Name: Identificação e dissecção de diversos depósitos de Adipose de camundongo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 31 s
Description: Aprenda a dissecar depósitos de tecido adiposo em camundongos, incluindo BAT, WAT subcutâneo, visceral e popliteal. Este protocolo padronizado permite análises histológicas e de expressão gênica para estudos metabólicos.

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O.A.M. é apoiado por concessões de NIH DK062876 e DK092759; D.P.B. é apoiado pelo programa de treinamento de cientista médico da Universidade de Michigan (T32GM007863), programa de treinamento da Universidade de Michigan em organogênese (T32HD007605), Universidade de Michigan Rackham mérito Fellowship, e Tylenol futuro cuidados Fellowship.

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<li>Cinti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adipose+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Prostaglandins%2C+Leukotrienes%2C+and+Essential+Fatty+Acids%22%5BJournal%5D)">The adipose organ.</a> Prostaglandins, Leukotrienes, and Essential Fatty Acids. 73 (1), 9-15 (2005).</li>
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<li>Scheller, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Region-specific+variation+in+the+properties+of+skeletal+adipocytes+reveals+regulated+and+constitutive+marrow+adipose+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Region-specific variation in the properties of skeletal adipocytes reveals regulated and constitutive marrow adipose tissues.</a> Nature Communications. 6, 7808(2015).</li>
<li>Scheller, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+osmium+tetroxide+staining+with+microcomputerized+tomography+to+visualize+and+quantify+bone+marrow+adipose+tissue+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Use of osmium tetroxide staining with microcomputerized tomography to visualize and quantify bone marrow adipose tissue in vivo.</a> Methods in Enzymology. 537, 123-139 (2014).</li>
<li>Lukjanenko, L., Brachat, S., Pierrel, E., Lach-Trifilieff, E., Feige, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+profiling+reveals+that+transient+adipogenic+activation+is+a+hallmark+of+mouse+models+of+skeletal+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Genomic profiling reveals that transient adipogenic activation is a hallmark of mouse models of skeletal muscle regeneration.</a> PLoS One. 8 (8), e71084(2013).</li>
<li>Pagano, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+Regeneration+with+Intermuscular+Adipose+Tissue+%28IMAT%29+Accumulation+Is+Modulated+by+Mechanical+Constraints%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Muscle Regeneration with Intermuscular Adipose Tissue (IMAT) Accumulation Is Modulated by Mechanical Constraints.</a> PLoS One. 10 (12), e0144230(2015).</li>
<li>Khan, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intermuscular+and+perimuscular+fat+expansion+in+obesity+correlates+with+skeletal+muscle+T+cell+and+macrophage+infiltration+and+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Obesity%22%5BJournal%5D)">Intermuscular and perimuscular fat expansion in obesity correlates with skeletal muscle T cell and macrophage infiltration and insulin resistance.</a> International Journal of Obesity. 39 (11), 1607-1618 (2015).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Como a importância das diversas características moleculares e funcionais de clusters de adipócitos discretos é cada vez mais reconhecida, é crucial que os investigadores dentro do campo identifiquem uniformemente e distribuam depósitos adiposos para análises complementares. Até o momento, existem poucos protocolos para localização padronizada e isolamento da ampla gama de depósitos adiposos do mouse. Os métodos previamente publicados são centrados primeiramente em um ou dois depósitos e faltam os detalhes necessários par...

Os tecidos adiposos desempenham papéis críticos na homeostase do corpo inteiro, incluindo armazenamento e liberação de energia em resposta às necessidades locais e globais, termorregulação e secreção de adipocinas para regular o equilíbrio energético, metabolismo e respostas imunes1 , 2. os adipócitos são distribuídos por todo o corpo em depósitos discretos, e em alguns casos servem papéis especializados dentro de seus microambientes3,4,5. Historicamente, o estudo do tecido adiposo centrou-se no tecido adiposo branco (WAT), e seu papel na manutenção da homeostase energética. A maioria dos adipócitos são distribuídos por todo o corpo em depósitos de WAT subcutâneos e viscerais. As características desses depósitos são importantes para a suscetibilidade diferencial às doenças metabólicas. Os adipócitos subcutâneos, localizados a pele, têm sido associados a efeitos metabólicos protetores5. Os adipócitos viscerais, que cercam os órgãos vitais e estão contidos dentro dos depósitos gonadal, perirenal, retroperitoneal, omental e pericárdico, estão comumente ligados a distúrbios metabólicos, incluindo diabetes tipo 2 e doença cardiovascular2 . Os tecidos adiposos marrons (BAT) também foram estudados extensivamente. Marrom e marrom-como adipócitos expressam desacoplamento proteína 1 (UCP1) e desempenham papéis importantes na termogênese adaptativa e homeostase de glicose6,7. Os adipócitos marrons clássicos estão contidos no depósito interescapular BAT8. Aglomerados de adipócitos marrons também são encontrados em outros locais, incluindo os depósitos supraclavicular, infra/subescapular, cervical, paravertebral e periaórtico8,9.
Além de sua localização em grandes depósitos de WAT e BAT, os adipócitos existem em nichos discretos em todo o corpo4, onde podem desempenhar funções especializadas dentro de seus respectivos microambientes. Por exemplo, o tecido adiposo da medula óssea (BMAT) serve como um reservatório lipídico, é uma importante fonte de Adiponectina circulante, e interage estreitamente com osteoblastos, osteoclastos e células hematopoiéticas10,11. Os adipócitos dérmicos contribuem para processos generalizados, incluindo cicatrização de feridas, resposta imune, termorregulação e crescimento do folículo piloso12,13. Além disso, os adipócitos epicárdicos podem produzir várias adipocinas e quimiocinas que exercem efeitos locais e sistêmicos no desenvolvimento e progressão da doença arterial coronariana14. A expansão do WAT inter/intramuscular tem sido positivamente correlacionada com aumento da adiposidade, resistência insulínica sistêmica e diminuição da força muscular e da mobilidade15. Além disso, os adipócitos poplíteo servem como um reservatório lipídico para expansão linfática durante a infecção16. Enquanto os papéis específicos de diferentes depósitos articulares são geralmente desconhecidos, o depósito de Hoffa (infrapatelar) dentro do joelho é agora pensado para contribuir para patologias, incluindo dor no joelho anterior e osteoartrite17.
Considerando que as diferenças regionais no caráter e na função do adipócitos estão o estudo intenso, o campo é limitado atualmente pela falta de um protocolo estandardizado para a identificação e a dissecção de depósitos de rato diversos. Os métodos previamente publicados descreveram tipicamente a isolação de um ou dois depósitos específicos e faltam o nível de detalhe exigido para a excisão uniforme18,19. O protocolo descrito neste manuscrito fornece um guia detalhado para as posições anatômicas específicas e as etapas da isolação de muitos depósitos adiposos diferentes do rato. Embora os depósitos de WAT sejam o foco preliminar deste manuscrito, a excisão do bastão interescapular é descrita igualmente em detalhe. Os tecidos adiposos extirpado usando este protocolo podem ser usados para uma grande variedade de pontos finais experimentais, incluindo estudos do explante, histologia, e análises da expressão de Gene.
O objetivo deste manuscrito é fornecer aos pesquisadores um protocolo detalhado para identificar e isolar de forma clara e precisa os depósitos de adiposo de camundongo proeminentes e menos estudados (Figura 1). Este recurso facilitará uma investigação mais completa das características desenvolventes, moleculars, e funcionais dos adipócitos dentro dos nichos diversos.
<img alt="Diagrama de anatomia de roedores mostrando a localização do tecido adiposo; os detalhes incluem pericárdico, omental, TAB." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59499/59499fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figura 1: descrição esquemática dos depósitos adiposos do rato dissecados neste protocolo. Esta imagem foi adaptada de Bagchi et al., 20184. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59499/59499fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Formalina tamponada neutra a 10%</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-110-869</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 24 poços,</td><td>CLS3738</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td> não tratada</tr><tr><td>com etanol a 70% (diluído a partir de 95%)</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-226</td><td></td></tr><tr><td>Pinça de dissecação com pontas curvas</td><td>VWR</td><td>89259-946</td><td></td></tr><tr><td>Panela de dissecação</td><td>Carolina Biological Supply Company</td><td></td><td></td>629004</tr><tr><td>Tesoura de dissecação (ponta afiada/romba)</td><td>VWR</td><td>82027-588</td><td></td></tr><tr><td>Esponjas de gaze</td><td>Vitality Medical</td><td>2634</td><td>Curity Esponja de gaze de 4 polegadas x 4 polegadas, 12 camadas</td></tr><tr><td>Handi-Pins para dissecação</td><td>Carolina Biological Supply Company</td><td>629132</td><td></td></tr><tr><td>Iris tesoura (reta)</td><td>VWR</td><td>470018-890</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>VetOne</td><td></td><td></td>501017</tr><tr><td>Bisturi</td><td>VWR</td><td>100499-578</td><td>Cabo de bisturi de penas com lâmina, descartável</td></tr></tbody></table>

identificação e dissecção de diversos depósitos de adipose de camundongo

Identification and Dissection of Diverse Mouse Adipose Depots

Os tecidos adiposos são órgãos complexos com uma ampla gama de funções, incluindo armazenamento e mobilização de energia em resposta às necessidades locais e globais, desacoplamento do metabolismo para gerar calor, e secreção de adipocinas para regular a homeostase de corpo inteiro e respostas imunes. A pesquisa emergente está identificando diferenças regionais importantes nos perfis desenvolventes, moleculars, e funcionais dos adipócitos situados em depósitos discretos durante todo o corpo. As propriedades diferentes dos depósitos são medicamente relevantes desde que as doenças metabólicas demonstram frequentemente efeitos depósito-específicos. Este protocolo fornecerá investigadores com um guia anatômico detalhado do Atlas e da dissecção para a identificação e a excisão reprodutíveis e exatas de vários tecidos adiposos do rato. A dissecção padronizada de depósitos adiposos discretos permitirá comparações detalhadas de suas características moleculares e metabólicas e contribuições para estados patológicos locais e sistêmicos várias condições nutricionais e ambientais.

A identificação e a isolação bem sucedidas de vários depósitos adiposos do rato podem ser conseguidas usando o protocolo descrito acima. As localizações anatômicas brutas dos depósitos subcutâneo (A, E-F), marrom (B), visceral (C, D, G-J) e poplíteo (K) são mostradas na Figura 2.
<img alt="Imagens de dissecção de anatomia; marcação de órgãos internos, estudo de biologia educacional, morfologia compa...

Os adipocytes existem em depósitos discretos e têm papéis diversos dentro de seus microambientes originais. Como as diferenças regionais no caráter e na função do adipócitos são descobertas, a identificação estandardizada e a isolação dos depósitos são cruciais para o avanço do campo. Nisto, nós apresentamos um protocolo detalhado para a excisão de vários depósitos adiposos do rato.

Identificação e dissecção de diversos depósitos de Adipose de camundongo

Adipose tissues are complex organs with a wide array of functions, including storage and mobilization of energy in response to local and global needs, ...

Uma metodologia padronizada para identificar e dissecar depósitos adiposos em todo o corpo é fundamental para a investigação de diferenças de caráter e função de adipócitos dentro de nichos anatômicos discretos. A principal vantagem dessa técnica é que ela é um método confiável e preciso para identificar e extirver tanto depósitos de adipose de roedores comuns quanto menos estudados. Para a identificação e isolamento do BAT interscapular, use uma tesoura de íris para cortar horizontalmente ao longo da borda inferior do tecido subcutâneo anterior de um rato eutanizado seguindo a borda natural do depósito.Faça duas incisões verticais ao longo das bordas laterais do depósito seguindo as bordas naturais do tecido. Use fórceps para virar cuidadosamente o depósito para revelar o tecido adiposo marrom interscapular em forma de borboleta embutido no tecido adiposo branco. Em seguida, dissecar cuidadosamente o BAT longe do WAT circundante.Armazene tecidos adiposos em recipientes apropriados para análise a jusante. Para a identificação e isolamento do WAT subcutâneo posterior, coloque o rato na posição supina e proteja os membros do animal. Use fórceps para levantar a pele na base do esterno e fazer uma incisão de pele de um milímetro.Insira uma lâmina da tesoura de íris no corte e faça uma incisão de pele média de quatro a cinco centímetros começando na base do esterno e subindo até a base da cauda. Em seguida, faça duas incisões horizontais de um centímetro na parte superior da incisão vertical inicial estendendo-se lateralmente da linha média. Use os fórceps para retirar cuidadosamente a pele da cavidade peritoneal, use a perna para localizar o WAT subcutâneo posterior que deve permanecer associado à pele.Fixar a pele estendida e extirpar completamente o depósito wat inguinal triangular da base da retalho traseira ventrally através da virilha. Para identificação e isolamento viscerais do depósito wat, use fórceps para levantar a fina parede da cavidade peritenêa na base do esterno e fazer uma incisão de um milímetro no tecido tented. Insira uma lâmina da tesoura de íris no corte e faça uma incisão vertical descendente de quatro a cinco centímetros do topo da cavidade peritoneal até o reto.Faça duas incisões horizontais de um centímetro na parte superior e inferior da incisão vertical estendendo-se lateralmente da linha média e use os fórceps para retirar o peritônio para expor o conteúdo da cavidade abdominal. Em seguida, fixar o peritônio estendido na panela de dissecção para colher os depósitos wat contidos dentro da cavidade peritoneal. Para a identificação e isolamento do WAT gonadal visceral, localize as gôndas e use fórceps para levantar o WAT gonadal associado, em seguida, use a tesoura de íris para extirir cuidadosamente o WAT das gôndas.Para extirer o depósito perirenal, localize o rim e use fórceps para levantar o tecido renal. Puxe o rim para a linha média para ver uma divisão clara entre os depósitos perirenal e retroperitoneal e extir essa a WAT diretamente associada aos rins. Em seguida, remova as glândulas suprarrenais localizadas acima dos rins do WAT.Para identificação e isolamento de WAT retroperitoneal, levante o rim para a linha média novamente e use uma tesoura de íris para dissecar cuidadosamente o WAT retroperitoneal da parede peritoneal posterior. Para isolar o WAT popliteal, coloque a patela contra a panela de dissecção tomando cuidado para que a fossa popliteal na parte de trás do joelho esteja voltada para cima. Use a tesoura de íris para remover cuidadosamente a pele da base da mola traseira ao pé.Use a tesoura de íris para fazer um corte na borda inferior das cabeças medial e lateral do músculo gastrocnemius, use os fórceps para levantar o músculo para revelar o depósito popliteal triangular. Em seguida, use uma tesoura de íris para extircular o depósito ao longo das bordas naturais do tecido. Aqui, são mostrados os locais anatômicos brutos de depósitos subcutâneos, marrons, viscerais e popliteais.As características histológicas dos depósitos de adiposos subcutâneos, marrons, viscerais, popliteais, constitutivos e regulados da medula, depósitos de adiposos intramusculares e infrapatos podem ser avaliados pelos protocolos padrão de coloração de Hematoxylin e Eosin. Os tecidos adiposos isolados usando este protocolo podem ser usados para uma grande variedade de pontos finais experimentais, incluindo análise histológica, estudos moleculares e análise de expressão genética e proteica. A padronização em todo o campo da identificação de diversos depósitos adiposos nos ajudará, sem dúvida, a aprofundar nossa compreensão de suas características moleculares e metabólicas e suas contribuições diferenciais para estados patológicos locais e sistemáticos.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Neste vídeo, demonstramos o procedimento cirúrgico para isolar o tecido adiposo branco subcutâneo e o tecido adiposo marrom interescapular de um camundongo recém-nascido.

Coleção de depósito adiposo branco e marrom do filhote de rato: um procedimento cirúrgico para colher o tecido adiposo branco e o tecido adiposo marrom do filhote de camundongo

Devido à conexão drástica e negativa entre a obesidade e outras comorbidades, a investigação sobre o papel adiposo desempenha na doença e na saúde global é garantido. Apresenta-se um protocolo para o isolamento e a excisão de depósitos adiposos que permitam o estudo de tecido adiposo usando in situ e in vitro.

Localização, identificação e excisão de Depots Murino adiposo

O tecido adiposo (TA) pode influenciar a homeostase de todo o corpo, portanto, entender os mecanismos moleculares de diferenciação e função dos adipócitos é importante. Fornecemos um protocolo para obter novos insights sobre esses processos, analisando a homeostase, diferenciação e exposição à hipóxia dos adipócitos como um modelo para a apoptose induzida de adipócitos.

Mecanismo do Regulamento de Números de adipócitos em adultos Organismos através da diferenciação e apoptose homeostase

O objetivo deste trabalho é apresentar um procedimento passo a passo para coletar os diferentes tecidos adiposo brancos de ratos, processar as amostras de gordura e extrair o RNA.

Coleção de tecido adiposo de mouse e processamento para análise de RNA

Este protocolo descreve a abordagem técnica para isolar subpopulações de células estromais adipogênicas e fibroinflamatórias de depósitos de tecido adiposo branco intra-abdominal murino (WAT) por classificação de células ativadas por fluorescência ou separação de esferas imunomagnéticas.

Isolamento de Subpopulações de Células Estromais Adipogênicas e Fibro-Inflamatórias de Depósitos Adiposos Intra-Abdominais Murinos

Aqui, descrevemos um método simples, barato e rápido de limpeza para resolver a estrutura 3D do tecido adiposo branco e camundongo usando uma combinação de marcadores para visualizar vasculatura, núcleos, células imunes, neurônios e proteínas de casaco de gotícula lipídica por imagem fluorescente.

Explorando estrutura tecidual adiposa por limpeza de metilsalicylate e imagem 3D

Este relatório descreve um protocolo para o isolamento simultâneo de preadipócitos primários marrons e brancos de camundongos recém-nascidos. Células isoladas podem ser cultivadas na cultura e induzidas a se diferenciar em adipócitos brancos e marrons totalmente maduros. O método permite a caracterização genética, molecular e funcional das células de gordura primárias na cultura.

Isolamento e diferenciação de preadipócitos brancos e marrons primários de camundongos recém-nascidos

Este protocolo detalha um método para a dissecção de depósitos adiposos de camundongos e o isolamento e digestão das respectivas artérias para liberar e, em seguida, identificar a população de células endoteliais. Células recém-isoladas usadas em aplicações a jusante avançarão na compreensão da biologia celular vascular e dos mecanismos de disfunção vascular.

Isolamento e Identificação de Células Endoteliais Vasculares de Depósitos Adiposos Distintos para Aplicações a Jusante

Os pré-adipócitos são isolados da fração vascular estromal do tecido adiposo marrom interescapular de camundongos recém-nascidos e diferenciados em células que acumulam gotículas lipídicas, expressam marcadores moleculares e mostram a morfologia mitocondrial de adipócitos marrons maduros. Essas células são posteriormente analisadas por imunofluorescência e microscopia eletrônica de transmissão.

Diferenciação e imagem de adipócitos marrons da fração vascular estromal do tecido adiposo interescapular de camundongos recém-nascidos

Aqui, fornecemos um procedimento prático para dissecar e realizar análises histológicas e de expressão gênica do tecido adiposo marrom supraclavicular murino.

Dissecção, processamento histológico e análise da expressão gênica do tecido adiposo marrom supraclavicular murino

O tamanho e a fragilidade dos adipócitos maduros limitaram as técnicas e ferramentas disponíveis para seu estudo e isolamento. Aqui, é descrito um protocolo para o isolamento de adipócitos murinos maduros, que pode ser facilmente adaptado para diferentes depósitos adiposos e dietas de camundongos.

Isolamento e cultura de adipócitos murinos primários de camundongos magros e obesos

Aprenda a dissecar depósitos de tecido adiposo em camundongos, incluindo BAT, WAT subcutâneo, visceral e popliteal. Este protocolo padronizado permite análises histológicas e de expressão gênica para estudos metabólicos.

Identificação e dissecção de diversos depósitos de Adipose de camundongo

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