Name: Monitoramento de colonização bacteriana e manutenção em raízes de Arabidopsis Arabidopsis thaliana em um sistema hidropônico flutuante (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-28T09:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Aprenda a monitorar a colonização bacteriana e manutenção em raízes de Arabidopsis thaliana usando um sistema hidropônico flutuante. Este protocolo versátil permite quantificar e visualizar a distribuição espacial de bactérias em diferentes ambientes de crescimento.

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Este trabalho foi apoiado por fundos de pesquisa fornecidos pelo departamento de pesquisa de energia biológica e ambiental (DOE-BER 0000217519 a E.A.S.), a National Science Foundation (INSPIRE IOS-1343020 para E. A. S). O SLH também foi apoiado pelo programa de bolsas de pós-graduação da National Science Foundation. Agradecemos ao Dr. Jeffery Dangl por fornecer cepas bacterianas e uma visão inestimável. Agradecemos ao Dr. Andrew Klein e Matthew J. Powers por sugestões experimentais. Finalmente, a SLH gostaria de agradecer as ligações nas redes sociais por nos lembrares que a difusão da ciência é um privilégio e uma responsabilidade, especialmente através de meios criativos e acessíveis.

Nota: a configuração experimental é descrita para maior clareza e usada para gerar os resultados representativos incluídos neste relatório, mas as condições podem ser modificadas conforme desejado. Todos os passos devem ser realizados usando EPI e após reccomendations institucionais e federais para a segurança, de acordo com o status BSL das bactérias utilizadas.
1. caracterização de bactérias
<ol><li>Determine a morfologia das bactérias na placa de agar de médio crescimento. Reressuscitem as células em um OD aproximado600 = 0,5 e a placa de um volume de 1 μl no meio de agar de escolha. Adicione X-GAL às placas de agar para uma concentração final de 20 mg/mL para diferenciar melhor os membros individuais da comunidade bacteriana específica. Cresça em 24 ° c ou 30 ° c até a forma das colônias, a seguir tome retratos e notas na morfologia da colônia.</li>
	<li>Definir a correlação entre a densidade óptica de cada cepa bacteriana e o número de CFU (unidades formadoras de colônias) por mL16. Ressuscitem as bactérias em 1 mL de água em uma placa de 24 poços para um OD aproximado600 = 5, executam duas vezes diluições seriais, monitoram o OD600 de todas as diluições, e a placa cada para determinar o CFU/ml viável em cada amostra em densidades ópticas múltiplas.</li>
	<li>Determine a tolerância máxima de sonication para cada cepa bacteriana. Para fazer isso, as células alíquotas em uma placa de 24 poços contendo meio líquido, reservando algumas células como uma amostra de controle unsonicated. Usando um ultrasonicator com um acessório do chifre de 24 pontas, aplique três círculos de 12 s do sonication em 40 ampères com pulsos de 2 s. Nota: o uso de um ultrasonicator de 24 poços é aconselhado a facilitar a multiplexação a jusante de amostras de plantas de processamento, mas se não estiver disponível, use um ultrasonicator equipado com uma microtip e realize cada amostra sonication independentemente. Sempre use Earmuffs nominal de pelo menos 25 NRR proteção.</li>
	<li>Realize 10 vezes diluições seriadas das amostras sonicated e unsonicated e mancha em placas de agar. Determine se há uma redução em células viáveis após a sonicação. Em caso afirmativo, use uma amostra fresca e repita a etapa do sonication usando um tempo total reduzido da sonication ou uma amplitude até que o tratamento não tenha nenhum efeito no CFU/mL final17.</li>
</ol>2. preparação de mudas de Arabidopsis Arabidopsis thaliana em malha plástica
<ol><li>Crie discos da malha plástica usando um perfurador de furo padrão.<ol>
<li>Colete os discos em um recipiente de vidro com uma tampa frouxa da folha de alumínio, e esterilize usando uma autoclave ajustada a um ciclo seco de 20 minutos13.</li>
		<li>Usando tweezers Flame-sterilized, distribua aproximadamente 40 discos sterilized da malha em uma única camada através da superfície de uma placa do ágar da planta-crescimento-média. Use sais de 0,5 x Murashige e Skoog (MS), contendo 500 mg/L de tampão MES [2-(N-morpholino) ácido etanólico] e 1,5% de agar Bacto, como meio de crescimento vegetal, com 50 μg/mL de benomilo adicionado ao limite de contaminação fúngica das mudas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare sementes axênicas de A. Arabidopsis thaliana como descrito anteriormente17.<ol>
<li>Coloc aproximadamente 100 – 300 sementes cada em uns tubos de centrifugação individuais em uma cremalheira e coloc em um vidro resealable ou em um recipiente plástico pesado ("frasco") em uma capa das emanações.</li>
		<li>Usando o cuidado, coloc uma taça de 100 mL do alvejante no frasco, adicione 3 mL do HCl concentrado ao alvejante, e sele imediatamente o frasco e permita que os fumos esterilize sementes por pelo menos 4 h.</li>
		<li>Retire cuidadosamente os tubos de sementes esterilizadas debaixo do jarro e vedação.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloque duas sementes no centro de cada malha. Placas de vedação com fita cirúrgica e incubar por 2 – 6 dias a 4 ° c na escuridão para vernalizar sementes.</li>
	<li>Para germinar e cultivar mudas, coloque o lado do agar de placa para baixo em uma câmara de crescimento de plantas por 8 – 10 dias em configurações de dia curto: 9 h de luz a 21 ° c e 15 h de escuro a 18 ° c (Figura 1, etapa 2).</li>
</ol>3. colonização de plantas em meio de crescimento bacteriano líquido
<ol><li>Adicione 1 mL de meio de crescimento bacteriano a cada poço de uma placa esterilizada de 24 poços, exceto para as cavidades de controle somente de mídia. Use o caldo Lennox Luria (10 g de triptona, 5 g de extrato de levedura, 5 g de NaCl) como o meio de crescimento bacteriano.</li>
	<li>Transferir as mudas germinadas incorporadas em malha de placas de agar para o líquido (Figura 1, etapa 3a).<ol>
<li>Descasque delicadamente a malha que contem duas plântulas germinadas acima e fora da placa do ágar usando o fórceps flama-sterilized. Escolha a malha com mudas igualmente dimensionadas e não danificadas.</li>
		<li>Se a remoção do agar não for Lisa, descarte a malha e a planta. Transfira um flutuador a cada poço do líquido do crescimento bacteriano, lado da raiz para baixo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inocular bactérias em poços contendo mudas flutuantes.<ol>
<li>Ressuscitem as bactérias cultivadas durante a noite em placas de agar para um OD600 equivalente a 108 CFU/ml no líquido de médio crescimento bacteriano. Adicionar 10 μL de suspensão bacteriana a cada poço para uma concentração final de 106 CFU bactérias por poço.</li>
		<li>Se preparar uma mistura de bactérias, ressuscitem cada um para o OD600 equivalente a 108 CFU/ml, misture em proporções iguais, e adicione 10 μL da mistura final por poço de líquido.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Selar a placa para o crescimento estéril. Sem tocar no lado pegajoso, pressione cuidadosamente o filme permeável a gás através da placa. Assegure-se de que cada poço esteja selado individualmente aplicando a pressão em torno de cada um dos anéis feitos pelos poços. Recoloque a tampa plástica da placa confortavelmente sobre a placa e o filme permeável a gás (Figura 1, passo 3B).</li>
	<li>Incubar as placas por 18 h em uma câmara de crescimento vegetal, as mesmas condições que as mudas foram originalmente germinadas, exceto em um agitador de placa orbital definido para 220 rpm.</li>
</ol>4. manutenção da colonização bacteriana
<ol><li>Para enxaguar todos os flutuadores (plantas no engranzamento), adicione 1 mL da água estéril aos poços de uma placa 24-well nova. Remova o filme permeável a gás. Usando fórceps estéril, transfira flutuadores aos poços com água (Figura 1, etapa 4a). Enxágüe descansando por 10 min à temperatura ambiente (RT) sem agitação. Nota: para determinar a eficiência da colonização bacteriana das raízes, em vez de sua capacidade de manter a colonização ao longo do tempo, as plantas podem ser sacrificadas nesta etapa, levando-os diretamente para o passo 5,1.</li>
	<li>Encha os poços de uma placa nova de 24 poços com 1 mL de meio de crescimento vegetal. Transfira uma malha para cada poço. Cubra com um selo permeável a gás e incubar por 72 h no agitador da placa orbital a 220 rpm na câmara de crescimento vegetal (Figura 1, etapa 4b).</li>
	<li>Repita a enxaguadela como realizada na etapa 4,1 com flutuadores após o período de incubação de 72 h.</li>
</ol>5. coleção das bactérias para contagens viáveis da pilha
Nota: o número de bactérias por raiz de plântulas pode ser determinado em qualquer ponto temporal de incubação. A colonização pode ser monitorada entre 0 h e 18 h, enquanto a manutenção pode ser monitorada a partir de 18 h em diante. As plantas destinadas à imagem latente podem prosseguir diretamente à seção 6.
<ol><li>Retire as mudas da malha (Figura 1, etapa 5). Coloc delicadamente o fórceps flama-sterilized abaixo das folhas (mas no lado da folha da malha), e comprima levemente a haste. Mexa as mudas para cima e para longe da malha para desalojar a raiz sem quebrá-la. Se a raiz quebrar, raspe delicadamente a parte inferior da malha para recolher o comprimento cheio.</li>
	<li>Remova as bactérias das raízes das plantas. Transfira as bactérias para poços de uma placa 24-bem contendo 1 mL de ddH20. SONICATE as amostras conforme descrito na etapa 1,3. Nota: usando um microscópio, procure todas as bactérias restantes na superfície da raiz em uma amostra sonicated. Se as bactérias permanecem, aumente o tempo ou a intensidade total do sonication até que nenhuma bactéria permaneça ligada, até o nível o mais elevado de sonication que não afeta contagens viáveis da pilha como determinado na seção 1.</li>
	<li>Quantificar as bactérias nas raízes.<ol>
<li>Realize diluições seriais de 10 vezes das amostras sonicadas até uma diluição de 10-6 em meio de crescimento bacteriano. Adicione 50 μL de cada diluição a placas de agar individuais e espalhe com grânulos de vidro estéreis (ou espalhador bacteriano). Incubar as placas com a temperatura ideal para as bactérias até que as colônias individuais são Countable.</li>
		<li>Uma vez distinguível, contar o número de cada morfologia da colônia (conforme determinado na seção 1), e calcular CFU de cada espécie bacteriana por plântula. Descarte todas as amostras que mostrem contaminação, pois a contaminação durante a colonização ou manutenção pode afetar a presença bacteriana.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. coleção de raízes de plantas intactas para microscopia
<ol><li>Usando fórceps, retire as mudas de malha como na seção 5.</li>
	<li>Transfira cada planta para lâminas de microscópio.<ol>
<li>Coloque a ponta da raiz no slide e arraste para longe da ponta para definir o disparo para baixo Flush com o slide, assegurando uma raiz endireitada para melhor imagem. Adicione uma gota de água ou meio de crescimento vegetal estéril às amostras para hidratar as interfaces entre as lamelas e os slides.</li>
		<li>Coloc um lamela de vidro apenas acima da coroa da raiz (a região encaixotado mais superior em Figura 1) e abaixo das folhas do tiro para evitar inclinar da lamínula (para permitir a imagem latente da coroa da raiz), e pressione para baixo delicadamente17.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Se usando bactérias fluorescentes, a imagem usando filtros apropriados da excitação/emissão para diferenciar as bactérias de se e a raiz18da planta.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Plantas em todos os ambientes interagem com milhares a milhões de diferentes bactérias e fungos5,7. Essas interações podem impactar negativamente e positivamente a saúde das plantas, com potenciais efeitos na produção de culturas e no rendimento alimentar. Trabalhos recentes também sugerem que a colonização variável de culturas por PGPBs pode ser responsável por tamanho de planta imprevisível e produtividade de culturas em ensaios de campo22</su...

A destruição das culturas por doenças bacterianas e fúngicas resulta na diminuição da produção de alimentos e pode perturbar severamente a estabilidade global1. Com base na descoberta de que os micróbios em solos supressores são responsáveis pelo aumento da saúde vegetal2, os cientistas perguntaram se o microbioma vegetal pode ser aproveitado para apoiar o crescimento das plantas, modificando a presença e abundância de particular espécies bacterianas3. As bactérias encontradas para ajudar no crescimento ou no desenvolvimento de planta são denominadas coletivamente bactérias promotoras do crescimento de planta (PGPB). Mais recentemente, os estudos mudaram de simplesmente identificar potencial PGPB para compreender como interkingdom interações no solo, em torno de raízes, ou na rizosfera (a área diretamente circundante e incluindo a superfície radicular) pode estar impactando PGPB atividade4.
A colonização por rizosfera pelo PGPB pode aumentar a saúde ou o desenvolvimento de plantas hospedeiras em resposta a diversos estressores em relação às plantas não colonizadas5. Entretanto, os resultados são frequentemente mais variáveis em condições nativas do solo comparadas àquelas observadas nas configurações de estufa e de laboratório de perto controladas6. Uma hipótese para essa diferença é que o crescimento ou o comportamento do pgpb pode ser inibido por bactérias ou fungos nativos do solo nos campos7,8. Efeitos benéficos por bactérias rizosfera geralmente dependem da capacidade das bactérias para 1) localizar e mover-se para a raiz, 2) colonizar a raiz através da formação de biofilme, e 3) interagir com a planta hospedeira ou patógenos através da produção de pequenas moléculas metabolitos7,9. Qualquer um desses comportamentos de colonização pode ser afetado pela presença e atividade de micróbios vizinhos10.
Foi elaborado um sistema para quantificar e visualizar esses distintos estágios bacterianos de colonização da rizosfera (Figura 1). Essa abordagem facilitará estudos investigando por que a manutenção de PGPB a longo prazo não é, por vezes, observada após a transferência de plantas para novos ambientes, como durante o plantio de mudas pré-inoculadas. A Arabidopsis Arabidopsis thaliana foi escolhida como modelo vegetal devido ao seu uso extensivo em estudos laboratoriais, bem como aos amplos dados disponíveis sobre suas interações microbianas11. Há três estágios no sistema: 1) crescimento de A. Arabidopsis thaliana , 2) colonização bacteriana e 3) manutenção bacteriana (ver Figura 1). Porque a. Arabidopsis thaliana é uma planta terrestre, era importante assegurar-se de que não sofresse o esforço de água indevido no sistema hidropônico12. Inspirados nos métodos utilizados por Haney et al.13, as mudas são cultivadas em malha plástica para separar a parte aérea do meio de crescimento líquido. Este sistema não parece comprometer a saúde eo desenvolvimento do hospedeiro da planta, e melhora a. Arabidopsis thaliana crescimento em líquido11. À medida que a planta atira flutua acima da superfície, as raízes são totalmente expostas à colonização por bactérias inoculadas no meio de crescimento bacteriano líquido. Isto permite que as bactérias do interesse sejam examinadas para a colonização nos nutrientes que são as mais favoráveis ao crescimento, ao então desloc condições para permitir que a planta continue crescendo em um meio nutriente projetado suportar seu crescimento. Ambos os estágios incluem agitação constante para prevenir a anóxia da raiz13. As bactérias podem ser visualizadas ou quantificadas a partir das raízes da planta após a transferência do meio de colonização ou do meio de manutenção. Este sistema hidropônico é muito flexível, permitindo que as condições experimentais e as tensões aplicadas sejam facilmente alteradas, dependendo dos interesses dos pesquisadores.
Este método descrito é importante no contexto do corpo maior da literatura sobre interações planta-micróbe porque fornece um sistema robusto para estudar estas interações na superfície da raiz ao igualmente ser customizável às preferências do crescimento de bactérias diferentes. Laboratórios de biologia vegetal muitas vezes executam experimentos de colonização de planta-micróbe em ágar sólido, permitindo apenas movimento planar (se isso) de bactérias, exigindo também a manipulação potencialmente destrutiva de plantas durante a transferência subsequente. Em contrapartida, os laboratórios de microbiologia têm freqüentemente priorizado a saúde das bactérias dentro de seus experimentos, em detrimento das plantas14,15. Essas diferentes prioridades de laboratórios centrados em plantas e Microbiologia têm historicamente dificultado a comparação de resultados entre esses grupos, uma vez que cada um tipicamente otimiza as condições experimentais para otimizar seu organismo de interesse15. O sistema de flutuação-malha-planta-crescimento descrito aqui impede a submersão completa da planta, uma vantagem notável aos estudos microbiologia-orientados precedentes, ao igualmente otimizar temporariamente o crescimento e a sobrevivência das bactérias para facilitar a colonização. Assim, o ensaio que apresentamos aqui pode abordar as preocupações de ambos os biólogos de plantas (sobre a hidratação e manipulação tátil da planta), satisfazendo os critérios dos microbiologistas (permitindo diferentes condições de crescimento bacteriano e múltiplas interações de espécies)7. Este protocolo é projetado ser adaptável para o uso com várias bactérias, plantas, e condições ambientais.

<table><tbody><tr><td><forte>Materiais Necessários</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos eppendorf de 1,5 mL</td><td>qualquer</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 24 poços</td><td>BD Falcon</td><td>1801343</td><td></td></tr><tr><td>Aeraseal</td><td>Excel Scientific</td><td>BE255A2</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>qualquer</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Bactéria de Interesse</td><td>qualquer</td><td>N/A</td><td>Armazenado em - 80? C em glicerol a 40% preferiu</td></tr><tr><td>BactoAgar</td><td>BD</td><td>2306428; REF 214010</td><td></td></tr><tr><td>alvejante</td><td>qualquer</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Conviron</td><td>qualquer</td><td>N/A</td><td>Ciclos de Luz-Escuridão de Dia Curto: 460-600 &micro; moles/m&sup2;/s definido em 9/15 horas claro/escuro em 18/21? C, com tomada interna</td></tr><tr><td>Frasco dessecador: vidro ou plástico pesado</td><td>qualquer</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>qualquer</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>Chama</td><td>qualquer</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps</td><td>qualquer</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>qualquer</td><td>N / A</td><td>Na temperatura ideal para o crescimento de bactérias especificadas</td></tr><tr><td>Ácido clorídrico</td><td>qualquer</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>Caldo Lennox LB RPI</td><td></td><td>L24066-1000.0</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga</td><td>qualquer</td> N<td>/A</td><td></td></tr><tr><td>Micropipetadores</td><td>qualquer</td><td>N/A</td><td>Volumes 5 &micro; L a 1000 &micro; L</td></tr><tr><td>Microscópio (de preferência fluorescência)</td> <td>qualquer</td><td>N/A</td><td>Pode ser leve se a melhor definição não for importante</td></tr><tr><td>MS Sais + MES</td><td>RPI</td><td>M70300-50.0</td><td></td></tr><tr><td>Agitador de Placas Orbitais</td><td>qualquer</td><td>N/A</td><td>Capaz de funcionar a 220 rpm por pelo menos 96 horas</td></tr><tr><td>Placas de Petri</td><td>qualquer</td><td>N/A</td><td>50 mL de volume total</td></tr><tr><td>Reservatórios</td><td>qualquer</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotômetro</td><td>qualquer</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Perfurador padrão</td><td>qualquer</td><td>N/A</td><td>Diâmetro do punção de aproximadamente 7 mm</td></tr><tr><td>Água estéril</td><td>qualquer</td><td>Fita</td><td></td></tr><tr><td>Cirúrgica</td><td>3M</td><td>MMM1538-1</td><td></td></tr><tr><td>Malha de Teflon</td><td>McMaster-Carr</td><td>1100t41</td><td></td></tr><tr><td>Ultrassônico</td><td>qualquer</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Misturador de vórtice</td><td>qualquer</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>X-gal</td><td>GoldBio</td><td>x4281c</td><td>outros fornecedores disponíveis</td></tr><tr><td>Materiais sugeridos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>24 Fixação do Ultrasonicator de pinos</td><td>qualquer</td><td>N/A</td><td>Para sonicar várias amostras de uma só vez. Pode ser feito individualmente</td></tr><tr><td>Alumaseal II</td><td>Excel Scientific</td><td>FE124F</td><td></td></tr><tr><td>Contas de vidro</td><td>qualquer</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Multipetter/Repetter</td><td>qualquer</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Placas estéreis de 96 poços</td><td>qualquer</td><td>N/A</td><td>Para diluições em série. Pode ser substituído por tubos eppendorf</td></tr><tr><td>Materiais biológicos usados</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Arabidopsis thaliana sementes</td><td>qualquer</td><td>N/A</td><td>Recomendamos o Centro de Recursos Biológicos de Arabidopsis para estoques de sementes</td></tr><tr><td>Arthrobacter nicotinovorans</td><td></td><td></td><td>Levy, et al. 2018</td></tr><tr><td>Curtobacterium oceanosedimentum</td><td></td><td></td><td>Levy, et al. 2018</td></tr><tr><td>Microbacterium oleivorans</td><td></td><td></td><td>Levy, et al. 2018</td></tr><tr><td>Pseudomonas simiae WCS417r</td><td></td><td></td><td>Publicado em um sistema semelhante em Haney, et al. 2015. Cepa usada desenvolvida em Cole, et al. 2017</td></tr></tbody></table>

monitoramento de colonização bacteriana e manutenção em raízes de arabidopsis arabidopsis thaliana em um sistema hidropônico flutuante

Monitoring Bacterial Colonization and Maintenance on Arabidopsis thaliana Roots in a Floating Hydroponic System

As bactérias formam microbiomas complexos de rizosfera em forma de micróbios interagindo, organismos maiores e o ambiente abiótico. Em condições laboratoriais, a colonização por rizosfera por bactérias promotoras de crescimento vegetal (PGPB) pode aumentar a saúde ou o desenvolvimento de plantas hospedeiras em relação às plantas não colonizadas. No entanto, em configurações de campo, os tratamentos bacterianos com PGPB muitas vezes não fornecem benefícios substanciais para as culturas. Uma explanação é que esta pode ser devido à perda do PGPB durante interações com os micróbios endógenos do solo sobre o tempo da planta. Essa possibilidade tem sido difícil de confirmar, uma vez que a maioria dos estudos se concentra na colonização inicial e não na manutenção do PGPB dentro das comunidades de rizosfera. É a hipótese de que a montagem, a coexistência e a manutenção de comunidades bacterianas são moldadas por características determinísticas do microambiente da rizosfera, e que essas interações podem impactar a sobrevida do PGPB em ambientes nativos. Para estudar esses comportamentos, um ensaio hidropônico de crescimento vegetal é otimizado usando Arabidopsis Arabidopsis thaliana para quantificar e visualizar a distribuição espacial de bactérias durante a colonização inicial das raízes das plantas e após a transferência para o crescimento diferente Ambientes. A reprodutibilidade e utilidade deste sistema são então validadas com o bem estudado PGPB Pseudomonas Simiae. Para investigar como a presença de múltiplas espécies bacterianas pode afetar a colonização e a dinâmica de manutenção na raiz da planta, uma comunidade modelo de três cepas bacterianas (um Arthrobacter, Curtobacteriume microbacterium espécies) originalmente isoladas da rhizofera a . Arabidopsis thaliana é construída. Mostra-se que a presença destas espécies bacterianas diversas pode ser medida usando este ensaio hidropônico da planta-maintanence, que fornece uma alternativa aos estudos de comunidade bacterianos de sequenciamento-baseados. Estudos futuros que utilizam este sistema podem melhorar a compreensão do comportamento bacteriano em microbiomas de plantas multiespécies ao longo do tempo e em mudanças nas condições ambientais.

O bem caracterizado PGPB P. Simiae WCS417r é conhecido por colonizar as raízes de a. Arabidopsis thaliana na cultura hidropônica. Esta bactéria naturalmente fluorescente pode ser facilmente visualizada usando microscopia nas raízes das mudas após a colonização (Figura 2). Embora seja possível a imagem do comprimento total dessas mudas de a. Arabidopsis thaliana ' (4 – 6 mm de comprimento) raízes, fazê-lo para muitas plantas levaria ...

Aqui nós descrevemos um ensaio hidropônico do crescimento de planta para quantificar a presença da espécie e para visualizar a distribuição espacial das bactérias durante a colonização inicial de raizes de planta e após sua transferência em ambientes diferentes do crescimento.

Monitoramento de colonização bacteriana e manutenção em raízes de Arabidopsis Arabidopsis thaliana em um sistema hidropônico flutuante

Bacteria form complex rhizosphere microbiomes shaped by interacting microbes, larger organisms, and the abiotic environment. Under laboratory conditions, ...

A maioria dos experimentos estuda interações entre plantas e micróbios focando na colonização, mas nosso protocolo foi projetado para olhar tanto para a colonização quanto para a manutenção das bactérias na raiz. Podemos mudar o experimento para caber diferentes bactérias e plantas, e podemos até testar várias bactérias em cada placa de 24 poços. Para começar, use um perfurador de furo padrão para criar discos de malha plástica.Colete os discos em um recipiente de vidro e cubra livremente. Esterilize usando uma autoclave definida para um ciclo seco de 20 minutos. Use pinças esterilizadas por chamas para distribuir aproximadamente 40 discos de malha esterilizados em uma única camada através da superfície de placa de ágar média de crescimento vegetal previamente preparada.Coloque duas sementes previamente esterilizadas no centro de cada malha. Sele a placa com fita cirúrgica, e incubar por dois a seis dias a quatro graus Celsius na escuridão para vernalizar as sementes. Em seguida, coloque a placa do lado do ágar para baixo em uma câmara de crescimento de plantas por oito a 10 dias sob configurações de dia curto de nove horas de luz a 21 graus Celsius e 15 horas de escuro a 18 graus Celsius para germinar e cultivar mudas.Adicione um mililitro de meio de crescimento bacteriano a cada poço de uma placa estéril de 24 poços. Para transferir as mudas germinadas embutidas na malha, use fórceps esterilizados por chamas para descascar suavemente a malha contendo duas mudas germinadas, igualmente dimensionadas, e mudas intactas para cima e para fora da placa de ágar. Transfira um carro alegórico com mudas para cada poço de líquido de crescimento bacteriano, lado raiz para baixo.Em seguida, bactérias resuspend cultivadas durante a noite em placas de ágar em meio de crescimento bacteriano líquido. Adicione 10 microliters de suspensão bacteriana a cada poço, exceto para poços de controle somente de mídia, para uma concentração final de um milhão de unidades formadoras de colônias de bactérias por poço. Para selar a placa para crescimento estéril, pressione cuidadosamente o filme permeável a gás através da placa sem tocar no lado pegajoso.Aplique pressão em torno de cada um dos anéis feitos pelos poços para garantir que cada poço tenha sido selado individualmente. Em seguida, feche a placa com sua tampa de plástico aconchegante sobre o filme permeável a gás. Coloque a placa em uma câmara de crescimento vegetal em um agitador de placa orbital definido a 220 rpm, e incubar por 18 horas sob as mesmas condições que as mudas foram originalmente germinadas.Para enxaguar todos os carros alegóricos com plantas, adicione um mililitro de água estéril a cada poço de uma nova placa de 24 poços. Remova o filme permeável a gás da placa com plantas e use fórceps estéreis para transferir boias para poços com água, e incubar por 10 minutos em temperatura ambiente sem agitação. Em seguida, encha cada poço de uma nova placa de 24 poços com um mililitro de meio de crescimento vegetal.Transfira uma malha para cada poço e cubra com um selo permeável a gás. Incubar por 72 horas no agitador de placa orbital a 220 rpm na câmara de crescimento da planta. Após a incubação, enxágue as plantas como feito anteriormente.Após a lavagem, remova as mudas da malha colocando suavemente fórceps esterilizados por chamas abaixo das folhas no lado da folha da malha. Belisque levemente a haste, e mexa as mudas para cima e para longe da malha para desalojar a raiz sem quebrá-la. Para remover bactérias das raízes vegetais, transfira as mudas de cada malha para poços individuais de uma placa de sônica de 24 poços contendo um mililitro de água dupla destilada.Sonicate todas as amostras dentro da placa ao mesmo tempo usando um sônico multifacetado como descrito no manuscrito. Para quantificar as bactérias, realize diluições 10 vezes mais vezes das amostras sonicadas em meio de crescimento bacteriano. Espalhe usando contas de vidro estéreis e incubar na temperatura ideal para bactérias até que colônias individuais sejam contáveis.Para coletar raízes intactas da planta, use fórceps para remover as mudas da malha. Em seguida, transfira cada planta para um slide de microscópio colocando a ponta da raiz no slide e arrastando-a para longe da ponta para definir o tiro para baixo com o slide, garantindo uma raiz endireitada para melhor imagem. Adicione uma gota de água ou meio de crescimento vegetal estéril a cada amostra para hidratar interfaces entre as tampas e slides.Coloque uma mancha de vidro logo acima da coroa raiz e abaixo das folhas de ensaio para evitar inclinação da tampa, e pressione suavemente para baixo. Em seguida, imagem as bactérias usando filtros apropriados de excitação/emissão para diferenciar bactérias entre si e a raiz da planta. Pseudomonas simiae, bactéria naturalmente fluorescente, colonizada raízes arabidopsis thaliana e foi mantida na raiz após transferência para o meio de crescimento vegetal.Coroa radicular, comprimento médio e ponta mostram fluorescência devido à colonização de Pseudomonas simiae. O controle negativo sem bactérias não mostrou colonização. Quando pseudomonas simiae sobre raízes arabidopsis thaliana foram quantificadas após 18 horas de colonização ou 72 horas de manutenção, o número total de unidades formadoras de colônias por muda em ambos os momentos mostrou boa reprodutibilidade através de réplicas biológicas realizadas em dias diferentes.Houve aumento no número de unidades formadoras de colônias por muda após 72 horas em meio de manutenção, em comparação com os números observados no ponto de tempo pós-colonização de 18 horas, indicando que o crescimento ativo das bactérias colonizadas na raiz da planta ocorreu durante a fase de manutenção. Três espécies de bactérias isoladas de Arabidopsis thaliana cultivadas em solo natural em condições laboratoriais foram utilizadas para monitorar a associação de múltiplas espécies em raízes vegetais. Eles foram claramente diferenciados em meios contendo X-gal devido a diferenças na morfologia e cor das colônias, o que permitiu contar as unidades formadoras de colônias por muda de cada espécie sem seleção de antibióticos, mesmo na cocultura de várias espécies.Estas três espécies de bactérias foram todas colonizadas e mantidas na raiz, seja sozinhas ou em cocultura bacteriana. Cada espécie mostrou tendências semelhantes em diferentes réplicas biológicas e técnicas, mostrando que este protocolo pode ser usado para medir unidades relativas ou totais de formação de colônias por raiz de cada espécie. Quando cultivadas sozinhas, nenhuma espécie individual apresentou aumento substancial em abundância durante a fase de manutenção, mas as unidades globais de formação de colônias por raiz da comunidade combinada aumentaram em coculturas, indicando que essas bactérias não proíbem a colonização das outras cepas.Os passos mais difíceis são aqueles que requerem a remoção de plantas intactas dos discos de malha. Ser paciente e gentil tornará isso possível. Se as células bacterianas forem fluorescentes, as amostras podem ser classificadas por citometria de fluxo para determinar o número relativo de células.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Fonte: Nathoo, N., et al. Um sistema de co-cultivo hidropônico para análise simultânea e sistemática de interações moleculares e sinalização planta/micróbio. J. Vis. Exp. (2017).Este vídeo demonstra um sistema de co-cultivo hidropônico para estudar as interações planta-bactéria em condições estéreis. As mudas das plantas são transferidas para um meio de crescimento ácido estéril, incubadas e inspecionadas quanto à contaminação antes da inoculação com Agrobacterium. As bactérias ativadas se...

Um sistema de co-cultivo para estudar as respostas moleculares de hospedeiros vegetais e bactérias em interação

Fonte: Harris, S. L., et al. Monitoramento da colonização bacteriana e manutenção nas raízes de Arabidopsis thaliana em um sistema hidropônico flutuante. J. Vis. Exp. (2019)Este vídeo demonstra um protocolo para monitorar a colonização de bactérias associadas às raízes em mudas de Arabidopsis thaliana cultivadas em um sistema sem solo. Após a colonização, as bactérias são deslocadas por sonicação, depois diluídas, placadas e incubadas para formar colônias que refletem a ligação e viabilidade...

Monitoramento da colonização bacteriana das raízes de Arabidopsis thaliana em um sistema sem solo

A quantificação do crescimento de patógenos é uma ferramenta poderosa para caracterizar várias respostas imunes de Arabidopsis thaliana (doravante: Arabidopsis). O método descrito aqui apresenta um ensaio otimizado de infiltração de seringa para quantificar a Pseudomonas syringae pv. maculicola ES4326 crescimento em folhas adultas de Arabidopsis.

Bacteriana Folha Infiltração Ensaio para Belas Caracterização das respostas de defesa da planta usando o<em&gt; Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae</em&gt; Patossistema

O sistema de cocultivação hidropônico descrito suporta plantas intactas com telas de malha metálica e as coculata com bactérias. O tecido vegetal, as bactérias e as moléculas segregadas podem então ser colhidas separadamente para análises a jusante, permitindo simultaneamente que as respostas moleculares de ambos os hospedeiros de plantas e micróbios ou microbiomas interativos sejam investigadas.

Um sistema de co-cultivo hidropônico para análises simultâneas e sistemáticas de interações moleculares e sinalizadoras de plantas / micróbios

Este artigo demonstra como a cultura de plântulas de Arabidopsis thaliana em uma plataforma de dois-camada microfluidic que restringe a raiz principal e cabelos de raiz para um único plano ótico. Esta plataforma pode ser usada para a imagem latente de óptica em tempo real da morfologia da raiz bem bem como quanto à geração de imagens de alta resolução por outros meios.

A raiz do cabelo morfologia de plântulas de Arabidopsis em uma plataforma Microfluidic de duas camadas de imagem

Um sistema hidropónico simples, versátil e baixo custo em vitro foi otimizado com sucesso, possibilitando experiências em grande escala, sob condições estéreis. Este sistema facilita a aplicação de produtos químicos em uma solução e sua eficiente absorção pelas raízes para estudos moleculares, bioquímicas e fisiológicas.

Um flexível baixo custo sistema hidropônico para avaliar as respostas de planta para pequenas moléculas em condições estéreis

Usamos ferramentas laboratoriais simples para examinar a arquitetura do sistema radicular (RSA) de Arabidopsis e Medicago. As plântulas são cultivadas hidroponicamente sobre malha e espalhadas usando um pincel de arte para revelar a RSA. As imagens são tiradas usando digitalização ou uma câmera de alta resolução e, em seguida, analisadas com o ImageJ para mapear traços.

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Apresentamos um protocolo para um sistema experimental semihidropônico à base de vidro que suporta o crescimento de uma variedade de plantas filogeneticamente distintas com ou sem micróbios. O sistema é compatível com diferentes meios de crescimento e permite a amostragem não destrutiva de exsudato radicular para análise a jusante.

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A colonização de rizobactérias promotoras de crescimento vegetal (PGPR) na rizosfera é essencial para seu efeito promotor de crescimento. É necessário padronizar o método de detecção da colonização da rizosfera bacteriana. Aqui, descrevemos um método reprodutível para quantificar a colonização bacteriana na superfície da raiz.

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Um modelo ortotópico de câncer de ovário seroso em camundongos imunocompetentes para In vivo Imaging Tumor e Monitoramento de Tumor respostas imunes

Aprenda a monitorar a colonização bacteriana e manutenção em raízes de Arabidopsis thaliana usando um sistema hidropônico flutuante. Este protocolo versátil permite quantificar e visualizar a distribuição espacial de bactérias em diferentes ambientes de crescimento.

Monitoramento de colonização bacteriana e manutenção em raízes de Arabidopsis Arabidopsis thaliana em um sistema hidropônico flutuante (Vídeo) | JoVE Journal

Monitoramento de colonização bacteriana e manutenção em raízes de Arabidopsis Arabidopsis thaliana em um sistema hidropônico flutuante

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