Name: Cultivando e medindo ossos longos de murine fetal e recém-nascido (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 58 s
Description: Aprenda a cultivar ossos longos de murinos fetais e recém-nascidos ex vivo para estudar o desenvolvimento ósseo e cartilaginoso. Esta técnica permite manipulação direta, imagem em tempo real e análise de efeitos genéticos locais.

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Gostaríamos de agradecer a Alexandra Joyner pelo seu apoio quando este protocolo estava a ser estabelecido, Edwina McGlinn e Yi-Cheng Chang por partilharem o ácido retinóico. O Instituto australiano de medicina regenerativa é apoiado por subsídios do governo estadual de Victoria e do governo australiano.

Todos os experimentos devem ser realizados seguindo as diretrizes governamentais e institucionais locais de manejo ético de animais de laboratório.
1. preparações antes do dia da cultura óssea
<ol><li>Configurar temporizações cronometradas do rato para obter fetos e filhotes de 14,5 do dia embrionário (E 14.5) e avante. Nota: A cultura de ossos longos pode ser aplicada com sucesso a diferentes cepas de camundongo; no presente protocolo, são usados ratos suíços de tipo selvagem da raça Webster.</li>
	<li>Prepare o meio de dissecção (adaptado de Houston et al.15): diluir α-meio essencial mínimo (α-mem) ou o meio de águia modificado de Dulbecco (dmem) 1/13 em soro fisiológico com tampão fosfato (PBS) e 2 mg/ml de albumina sérica bovina (BSA) e esterilizar filtro através de um 0,22 μm, filtro de seringa de 33 mm de diâmetro. Armazene alíquotas a-20 ° c.</li>
	<li>O dia antes da extração dos fetos, prepare o meio de cultura óssea livre de soro composto por DMEM contendo 0,2% de BSA, 0,5 mM L-glutamina, 40 U/mL de penicilina/estreptomicina, 0, 5 mg/mL de ácido ascórbico e 1 mM de betaglicerofosfato. Filtre esterilize através de um 0,22 μm, filtro da seringa do diâmetro de 33 milímetros e armazene em 4 ° c por até 1 mês.</li>
	<li>No dia da cultura e antes do abate do rato, prepare placas de 24 poços e pratos de 60 mm com meio de dissecção e mantenha-os gelados. Pré-aqueça o meio de cultura óssea em um banho de água de 37 ° c. Spray de 80% (v/v) etanol nas ferramentas (pinças e pequenas tesouras) para ser usado para a manipulação do feto. Transfira um espaço binocular a um armário da Biossegurança da classe II.</li>
</ol>2. cultura do feto e tíbia e fêmur recém-nascidos
<ol><li>Cull o rato grávido através da deslocação cervical na fase gestacional desejada (variando de E 14.5 a E 18.5). Se os filhotes recém-nascidos são usados, removê-los da mãe um por um e cull por decapitação.</li>
	<li>Coloque o mouse sobre as costas e esterilizar a região abdominal por pulverização 80% (v/v) etanol em sua superfície.</li>
	<li>Corte a pele e o músculo abdominal com pequenas tesouras para acessar os chifres uterinos.</li>
	<li>Extraia o útero da cavidade abdominal com a ajuda de pinças e pequenas tesouras, removendo o mesométrio e cortando a base dos chifres. Coloque o útero em uma placa de Petri de 60 mm com meio de dissecção gelada e mantenha o prato de cultura no gelo durante todo o procedimento.</li>
	<li>Transfira a placa de Petri com o útero para o gabinete de biossegurança e trabalhe lá a partir de agora.</li>
	<li>Separe os fetos individuais com tesouras cortando entre as SACs.</li>
	<li>Transfira o saco individual um estereomicroscópio da dissecção em um prato limpo de 60 milímetros com meio da dissecção e abra-os acima com pinças para separar os feto das placentas e para limpá-los das membranas. Nota: Trabalhe com um embrião de cada vez, mantendo o resto no gelo.</li>
	<li>Decapitar os fetos e transferir o corpo para um novo prato limpo de 60 mm com uma pipeta estéril cortada em 1 mL.</li>
	<li>Retire a pele dos fetos ou filhotes com pinças a partir da parte de trás e descascando-o para fora até os dedos do pé.</li>
	<li>Separe os membros posteriores do corpo cortando com as pinças próximas da coluna vertebral e transfira-as para um prato limpo com meio de dissecção gelada.</li>
	<li>Separe a tíbia do fêmur com pinças, introduzindo-as cuidadosamente entre a cartilagem superficial do fêmur distal e a tíbia proximal.</li>
	<li>Retire os ossos da anca do fêmur proximal e do osso calcâneo e a fíbula da tíbia.</li>
	<li>Retire cuidadosamente o tecido mole do fêmur e da tíbia por beliscando e puxando-o. Nota: É importante remover o máximo de tecido mole possível, tomando cuidado especial na remoção do tecido que conecta os dois pólos de cartilagem, mas evitando danificar a cartilagem, o pericôndrio, e os ossos.</li>
	<li>Coloque os quatro ossos (tíbias esquerda e direita e fêmures) no primeiro poço da placa de 24 poços com uma pipeta estéril de plástico de 1 ml. Alternativamente, para comparar o efeito de diferentes tratamentos em Membros esquerdos e direitos, coloque Membros contralaterais em diferentes poços. Nota: O cuidado extra deve ser tomado quando os ossos são transferidos aos poços, porque podem facilmente furar à pipeta.</li>
	<li>Proceda da mesma forma com o número de fetos que for necessário. Nota: Mude o prato com o meio da dissecção assim que começ demasiado clouded, porque é importante ver claramente os ossos dissecados.</li>
	<li>
Quando todos os ossos desejados forem transferidos para os poços, retire o meio de dissecção com uma pipeta estéril de 1 mL de plástico e tome cuidado extra para não aspirar os ossos.
	<ol>
<li>Dependendo da finalidade do experimento, fotos podem ser tiradas dos ossos antes de remover o meio de dissecção, como ponto de tempo zero do experimento. Tire fotografias com um microscópio ligado a uma câmara digital e anote a exposição e a escala utilizadas. Para garantir medições fáceis e confiáveis, tire fotos com bom contraste para distinguir a parte mineralizada.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Adicione 1 mL de meio de cultura a cada poço. Se qualquer tratamento é destinado aos ossos (doxiciclina, tamoxifeno, fatores de crescimento, etc.), ele deve ser adicionado agora.</li>
	<li>Para observar o efeito da inibição do crescimento nas condições de cultura, tratar a tíbias esquerda com ácido retinóico (ra, 500 nm), enquanto incubando a tíbias direita com um volume equivalente de veículo (dimetil sulfóxido [DMSO], concentração final 0,1%) como um controle.</li>
	<li>Deixe os ossos crescer por dois dias ou mais em uma incubadora da cultura de pilha condições padrão da cultura de pilha (em 37 ° c em uma incubadora de 5% CO2 ).</li>
	<li>Para avaliar a proliferação, adicione 5-ethynyl-2 '-deoxyuridine (EdU) ou 5-bromo-2 '-deoxyuridine (BrdU) ao meio em uma concentração final de 10 μM 1 − 2 h antes da fixação. Nota: A concentração conservada em estoque de EdU é 20 milímetros. Cuidado: EdU e BrdU são análogos da timidina e podem ser tóxicos e mutagênicos.</li>
	<li>Descongelar 4% paraformaldeído (PFA) e fixar os ossos por imersão em PFA em tubos individuais de 2 mL. Cuidado: A PFA é tóxica e designada como um provável carcinógeno humano. Evite respirar paraformaldeído em pó e vapores. EdU e BrdU são análogos da timidina e podem ser tóxicos e mutagênicos.</li>
	<li>Após uma breve fixação de 10 min em PFA à temperatura ambiente, transfira os ossos para PBS para aquisição de imagens no ponto temporal final. Em seguida, coloque os ossos de volta na PFA para fixar durante a noite a 4 ° c.</li>
	<li>Depois que os ossos da fixação podem ser processados para aplicações a jusante desejadas.</li>
</ol>3. mensuração e análise do comprimento total do osso e da região mineralizada
<ol><li>Use um software de edição de imagem para medir o comprimento dos ossos, levando em conta a escala da imagem. Meça tanto o comprimento total do osso quanto a região mineralizada. Comece as medições das primeiras células escuras em uma extremidade até os últimos na outra extremidade. Nota: A região mineralizada é caracterizada pela cor mais escura e é facilmente distinguida da cartilagem.</li>
	<li>Para calcular a taxa de crescimento, definida como o aumento médio de comprimento por dia, divida a diferença entre o comprimento final do osso e o inicial pelo número de dias na cultura.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Os métodos de cultura óssea ex vivo têm sido usados há algum tempo para avaliar a biologia do crescimento ósseo28, mas raramente foram aplicados aos ossos longos murinos. Com o desenvolvimento de técnicas de imagem, a cultura óssea ex vivo oferece uma maneira atrativa de estudar o crescimento ósseo em tempo real em um cenário que se assemelha às condições in vivo. Neste cenário, é importante definir as condições em que o crescimento dos ossos longos é comparável ao seu crescimento in vivo.
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O crescimento de órgãos tem de ser firmemente afinado para evitar o aparecimento de distúrbios de crescimento, e envolve a regulação de vários tipos de células, vias moleculares e conversa cruzada entre diferentes partes do corpo. Técnicas de imagem são essenciais para abordar as mudanças que ocorrem ao longo do tempo em um embrião em crescimento, tanto em condições normais, bem como após uma perturbação é induzida no sistema. Embriões com desenvolvimento intrauterino, como os modelos de roedores amplamente utilizados, apresentam um desafio adicional para a imagem ao vivo e tratamento medicamentoso, que pode ser parcialmente superado pelo uso de técnicas de cultura ex vivo. Para recapitular com sucesso os processos in vivo e obter resultados significativos, torna-se crucial encontrar as condições de cultivo certas para cada órgão ou tecido.
A maioria dos ossos do esqueleto de mamíferos cresce através da ossificação endocondral, onde a cartilagem embrionária (composta de células denominadas condrócitos) impulsiona o crescimento longitudinal e é gradualmente substituída pelo osso. Esse processo ocorre nas placas de crescimento, localizadas no final dos ossos longos, onde três zonas podem ser distinguidas: repouso, proliferativa e hipertrófica1,2. Primeiramente, os condrócitos redondos do progenitoras na transição da zona descansando nos condrócitos colunar de ciclagem na zona proliferative. Durante a fase seguinte da diferenciação, estes condrócitos tornam-se hipertrófica e começam secretoras o tipo colagénio de X. Os condrócitos hipertróficos orquestram as etapas subsequentes da ossificação: secretam moléculas-chave de sinalização, como fator de crescimento do tecido conjuntivo, proteínas morfogenéticas ósseas e ouriço indiano, e dirigem a mineralização da matriz, recrutam os vasos sanguíneos para a parte central do osso, e, após a apoptose, permitem osteoblastos (células formadoras de osso) para invadir a matriz para formar o centro de ossificação primária3,4. A matriz mineralizada facilita a penetração dos vasos sanguíneos através dos quais os osteoblastos migram para substituir esta cartilagem degradada por uma matriz óssea5. A maioria dos osteoblastos invade a matriz cartilaginosa do pericôndrio, uma camada fibrosa que envolve a cartilagem6. Alternativamente, uma proporção de condrócitos hipertróficos é capaz de sobreviver e transdiferenciar a osteoblastos7,8,9. O comprimento final do osso é devido ao crescimento acumulado da cartilagem transitória, cuja taxa de crescimento por sua vez depende do número e tamanho dos condrócitos hipertróficos, e sua produção matricial10. Adicionalmente, foi demonstrado recentemente que a duração da última fase de hipertrofia correlaciona-se com o comprimento final do osso11. Conseqüentemente, a regulação apertada da proliferação e da diferenciação destas pilhas é exigida para assegurar o tamanho apropriado do osso.
Apesar do conhecimento substancial adquirido ao longo dos anos sobre a organização e o desenvolvimento das placas de crescimento, a maioria destas conclusões baseiam-se na observação de secções histológicas fixas. O corte de tecidos fornece informações valiosas sobre esse processo, mas pode ser montado com artefatos técnicos, por isso não pode ser sempre confiável usado para estimar alterações morfológicas ou de tamanho entre diferentes estágios. Adicionalmente, porque o crescimento do osso é um processo dinâmico, as imagens bidimensionais (2D) estáticas oferecem uma introspecção limitada no movimento das pilhas na placa do crescimento, quando a imagem latente do tempo-lapso no tecido vivo poderia oferecer a informação valiosa no comportamento do condrócitos na placa de crescimento.
Todas essas limitações podem ser potencialmente resolvidas usando culturas ósseas ex vivo. Quando os protocolos da cultura do osso forem desenvolvidos alguma hora há, foram aplicados limitadamente aos ossos longos murino. A maioria dos estudos utiliza ossos de pintinhos devido às vantagens técnicas oferecidas pelo modelo de pintainho12,13. Culturas organotípicas (interface ar/líquido) foram aplicadas a fêmures embrionárias de pintinhos, mantidas em cultura por 10 dias14. As sofisticadas ferramentas genéticas disponíveis no mouse tornam este modelo muito atraente para ser usado na cultura óssea ex vivo. Os estudos que utilizaram camundongos para olhar para o crescimento ósseo trabalharam principalmente com os ossos do metatarso15, provavelmente devido ao seu tamanho pequeno e maiores números obtidos por embrião16. Embora tradicionalmente considerados ossos longos, metatarsos entram em senescência (caracterizada pela redução da proliferação e involução da placa de crescimento17) mais cedo do que outros ossos longos in vivo, e, portanto, o seu crescimento contínuo ex vivo não realmente recapitular o processo in vivo. Para os propósitos deste artigo, usaremos o termo ossos longos para ossos das regiões proximal e intermediária do membro. Vários estudos prévios utilizaram ossos murinos longos, como a tíbia, em culturas ex vivo e observaram um crescimento substancial da cartilagem, mas pouca ossificação18. Também utilizamos culturas tibiais recentemente, principalmente para estudar a dinâmica do condrócitos19. Outros estudos utilizaram cabeças femorais de camundongos jovens20 ou apenas a parte distal do fêmur para cultura21. Alguns trabalhos mais recentes combinam com sucesso a cultura ex vivo de ossos cheios com imagens de lapso temporal para adquirir filmes tridimensionais (3D) de condrócitos em tecido vivo de camundongo22,23. Os autores conseguiram observar eventos previamente despercebidos no rearranjo de condrócitos para a zona proliferativa23 em um bom exemplo da potencial aplicação da cultura óssea ex vivo. A alternativa, ou seja, analisando imagens estáticas, requer técnicas indiretas e complexas. Isto foi exemplificado por um estudo recente avaliando a importância de clones transgénicos orientados para o crescimento da cartilagem, onde o traçado genético com cepas multicolor do rato do repórter acoplados com modelagem matemática foi usado24. Portanto, a cultura ex vivo pode ajudar a obter insights sobre processos dinâmicos de forma mais rápida e direta.
Aqui, nós apresentamos um método para a cultura longa dos ossos murino, que pode ser combinada com os tratamentos moleculars diferentes e/ou com imagem latente viva do tempo-lapso. Este protocolo adapta os métodos utilizados nos relatórios anteriores15,18,25, mas aborda alguns problemas adicionais e se concentra em ossos longos, como a tíbia, ao invés de ossos metatarsais. Por fim, explora o potencial do uso de comparações pareadas estatisticamente poderosas, cultivando ossos esquerdos e direitos separadamente na presença de diferentes substâncias.

<table><tbody><tr><td>5-Etinil-2'-desoxiuridina</td><td>Santa Cruz</td><td>CAS 61135-33-9</td><td></td></tr><tr><td>5-Bromo-2&prime;-desoxiuridina</td><td>Sigma</td><td>B5002</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de Centrífuga Cônicos de 50 mL Falcon</td><td></td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Prato de Cultura de Órgãos de Poço Central tratado com TC de 60 mm, 20/Pacote, 500/Caixa, Falcão Estéril</td><td></td><td>353037</td><td></td></tr><tr><td>Adobe Photoshop</td><td>Adobe</td><td>CS4</td><td></td></tr><tr><td>Ácido ascórbico</td><td>Sigma</td><td>A92902</td><td></td></tr><tr><td>Unidade de base para o escopo</td><td>Zeiss</td><td>435425-9100-000</td><td></td></tr><tr><td>Betaglicerofosfato</td><td>Sigma</td><td>G9422</td><td></td></tr><tr><td>Escopo binocular</td><td>Zeiss</td><td>STEMI-2000</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA) fração v</td><td>Roche/Sigma</td><td>10735086001</td><td></td></tr><tr><td>DigiRetina 500 câmera</td><td>Kit</td> de dissecação Aunet <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Cumper Robbins</td><td>PFS00034</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11960044</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 2 tubos mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030120094</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 96%</td> <td>Merk</td><td>159010</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps Dumont # 5 Inox08</td><td>Ferramentas de Belas Ciências</td><td>T05811</td><td></td></tr><tr><td>Heracell 150 CO2 incubadora</td><td>Thermo Fisher</td><td>51026282</td><td></td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium Eagle</td><td>Sigma</td><td>M2279</td><td></td></tr><tr><td>Multiwell 24 poços</td><td>Falcon</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de plástico 1 mL Estéril Embalado individualmente</td><td>Thermo</td><td>273</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de seringa 0,2 um</td><td>Life Sciences</td><td>PN4612</td><td></td></tr><tr><td>Seringa Terumo 20 mL</td><td>Terumo</td><td>DVR-5174</td><td></td></tr><tr><td>Tretinoína (ácido retinóico)</td><td>Sigma</td><td>PHR1187-3X</td><td></td></tr><tr><td>Endoscópio trinocular</td><td>Aunet</td><td>AZS400T</td><td></td></tr></tbody></table>

cultivando e medindo ossos longos de murine fetal e recém-nascido

Culturing and Measuring Fetal and Newborn Murine Long Bones

Os ossos longos são estruturas complexas e dinâmicas, que surgem da ossificação endocondral através de um intermediário de cartilagem. O acesso limitado aos ossos humanos saudáveis torna particularmente valioso o uso de modelos de mamíferos, como rato e rato, para olhar em diferentes aspectos do crescimento ósseo e homeostase. Além disso, o desenvolvimento de ferramentas genéticas sofisticadas em camundongos permite estudos mais complexos de crescimento ósseo longo e pede uma expansão das técnicas utilizadas para estudar o crescimento ósseo. Aqui, nós apresentamos um protocolo detalhado para a cultura de osso murino ex vivo, que permite o estudo do osso e da cartilagem em uma maneira firmemente controlada ao recapitulando a maioria do processo in vivo. O método descrito permite a cultura de uma gama de ossos, incluindo tíbia, fêmur e ossos metatársicos, mas temos focado principalmente na cultura tibial aqui. Além disso, pode ser usado em combinação com outras técnicas, tais como a imagem latente viva do tempo-lapso ou o tratamento da droga.

A cultura óssea pode ser realizada a partir de diferentes estágios. Na Figura 1a-D, é mostrada uma comparação entre a tíbia cultivada e as recém-extraídas em estágios equivalentes. A primeira observação é que até dois dias de cultura o tamanho alcançado é comparável ao crescimento ósseo in vivo para cartilagem e osso mineralizado (Figura 1a, B, D). Períodos de cultura mais longos levam a maiores ...

Aqui, nós apresentamos um método para a cultura ex vivo de ossos murino longos em estágios fetal e recém-nascido, apropriados para analisar o desenvolvimento do osso e da cartilagem e o homeostase em circunstâncias controladas ao recapitulando o processo in vivo.

Cultivando e medindo ossos longos de murine fetal e recém-nascido

Long bones are complex and dynamic structures, which arise from endochondral ossification via a cartilage intermediate. The limited access to healthy ...

Este método adapta o protocolo de cultura metatarsal a ossos maiores, permitindo que a manipulação óssea direta seja combinada com modelos genéticos complexos para abordar processos relacionados ao desenvolvimento ósseo. Essa técnica permite a manipulação e análise do crescimento ósseo que não são possíveis in vivo, como imagem viva ou manipulação física direta e farmacológica. Este método de cultura ex vivo permite o estudo específico dos efeitos locais do inset genético no osso que o separa do efeito sistêmico que o tratamento tem sobre o organismo.Comece esterilizando a região abdominal de um dia gestacional gestante de 14,5 a 18,5 camundongos com 80% de etanol e usando uma tesoura pequena para abrir a pele e os músculos abdominais para acessar os chifres uterinos. Para extrair o útero da cavidade abdominal, remova o mesometrium e corte a base dos chifres. Em seguida, transfira o útero para uma placa de petri de 60 milímetros contendo meio de dissecção gelada no gelo.Em um armário de biossegurança cortado entre os sacos com tesouras para separar os fetos individuais, e transferir um saco individual para um novo prato de 60 milímetros com meio de dissecção fresco sob um microscópio estereo de dissecção. Use pinças para separar os fetos das placentas e limpar os fetos das membranas. Use uma pipeta de plástico aparada para transferir o corpo para um novo prato de 60 milímetros, e decapitule o embrião antes de uma dissecção adicional.Em seguida, use pinças para remover a pele, começando pelas costas e descascando para os dedos dos dedos. Use a pinça para cortar perto da coluna vertebral e separar os membros traseiros do corpo. Transfira os membros traseiros para um prato limpo contendo meio de dissecção gelada e insira a pinça entre a cartilagem superficial do fêmur distal e a tíbia proximal para separar a tíbia do fêmur.Remova os ossos do quadril do fêmur proximal e do osso calcâneo e da fíbula da tíbia. Corte cuidadosamente e puxe os tecidos moles dos fêmures e tíbias e use uma pipeta estéril de um mililitro para transferir todos os quatro ossos das pernas para o primeiro poço de uma placa de 24 poços contendo meio de dissecção fresco. É importante mostrar que o tecido mole que liga o pulso do osso é removido.Caso contrário, o osso se dobrará e não alcançará o crescimento adequado. Quando os ossos são dissecados a partir do número experimental adequado de fetos, imagem os ossos em cada poço às vezes zero sob um microscópio leve com um bom contraste e substituir o meio de dissecção em cada poço com um mililitro de cultura médio por poço tomando cuidado extra para não aspirar os ossos. Para observar o efeito da inibição do crescimento nas condições de cultura, trate as tíbias esquerdas com 500 ácidos retinóicos nanomolares e incubar as tíbias direitas com um volume equivalente de veículo como controle.Em seguida, coloque a placa em uma incubadora de cultura celular sob condições padrão de cultura celular. Após dois dias, trate os ossos com um análogo de timmidina apropriado por uma a duas horas para avaliar a proliferação celular óssea antes de transferir os ossos para tubos individuais de dois mililitros de 4% de paraformaldeído por 10 minutos. Em seguida, transfira os ossos para PBS para a imagem dos ossos no momento final antes de devolver as amostras ao paraformaldeído para fixação durante a noite a quatro graus Celsius.Para medir o comprimento e a região mineralizada dos ossos, abra um programa de software de imagem adequado e, levando em conta a escala da imagem, meça tanto o comprimento total do osso quanto a região mineralizada. Começando as medições das primeiras células escuras em uma extremidade até as últimas células escuras na outra extremidade. Para calcular a taxa de crescimento definida como o aumento médio do comprimento por dia, divida a diferença entre o comprimento final do osso e o comprimento inicial pelo número de dias na cultura.Aqui, uma comparação entre tíbia cultivada e tíbia recém-extraída em estágios equivalentes é mostrada. Após até dois dias de cultura, o tamanho alcançado é comparável ao crescimento ósseo in vivo tanto para a cartilagem quanto para o osso mineralizado. Períodos de cultura mais longos levam a maiores diferenças entre os ossos cultivados e ossos recém-extraídos.Note que a tíbia cultivada com uma remoção incompleta do tecido mole pode resultar em dobra da tíbia cultivada. O tratamento com ácido retinóico tem um efeito robusto no crescimento tibial logo após dois dias de tratamento. Embora haja um aumento consistente no comprimento total da tíbia após dois dias na cultura, esse crescimento corresponde a um aumento aproximado de apenas nove a 29% do comprimento inicial.Menos do que o aumento do crescimento ósseo que seria observado in vivo. De fato, a rotulagem analógica da timmidina mostra menos células positivas nesta região após a cultura em comparação com ossos recém-extraídos de um estágio equivalente. Além disso, na tíbia cultivada in vitro, o comprimento total do elemento esquelético aumenta substancialmente, enquanto quase nenhum aumento na região mineralizada é observado.Além da análise histológica e molecular, o desmatamento e a imagem 3D podem ser realizados após a cultura para caracterizar o efeito celular dos tratamentos aplicados aos ossos cultivados. A técnica nos permite abordar questões relacionadas à comunicação interorganal. Por exemplo, co-esculpindo ossos dos diferentes modelos genéticos em algum tipo de experimento de parabiose sem dor.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Este protocolo descreve um procedimento para amostragem seriada da medula óssea (MO) femoral sem exigir o sacrifício de camundongos. Este procedimento facilita estudos longitudinais da composição da MO de camundongos ao longo do tempo e fornece acesso serial às células dentro da MO para estudos ex vivo e de transplante.

Femoral Medula Óssea aspiração Live Ratos

Aqui apresentamos um protocolo para a dissecção de ossos longos de membros posteriores (fêmures e tíbias) do camundongo de laboratório. Descrevemos ainda uma técnica rápida para isolamento da medula óssea desses ossos que utiliza centrifugação para remoção da medula óssea do espaço da medula óssea.

Murino Hind Limb Ossos Longos Dissecção e Medula Óssea O isolamento

Apresentamos um protocolo para dissecar e cultivar ossos metatarsais murinos embrionários do dia 15 (E15). Este modelo ex vivo altamente fisiológico de ossificação endocondral fornece condições mais próximas da situação in vivo do que as células em monocamada ou cultura 3D e é uma ferramenta vital para investigar o crescimento e desenvolvimento ósseo.

Cultura de murino embrionárias Metatarsos: Um modelo fisiológico de Endocondral ossificação

Este manuscrito descreve um protocolo para isolar e cultura osteoclastos em vitro da medula óssea de rato e estudar o papel do alvo da rapamicina 1 complexo na formação do osteoclast mamíferos/mecanicista.

Um baseado em RANKL Osteoclast cultura ensaio de Mouse medula óssea para investigar o papel de mTORC1 na formação de Osteoclast

Neste artigo, apresentamos métodos para isolar e diferenciar as células do estroma da medula óssea e células-tronco hematopoiéticas de ossos longos de rato. Dois protocolos diferentes apresentam-se populações de células diferentes rendimento adequadas para a expansão e diferenciação em osteoblastos, osteoclastos e adipócitos.

Isolamento, cultura e diferenciação de células do estroma da medula óssea e osteoclasto progenitores dos ratos

A cultura ex vivo de explantas ósseas pode ser uma ferramenta valiosa para o estudo da fisiologia óssea e a avaliação potencial de medicamentos na remodelagem óssea e doenças ósseas. O protocolo apresentado descreve a preparação e a cultura de calvarias isoladas de crânios de camundongos recém-nascidos, bem como suas aplicações.

Medição da remodelagem óssea e recriação do microambiente tumor-osso usando a cocultura da Calvaria e a histomormormetria

O presente protocolo descreve o desenvolvimento de uma plataforma de teste reprodutível para pescoços femorais murinos em uma configuração de dobra cantilever. Guias impressos 3D personalizados foram usados para fixar de forma consistente e rígida os fêmures no alinhamento ideal.

Curva cantilever de pescoços femorais murinos

Este protocolo descreve um método não enzimático e direto para isolar células da medula óssea de camundongos neonatais de 7 a 9 dias de idade e gerar macrófagos diferenciados usando um sobrenadante de células L929 como fonte de fator estimulador de colônias de granulócitos (M-CSF). Os macrófagos derivados da medula óssea foram posteriormente analisados quanto aos antígenos de superfície F4/80, CD206, CD11b e competência funcional.

Isolamento da medula óssea de camundongos neonatais e preparação de macrófagos derivados da medula óssea

Este protocolo descreve um modelo de camundongo aprimorado para lesões na placa de crescimento ósseo de adolescentes. Usando camundongos transgênicos com repórteres fluorescentes de tri-linhagem para colágeno tipos I, II e X, as matrizes primárias associadas a três substratos diferentes da placa de crescimento, a colocação da lesão é guiada pela fluorescência nativa ao microscópio.

Modelo Murino Transgênico Tricolor para Estudo de Lesão em Placa de Crescimento

O modelo de lesão da medula óssea murina é uma ferramenta útil para estudar a osteogênese pós-natal por ossificação intramembranosa. Este protocolo cirúrgico simplificado descreve o procedimento de ablação da medula óssea para avaliação a jusante da nova formação óssea e respostas celulares após a lesão.

Metodologia aprimorada para estudar a osteogênese pós-natal via ossificação intramembranosa em um modelo de lesão da medula óssea murina

Aprenda a cultivar ossos longos de murinos fetais e recém-nascidos ex vivo para estudar o desenvolvimento ósseo e cartilaginoso. Esta técnica permite manipulação direta, imagem em tempo real e análise de efeitos genéticos locais.

Cultivando e medindo ossos longos de murine fetal e recém-nascido

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