gel RNA eletroforese
	<ol>
<li>Após a polimerização, transferência de gel para o tanque de corrida e pre-executá-lo em 20 mA em 1x TBE para 15-30 min.</li>
		<li>Enquanto isso, descongelar amostras (se congeladas), vortex, e girá-los por 4 min em 2.000 x g, 4 ° c.</li>
		<li>Quando estiver pronto, desligue a fonte de alimentação e Lave cuidadosamente cada poço com 1x TBE usando uma seringa.</li>
		<li>Use pontas do gel-carregamento para carregar amostras no gel.</li>
		<li>Executar gel em uma constante 20-30 mA para cerca de 2 h ou até menor corante (xileno cianol FF) atinge a parte inferior do gel.</li>
	</ol></li>
	<li>Retire o gel, coloque-o sobre um pedaço de papel absorvente, e enrole com plástico Wrap.</li>
	<li>Expor o gel radiolabeled a um phosphorscreen.</li>
	<li>Digitalize o phosphorscreen usando um phosphorimager e analise a imagem.</li>
</ol>

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<li>Vos, S. M., Farnung, L., Urlaub, H., Cramer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+paused+transcription+complex+Pol+II-DSIF-NELF%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of paused transcription complex Pol II-DSIF-NELF.</a> Nature. 560 (7720), 601-606 (2018).</li>
<li>Vos, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+activated+transcription+complex+Pol+II-DSIF-PAF-SPT6%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of activated transcription complex Pol II-DSIF-PAF-SPT6.</a> Nature. 560 (7720), 607-612 (2018).</li>
<li>Kujirai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+the+nucleosome+transition+during+RNA+polymerase+II+passage%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structural basis of the nucleosome transition during RNA polymerase II passage.</a> Science. 362 (6414), 595-598 (2018).</li>
<li>Szychowski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavable+biotin+probes+for+labeling+of+biomolecules+via+azide-alkyne+cycloaddition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Cleavable biotin probes for labeling of biomolecules via azide-alkyne cycloaddition.</a> Journal of the American Chemical Society. 132 (51), 18351-18360 (2010).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Os estudos que procuram dissecar eventos acoplados ao complexo do alongamento de pol II tais como o processamento do RNA e a regulação do alongamento do transcrito próprio podem extremamente ser facilitados pelo uso de um sistema altamente purified da enzima. A criação de tais sistemas enzimáticos pode ser desafiador. A transcrição dependente do promotor por pol II requer pelo menos cinco fatores gerais de transcrição. Preparar e estocar esses fatores pode levar meses; Portanto, a etapa limitante deste processo é, muitas...

A síntese do RNA do mensageiro eucariótico (mRNA) é um processo bioquímico elaborado que envolva a síntese de um RNA precursor não processado pelo RNA polymerase II e Processando do RNA do precursor para render o mRNA maduro. As etapas de processamento do RNA de nivelamento, de emenda, e de poliadenilação são executadas pela maior parte co-transcripcionalmente. O complexo de alongamento pol II serve como um andaime que recruta e orquestra as atividades de muitas das enzimas de processamento de RNA. Conseqüentemente, nossa compreensão final de como os mRNAs eucarióticas maduros são gerados dependerá pesadamente no desenvolvimento de sistemas experimentais para permitir a dissecção dos mecanismos bioquímicos que subjacentes o recrutamento ao complexo do alongamento e regulação das enzimas responsáveis pelo nivelamento, splicing e poliadenilação cotranscricional.
Não surpreendentemente, o desenvolvimento de tais sistemas experimentais tem sido difícil. Um grande impedimento tem sido a notável complexidade da própria transcrição de pol II, onde simplesmente reconstituir a transcrição basal por pol II in vitro requer um conjunto mínimo de cinco fatores gerais de iniciação de transcrição: TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF e TFIIH 1. Além disso, reconstituindo qualquer tipo de pol II regulamentada transcrição in vitro requer um conjunto ainda maior de fatores de transcrição e coregulators. Assim, um objetivo principal foi desenvolver sistemas experimentais mais simples que permitam a reconstituição de complexos de alongamento ativos de pol II adequados para investigações do acoplamento funcional da transcrição de pol II e do processamento de RNA.
Um método mais simples para a reconstituição de complexos de alongamento ativos de pol II provou ser útil para estudos estruturais e bioquímicos de alongamento pol II e, mais recentemente, para investigar o processamento de RNA co-transcricional2,3 ,4,5. Neste artigo, nós mostramos como os complexos do alongamento de pol II preparados das bolhas purificadas de pol II e de transcrição sintética podem ser usados eficazmente para investigar os mecanismos que subjacentes o nivelamento co-transcriptional de transcritos nascente de pol II.
Tampando refere-se à adição covalente de um 5 '-guanosina "tampão" para o 5 '-trifosfato final de nascente pol II transcrições. A PAC é importante para etapas subsequentes da maturação do mRNA, transporte, tradução e outros processos6,7. O tampão é adicionado co-transcripcionalmente aos transcritos de pol II por uma enzima referida como a enzima tampando. Em células de mamíferos, locais ativos responsáveis pelas atividades de RNA 5 '-trifosfatase e guanil transferase da enzima tampando estão contidos em um único polipeptídeo8. A enzima tampando é recrutada para o complexo de alongamento de pol II através de interações com superfícies ainda definidas no corpo de pol II e o domínio Rpb1 carboxy-terminal (CTD) fosforilado em Ser5 de suas repetições de heptapeptídeo5. No complexo do alongamento, a enzima tampando catalisa a adição de um tampão de 5 '-guanosine uma vez que o transcrito nascente alcança um comprimento de pelo menos 18 nucleotídeos e emergiu do canal da saída do RNA do polymerase. Na primeira etapa da reação tampando, o triphosphatase hidrolisa o RNA 5 '-triphosphate para render um 5 '-diphosphate. Na segunda etapa, o GTP é hidrolisado para GMP pelo guanil transferase, formando um intermediário de enzima GMP-tampando. Finalmente, o transferase do guanil transfere o PBF à extremidade 5 '-diphosphate do transcrito nascente para produzir a tampa.
Uma característica notável da reação tampando é que o nivelamento co-transcriptional (isto é, tampando dos transcritos associados com os complexos funcionais do alongamento de pol II) é muito mais eficiente do que tampando do RNA livre5,9. Assim, uma grande questão no campo tem sido como esta ativação dramática de nivelamento é alcançada através de interações da enzima tampando com o complexo de alongamento pol II. Neste protocolo nós descrevemos o conjunto de complexos ativos do alongamento do polymerase II do RNA que usam somente o polymerase purificado II do RNA e bolhas artificiais da transcrição. Estes métodos permitem a criação de complexos de alongamento de RNA polimerase II com transcrições de comprimento e seqüência definidos. Em um estudo recente, utilizamos estes complexos de alongamento de RNA polimerase II definidos como um modelo para investigar aspectos dos mecanismos do RNA tampando5. Em particular, nós mostramos que (i) o nivelamento do RNA associado com estes complexos do alongamento era mais do que 100-fold mais eficiente do que tampando do RNA livre e (II) foi estimulado pela fosforilação TFIIH-dependente do pol II CTD. A abordagem aqui descrita poderia, em princípio, ser adaptada para gerar substratos para o estudo de outras reações de processamento de RNA cotranscricional ligadas ao complexo de alongamento pol II.
Na seção 1 deste protocolo, os complexos artificiais do alongamento são criados recozimento um oligonucleotide sintético da vertente do ADN do molde a um oligonucleotide do RNA que seja complementar em seus 3 '-extremidade a aproximadamente 9 nucleotídeos do ADN da costa do molde. Pol II é então carregado no DNA: RNA duplex. O complexo do alongamento é terminado então pela adição de um oligonucleotide parcialmente complementar, do ADN da vertente do não-molde que seja etiquetado com a biotina em seus 3 '-extremidade (Figura 1 e Figura 2a). O oligonucleotide do RNA é estendido por pol II nestes complexos do alongamento para fazer transcritos radiolabeled do comprimento e da seqüência definidos em cima da adição de combinações apropriadas de nucleotides radiolabeled. Além disso, usando uma combinação de lavagens para remover nucleotídeos não incorporados e adição adicional de diferentes combinações de nucleotídeos, pode-se "andar" pol II para diferentes posições ao longo do modelo de DNA e sintetizar RNA de comprimentos definidos. O RNA é então purificado e submetido à eletroforese em géis de desnaturação da ureia. Na seção 2 do protocolo, complexos de alongamento artificial são usados para analisar a tampagem de RNA cotranscricional. O exemplo apresentado mede o efeito da fosforilação TFIIH-dependente do pol II CTD sobre a tampagem de RNA cotranscricional. Neste experimento, medimos a extensão do nivelamento cotranscricional em função da concentração da enzima tampando (5, 15 e 45 ng por reação) e tempo (1, 2 e 4 min).

<table><tbody><tr><td>[&alpha;-32P] UTP (3000 Ci/mmol), 1 mCi</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEG007H001MC</td><td>Para radiomarcação de RNA</td></tr><tr><td>2x corante de carregamento de RNA</td><td>New England Biolabs</td><td>B0363S</td><td>Altamente recomendado. Para preparar RNA durante o carregamento de gel</td></tr><tr><td>40% Bis:Solução de Acrilamida</td><td>Biorad</td><td>1610144</td><td></td></tr><tr><td>Soro Bovino Albumina (20 mg/mL)</td><td>New England Biolabs</td><td>B9000S</td><td></td></tr><tr><td>Cdk7/Ciclin H/MAT1 (complexo CAK) Proteína, ativa, 10 &micro; g</td><td>Millipore Sigma</td><td>14-476</td><td>Usado para fosforilar</td></tr><tr><td>oligonucleotídeos de DNA</td> Pol II CTD <td>IDT</td><td></td><td>Veja a Tabela 8 para especificações de pureza</td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td><td>Life Technologies Invitrogen</td><td>65001</td><td>Também usamos Dynabeads M-280 streptavidin sem problemas, mas preferimos contas de Streptavidin MyOne porque sedimentam mais lentamente</td></tr><tr><td>GlycoBlue Coprecipitant (15&thinsp; mg/mL)</td><td>Life Technologies Invitrogen</td><td>AM9516</td><td>Altamente recomendado. Corante azul de pellets de ácido nucleico tornando as reações muito mais fáceis de manusear</td></tr><tr><td>Sistema de eletroforese vertical refrigerado duplo padrão Hoefer SE600 com espaçadores de 1 mm e pente de 15 poços</td><td>Tubos de alta densidade Hoefer</td><td>SE600-15-1.5</td><td></td></tr><tr><td>MaXtract (1,5 mL)</td><td>Qiagen</td><td>129046</td><td>Altamente recomendado. Contém um gel de alta densidade que forma uma barreira estável entre as fases aquosa e orgânica; melhora o rendimento de RNA durante as extrações</td></tr><tr><td>Solução de proteinase K (20&thinsp; mg/mL)</td><td>Life Technologies Invitrogen</td><td>25530049</td><td></td></tr><tr><td>RNA oligonucleotídeos</td><td>Trilink</td><td></td><td>Consulte a Tabela 8 para obter mais detalhes</td></tr><tr><td>Pirofosfatase Inorgânica de Levedura (100 unidades/mL)</td><td>New England Biolabs</td><td>NEBM2403S</td><td>Necessário apenas durante reações de capeamento</td></tr></tbody></table>

complexos artificiais de alongamento de rna polimerase ii para dissecar eventos co-transcricionais do processamento de rna

Artificial RNA Polymerase II Elongation Complexes for Dissecting Co-transcriptional RNA Processing Events

A síntese eucariótica do mRNA é um processo bioquímico complexo que exige a transcrição de um molde do ADN em um RNA do precursor pela enzima do RNA polymerase II do multi-subunit e o nivelamento e a emenda co-transcriptional do RNA do precursor para dar forma ao mRNA maduro. Durante a síntese de mRNA, o complexo de alongamento da RNA polimerase II é um alvo para regulação por uma grande coleção de fatores de transcrição que controlam sua atividade catalítica, bem como as enzimas de nivelamento, splicing e 3 '-Processing que criam o mRNA maduro. Por causa da complexidade inerente da síntese de mRNA, os sistemas experimentais mais simples que permitem o isolamento e a investigação de seus vários estágios co-transcriptional têm a grande utilidade.
Neste artigo, nós descrevemos um tal sistema experimental simples apropriado para investigar o tampar co-transcriptional do RNA. Este sistema confia nos complexos definidos do alongamento do polymerase II do RNA montados da polimerase purificada e das bolhas artificiais da transcrição. Quando imobilizados via DNA biotinilado, estes complexos de alongamento de RNA polimerase II fornecem uma ferramenta facilmente manipulável para dissecação de RNA de encapsulamento co-transcricional e mecanismos pelos quais o complexo de alongamento recruta e regula a enzima tampando durante capping co-transcriptional do RNA. Antecipamos que este sistema poderia ser adaptado para o estudo do recrutamento e/ou montagem de proteínas ou complexos proteicos com papéis em outros estágios de maturação do mRNA acoplados ao complexo de alongamento da RNA polimerase II.

As figuras 2 e 3 mostram reações representativas do resultado usadas para gerar complexos artificiais do alongamento que contêm transcrições de comprimentos diferentes estendendo ou pol II das fontes diferentes. A Figura 4 mostra como esses complexos de alongamento podem ser usados para o ensaio de fosforilação cotranscricional CTD-dependente de RNA tampando.
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Aqui, nós descrevemos o conjunto de complexos do alongamento do polymerase II (pol II) do RNA que exigem somente o ADN sintético curto e oligonucleotídeos do RNA e o pol purificado II. Esses complexos são úteis para estudar mecanismos subjacentes ao processamento cotranscricional de transcrições associadas ao complexo de alongamento pol II.

Complexos artificiais de alongamento de RNA polimerase II para dissecar eventos co-transcricionais do processamento de RNA

Eukaryotic mRNA synthesis is a complex biochemical process requiring transcription of a DNA template into a precursor RNA by the multi-subunit enzyme RNA ...

Aqui, estabelecemos um sistema experimental simples que permite a reconstituição de complexos de alongamento Pol II ativos adequados para investigar o acoplamento funcional da transcrição Pol II e do capping de RNA. Com este método, os complexos de alongamento funcional podem ser facilmente montados com apenas alguns componentes. Os complexos de alongamento são imobilizados em contas magnéticas, por isso é fácil mudar as condições de reação.Para imobilizar o oligo de DNA contendo biotina em contas magnéticas, primeiro adicione 200 microliters de contas magnéticas a um tubo de ligação de baixa proteína de 1,5 mililitro, e depois coloque o tubo em um rack magnético por dois minutos. Enquanto o tubo estiver no rack magnético, use uma pipeta para remover o líquido do tubo sem perturbar as contas. Para lavar as contas, remova o tubo do rack e adicione um mililitro de tampão de lavagem contendo Tris-cloridrato, EDTA e cloreto de sódio.Devolva o tubo para o rack. Após dois minutos, remova a solução de lavagem e repita as lavagens mais duas vezes usando 200 microliters do mesmo buffer. Resuspenja as contas magnéticas em 400 microliters de tampão 2X.Em seguida, adicione 380 microliters de água e 20 microliters de 10 micromolar não-modelo biotinínado DNA oligo para misturar. Coloque o tubo em um nutador e incubar por 30 minutos em temperatura ambiente. Depois disso, lave as contas com oligo de DNA não modelo imobilizado três vezes usando 200 microliters de buffer e, em seguida, três vezes com 200 microliters de armazenamento e tampão de diluição.Armazene o tubo a quatro graus Celsius durante a noite para terminar de bloquear as contas com BSA. No dia seguinte, descarte a solução, resuspenja as contas em 200 microliters de armazenamento e tampão de diluição, para alcançar uma concentração aproximada de DNA de cinco micromolares, e, em seguida, transferir a solução com as contas para um novo tubo. Para obter o duplex DNA-RNA, prepare uma mistura de 10 microliteres em um tubo PCR com uma relação molar RNA-DNA de dois para um, como descrito no protocolo escrito.Coloque o tubo em um cicloviário térmico. Defina o programa para 45 graus Celsius por cinco minutos, seguido por 12 ciclos de dois minutos cada, começando em 43 graus Celsius e diminuindo a temperatura em dois graus Celsius por ciclo. Por último, mantenha-o ocioso a quatro graus Celsius.Para carregar a polimerase RNA purificada II no híbrido DNA-RNA, misture um microliter de DNA-RNA duplex com 13 microliters de tampão de polimerase II recém-preparado em um tubo. Adicione um microliter de polimerase RNA purificada II, e misture suavemente tubos para cima e para baixo e mexendo com a ponta da pipeta, sem introduzir bolhas. Incubar o tubo por 10 minutos a 30 graus Celsius.Para completar o complexo de alongamento, adicione um microliter de contas oligo de DNA não-modelo imobilizadas a 14 microliters de tampão de DNA não-modelo, adicione a mistura de 15 microliteres ao tubo previamente incubado e incuba-o por mais 10 minutos a 37 graus Celsius. Coloque a amostra no rack magnético por dois minutos. Lave a amostra uma vez com 30 microliters de tampão de lavagem para remover polimerase II e oligos não incorporados.Para radiolabelar os complexos de alongamento com RNA 23mers, adicione um microliter de ATP e um microliter de UTP radiolabeled a 23 microliters de tampão de pulso, e adicione essa mistura às contas magnéticas lavadas para resuspend. Incubar a reação por 10 minutos para permitir a síntese de 23mers radiolabeled. Adicione 1,5 microliters de solução contendo ATP de 100 micromolares e 100 micromolars UTP misture a 3,5 microliters de tampão de perseguição, e adicione a mistura ao tubo contendo complexos de alongamento pré-remontados em contas.Novamente, incubar o tubo por cinco minutos para perseguir todas as transcrições nascentes em 23mers. Em seguida, coloque o tubo sobre o rack magnético, e lave como foi feito anteriormente para remover nucleotídeos não incorporados. Resuspenja a amostra em 30 microliters de tampão de lavagem.Para gerar complexos de alongamento com transcrições mais longas, siga os procedimentos anteriores e aumente quatro vezes para gerar 120 microliters de complexos de alongamento lavados para quatro reações. Rotule três novos tubos 23mer, 25mer e 29mer. Transfira 30 microliters de complexos de alongamento lavados para o tubo de 23mer, e adicione 94 microliters de stop mix contendo proteinase K e glicogênio.Coloque o tubo contendo os 90 microliters restantes de complexos de alongamento lavados no rack magnético por dois minutos, remova o supernascer e resuspende as contas em 90 microliters de BTB complementados com 1,2 microliters de ATP e CTP. Incubar por 10 minutos a 30 graus Celsius. Depois de lavar com 90 microliters de tampão de lavagem, transfira 30 microliters de complexos de alongamento para o tubo de 25mer, e adicione 94 microliters de stop mix contendo proteinase K e glicogênio.Novamente, coloque o tubo contendo os 60 microliters restantes de complexos de alongamento no rack magnético por dois minutos. Repita o tratamento BTB com 60 microliters de tampão suplementados com 0,8 microliters de ATP e CTP. Após a incubação e lavagem como feito antes, resuspense a amostra em 60 microliters de tampão de lavagem.Transfira 30 microliters da amostra para o tubo de 29mer, e adicione 94 microliters de stop mix contendo proteinase K e glicogênio. Analise produtos de reação em um gel de poliacrilamida de desnaturação. Primeiro, gerar complexos de alongamento lavados contendo 23mers, escalando 13 vezes o procedimento descrito anteriormente para obter 390 microliters para 12 reações e um extra.Para realizar a fosforilação da CTD de polimerase II, remova o supernatante após colocar a amostra no rack magnético e resuspenja as contas em 377 microliters de BTB. Rotular dois novos tubos mais H e menos H.To mais H, adicionar três microliters do fator de iniciação de transcrição TFIIH na concentração de 300 nanogramas por microliter, e menos H, adicionar nove microliters de armazenamento e tampão de diluição. Adicione 87 microliters dos complexos de alongamento lavados ao tubo mais H e 261 microliters ao tubo menos H.Incubar os tubos por 10 minutos e lavar com tampão de lavagem. Para realizar o capping de RNA, adicione 87 microliters de mistura de tampa ao tubo mais H e 261 microliters ao tubo menos H para resuspend. Rotule quatro novos tubos, cinco mais H, cinco menos H, 15 menos H, e 45 menos H, e distribua três microliters de cinco, 15 ou 45 nanogramas por enzima de tampa microliter nos tubos correspondentes.Em seguida, prepare 12 novos tubos com 94 microliters de stop buffer. Inicie a primeira reação de capping adicionando 87 microliters de complexo de alongamento tratados com TFIIH ao tubo rotulado cinco mais H.Incubar a 30 graus Celsius em um bloco de calor. As reações de capping precisam ser precisamente cronometrdas usando um cronômetro.Ao trabalhar com múltiplas reações, os tempos de início para cada reação devem ser escalonados. Após um, dois ou quatro minutos, transfira 30 microliters da mistura de cinco mais reação para tubos rotulados um, dois e três contendo 94 microliters de buffer stop para parar as reações. Proceda com reações de capping para as amostras nos tubos menos H restantes exatamente da mesma maneira, utilizando complexos de alongamento tratados sem TFIIH.Analise produtos de reação em um gel de poliacrilamida de desnaturação. Um diagrama é mostrado aqui para moléculas de DNA e RNA em complexos de alongamento artificial. Utilizando o oligo RNA sintético de 20 nucleotídeos como primer de RNA durante a montagem dos complexos de alongamento artificial, nucleotídeos foram adicionados durante cada passo de caminhada sequencial do protocolo para gerar um 23mer, um 25mer e um 29mer.Foram comparadas reações utilizando polimerase RNA II de diferentes fontes. Os complexos de alongamento artificial foram montados com polimerase i e endógena, tipo selvagem, purificados de fígado de rato ou levedura de fissão e caminharam para gerar 23mers ou 25mers. Um ensaio foi realizado para medir o capping de transcrições radiolabeled associadas a complexos de alongamento artificial contendo 23 transcrições de nucleotídeos com um final triphosfato de cinco primos.As duas últimas pistas mostram os produtos das reações em que os complexos de alongamento foram incubados com ou sem enzima tampa na presença de TFIIH. As bandas mais lentas e mais rapidamente migratórias contêm transcrições tampadas e sem tampa, respectivamente. As primeiras 12 pistas mostram o capping de transcrições associadas a complexos de alongamento com um CTD fosforilado ou não fosforilado.As atividades de polimerase II e outras enzimas podem variar de preparação para preparação, por isso é necessário otimizar as condições de reação, titulando concentrações enzimáticas para definir níveis ideais. É importante usar material radioativo com segurança e evitar contaminação. Por favor, certifique-se de seguir suas diretrizes de laboratório e instituto ao fazer experimentos com radioatividade.

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Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

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