Name: Espectroscopia de absorvância atômica para medir piscinas de zinco intracelular em células de mamíferos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 4 s
Description: Aprenda a usar espectroscopia de absorção atômica em forno de grafite para quantificar zinco em frações subcelulares de células de mamíferos. Este método acessível e sensível permite analisar homeostase de metais em diferentes estágios de desenvolvimento celular.

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Este trabalho foi apoiado pelo prêmio professores de diversidade acadêmicos da faculdade de medicina da Universidade de Massachusetts para o higiênico-B. N.N.-T. é apoiado por SEP-CONACYT, Grant 279879. J. G. N é apoiado pelo National Science Foundation Grant DBI 0959476. Os autores são gratos ao Dr. Daryl a. Bosco por fornecer a linha celular N2A e a Daniella Cangussu pelo seu apoio técnico.

1. cultura de células de mamíferos
<ol><li>Considerações gerais
	<ol>
<li>Siga as técnicas assépticas para a cultura de células de mamíferos previamente revisadas38.</li>
		<li>Manter todas as linhas celulares em uma incubadora de 5% CO2 humidificada a 37 ° c. As condições de cultura de célula variam para cada tipo de célula. É importante manter as condições de cultura apropriadas para cada linha celular usada, como variações desses procedimentos levará a fenótipos aberrantes e falha da cultura celular.</li>
		<li>Assegure familiaridade com a linha de interesse da célula e siga os protocolos fornecidos para cada tipo de célula selecionado para experimentos específicos (Veja alguns exemplos abaixo).</li>
	</ol></li>
	<li>Procedimento geral para tripsinização e passagem de pilhas aderentes
	<ol>
<li>Remova a mídia de cultura da célula da placa de cultura por aspiração.</li>
		<li>Lave as células suavemente usando PBS sem cálcio e magnésio (5 mL por 10 cm2 área de superfície da cultura). Adicione a solução de lavagem ao lado da placa para evitar a desanexação da monocamada celular; Gire a placa para maximizar a cobertura da solução. Para células epiteliais, é necessário incubar as células por 10 a 15 min na incubadora a 37 ° c em PBS para facilitar a dissociação das células nas etapas a seguir.</li>
		<li>Retire a solução de lavagem por aspiração.</li>
		<li>Acrescente reagente de dissociação suficiente (0,25% de tripsina) à placa (aproximadamente 0,7 mL por 10 cm2). Gire delicadamente a placa para começ a cobertura completa da monocamada da pilha.</li>
		<li>Incubar a cultura à temperatura ambiente durante 2 a 5 min. O tempo real da incubação varia com a linha de pilha usada, no caso das pilhas epithelial é recomendado incubar por 10 a 15 minutos na incubadora em 37 ° c. Observe as células o microscópio para o descolamento celular.</li>
		<li>Quando a maioria das células se destacaram, recupere a suspensão celular em 5 mL do chapeamento pré-aquecido ou meio de crescimento (veja abaixo alguns exemplos). Dissociar mecanicamente aglomerados de células por pipetagem sobre a monocamada celular várias vezes.</li>
		<li>Transfira a suspensão da célula para um tubo cônico de 15 mL e Centrifugue-as a 1.000 x g durante 2 a 5 min. A velocidade e o tempo de centrifugação variam com base no tipo de célula. Retire a mídia por aspiração suave, sendo cuidadoso para não tocar o pellet celular. Resuspend a pelota da pilha em 5 a 10 ml do meio pre-aquecido apropriado do crescimento e remova uma amostra para contar usando um hemocitômetro ou um contador de pilha automático.</li>
		<li>Utilize o volume adequado da suspensão da célula para propagar a densidade recomendada para cada linha celular específica (veja abaixo alguns exemplos). Suplemento com o volume adequado de meios de cultura de acordo com o tamanho do prato de cultura e colocar as células de volta para a incubadora.</li>
	</ol></li>
	<li>Mioblasts primários derivados de células de satélite do rato
	<ol>
<li>Antes de começar, prepare placas revestidas de colágeno para o crescimento de mioblastos primários. Uma solução contendo 0, 2% de colágeno e 0, 5 M de ácido acético em água deionizada deve ser esterilizada por filtração com um dispositivo de filtro estéril de 0,22 μm. Incubar as placas da cultura com a solução do colagénio durante a noite em 37 ° c.</li>
		<li>No dia seguinte, aspirar a solução de colágeno, permitir que as placas para secar ao ar no armário estéril e armazenar a 4 ° c até o uso. Nota: os volumes mínimos de colágeno são: para 35 mm = 1 mL; 60 mm = 2 mL; 10 cm = 5 mL.</li>
		<li>Mioblastos preliminares da semente em 1 x 104 Cells/cm2 em 55 cm2 placas colagénio-revestidas da cultura. A mídia de proliferação é o meio de cultura de mistura de nutrientes de Dulbecco Modified Eagle ' s Medium (DMEM)/Ham, contendo 20% de soro bovino fetal (FBS), 25 ng/mL de fator de crescimento fibroblástico básico recombinante (FGF) e 100 U/mL de penicilina/estreptomicina. Nota: as células proliferating e conservada em estoque devem ser mantidas 50% da confluência. O contato celular induz comprometimento das células à diferenciação miogênica e prejudica as capacidades de crescimento da cultura.</li>
		<li>Para diferenciar os Myoblasts preliminares, permita que as pilhas alcancem 80% a confluency de 100%, que ocorre normalmente após 48 h do chapeamento. Em seguida, mude para meios de diferenciação (DMEM, 2% de soro de cavalo, 1% de insulina, transferrina, selênio um suplemento, e 100 U/mL de penicilina/estreptomicina). Atualize a mídia diariamente até a colheita.</li>
	</ol></li>
	<li>Neuroblastoma murino (N2A)
	<ol>
<li>Placa N2A células em uma densidade de 2 x 104 células/cm2 em meios de crescimento, contendo uma mistura de médio-soro reduzido/DMEM contendo alta glicose e L-glutamina (1:1, v:v), suplemento com 10% FBS e 100 U/ml de penicilina/estreptomicina. Manter a cultura de ações 50% de confluência.</li>
		<li>Induzir a diferenciação de células N2A uma vez que a confluência atingiu 25% a 40%. Mudança para meios de diferenciação contendo uma mistura de soro reduzido médio/DMEM, 1% FBS e 20 μM de ácido retinóico por 7 a 10 dias. Atualize a mídia todos os dias até a colheita da célula. Nota: como células N2A diferenciar, algumas células tornam-se redondas, desanexar facilmente, e pode sofrer apoptose. Tenha cuidado ao aspirar e adicionar a mídia de cultura para as placas.</li>
	</ol></li>
	<li>3T3 L1 pré-adipócitos murinos
	<ol>
<li>Manter o mouse 3T3/L1 células em DMEM com alta glicose, suplementado com 10% FBS e 100 U/mL de penicilina/estreptomicina. O processo adipogênico é dependente da confluência das células; Portanto, não deixe que a cultura de ações cresça mais de 50% confluência, como maior afluência irá prejudicar a capacidade das células para diferenciar.</li>
		<li>Placa as pilhas em 2 x 104 Cells/cm2. Nesta densidade, as células chegarão à confluência em 3 dias.</li>
		<li>Induzir a diferenciação adipogênica dois dias após as células atingirem 100% de confluência. Os meios de indução consistem em DMEM contendo 10% de FBS, 10 μg/mL de insulina, 0,5 mM 3-isobutil-1-metixantina, 1 μM de dexametasona e 10 μM de troglitazona.</li>
		<li>Substitua a mídia de indução após 48 h de incubação a meios de diferenciação (DMEM contendo 10% de FBS e 5 μg/mL de insulina). Atualize a mídia todos os dias até a colheita. Amostras representativas de total diferenciação são normalmente coletadas entre 7 e 10 dias após a indução adipogênica. Nota: à medida que a adipogênese progride, as células tornam-se redondas e tendem a se separar facilmente. Tenha cuidado ao aspirar e adicionar a mídia de cultura para as placas.</li>
	</ol></li>
	<li>MCF10A células
	<ol>
<li>Placa MCF10A células em DMEM/F12 (1:1, v:v), suplementada com 5% FBS, 100 U/mL de penicilina/estreptomicina, 0,5 μg/mL de hidrocortisona, 10 μg/mL de insulina e 20 ng/mL de fator de crescimento epidérmico (EGF). A densidade recomendada de semeadura é de 1 x 105 células/cm2. Nestas condições, as células chegarão a 100% de confluência no prazo de 4 dias. Atualize a mídia a cada 2 a 3 dias até a colheita. Nota: MCF10A células são difíceis de desanexar. Recomenda-se incubar as células por 10 a 15 min a 37 ° c em PBS livre de cálcio com EDTA de 0,5 mM antes da trypsinization.</li>
	</ol></li>
	<li>Células renais caninas Madin-Darby (MDCK)
	<ol>
<li>Células MDCK de placa em DMEM suplementados com 10% FBS e 100 U/mL de penicilina/estreptomicina. A densidade recomendada da semeadura é 1 x 105 Cells/cm2, onde as pilhas alcançam a confluência de 100% dentro de 3 dias. Atualize a mídia a cada 2 dias até a colheita. Nota: as células MDCK são difíceis de separar. Recomenda-se incubar as células por 5 a 10 min a 37 ° c em PBS livre de cálcio e magnésio antes da trypsinization. Para impedir a aglomeração da pilha não agitam as placas batendo ou agitando o balão ao esperar que as pilhas desanexem.</li>
	</ol></li>
</ol>2. preparação da amostra de cultura de células de mamíferos para AAS: fraccionamento de células inteiras e subcelulares
<ol><li>Cultura as células de interesse em 55 cm2 placas. O uso de placas de cultura menores pode produzir amostras com níveis de metais os limites de detecção do GF-AAS.</li>
	<li>Extrato de células inteiras<ol>
<li>Aspirar a mídia de cultura usando uma armadilha de vácuo. Certifique-se de remover todos os traços de mídia. Enxágüe as células dos pontos de tempo desejados ou condições de cultura três vezes com PBS gelada livre de cálcio e magnésio.</li>
		<li>Raspe imediatamente as células da placa usando um novo raspador de células plásticas em 1 mL de PBS livre de cálcio e magnésio. Transfira a amostra para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e centrifugue por 2 min a 2.000 x g e aspire o sobrenadante. O protocolo pode ser pausado aqui. Armazene amostras de pellets a-20 ° c ou avance para o passo 2,4.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fraccionamento subcelular<ol>
<li>Aspirar a mídia de cultura usando uma armadilha de vácuo. Certifique-se de remover todos os traços de mídia. Enxágüe as células dos pontos de tempo desejados ou condições de cultura três vezes com PBS gelada livre de cálcio e magnésio. Raspe as células fora da placa com 1 mL de PBS gelada livre de cálcio e magnésio.</li>
		<li>Transfira as amostras para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e mantenha-se no gelo. Centrifugador para 10 s em 10.000 x g. Continue a isolação rápida dos núcleos se a análise do metal de frações cytoplasmic e nucleares é desejada. Este procedimento minimizará a potencial perda de metais devido à extração celular39, 40.</li>
		<li>Retire o sobrenadante por aspiração e ressuscite o pellet celular em 400 μL de PBS frio-gelado livre de cálcio e magnésio, contendo 0,1% Nonidet P-40 (NP-40), um detergente não-iônico. Transfira 100 μL para um novo tubo de microcentrífuga e considere-o como a amostra de célula inteira. Esta alíquota representa 25% da amostra.</li>
		<li>Isolar núcleos introduzindo a suspensão da célula 5 a 10 vezes no gelo com uma ponta de micropipeta P1000. O isolamento de núcleos de células epiteliais requer uma concentração de 0,5% NP-40. Alcançar a dissociação celular, passando a suspensão celular através de uma agulha de 26 3/4 G 10 a 15 vezes, seguido por 10 a 15 passagens através de uma agulha de 30 1/2 G. Nota: verificar a integridade dos núcleos por microscopia de luz usando um objetivo de 40x.</li>
		<li>Centrifugue a suspensão de lisado de células restantes (300 μL) por 10 s a 10.000 x g. O sobrenadante conterá a fração citosólica. Transfira o 300 μL para um novo tubo de microcentrífuga.</li>
		<li>Enxague a pelota contendo a fração nuclear em 500 μL de PBS livre de cálcio e magnésio, contendo 0,1% NP-40, depois Centrifugue por 10 s a 10.000 x g. Retire o sobrenadante e ressuscitem o pellet contendo os núcleos em 100 μL da mesma solução. Observação: o protocolo pode ser pausado aqui. As amostras podem ser armazenadas a-20 ° c.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lyse as células por três ciclos sonication (30 s on/30 s off, em 50 kHz, 200 W) por 5 min. quantificar o teor de proteína total na amostra por Bradford41.</li>
	<li>Executar o controle de qualidade da pureza das frações por Western blot usando anticorpos específicos tanto para o nuclear (histonas, remodeladores de cromatina, proteínas de matriz nuclear) ou frações citosónicas (β-tubulina, β-actina) (Figura 2). Nota: não use compactos com uma ponta de metal. Estes podem contaminar a amostra com metais.</li>
</ol>3. análise de conteúdo de Zn de células inteiras e frações subcelulares de culturas de células de mamíferos por espectroscopia de absorvência atômica
<ol><li>Mineralize as amostras da cultura de pilha (pilha inteira ou frações nucleares) pela digestão ácida usando um volume igual da classe concentrada do metal do traço de HNO3 (cuidado) para 1 h em 80 ° c, então durante a noite em 20 ° c.</li>
	<li>Pare a reacção adicionando 30% do volume de reacção de H2o2. Traga o volume amostral para 500 μL com água purificada de 18 MΩ. Nota: a manipulação de HNO3 deve ser feita usando vidros de segurança químicos, um protetor de cara para a proteção do respingo, luvas, e um respirador aprovado do vapor se a ventilação adequada (capa das emanações) não está disponível. O protocolo pode ser pausado aqui. As amostras podem ser armazenadas à temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Prepare soluções padrão e amostras experimentais para medições de Zn por AAS equipadas com um forno de grafite.<ol>
<li>Use 2% (v/v) HNO3 solução em água deionizada, proveniente do mesmo lote usado para a curva padrão como a solução em branco para a calibração em todo. Use padrões de grau analítico diluídos em 18 MΩ água purificada.</li>
		<li>Prepare um padrão de 1.000 ppb de Zn de uma solução de estoque de Zn 1.000 ppm comercialmente disponível com solução de HNO3 de 2% (v/v) em água desionizada. Prepare as soluções padrão de trabalho do padrão 100 ppb diluindo-a para 5, 8, 10, 15, 20 e 25 ppb diretamente com 2% (v/v) HNO3 solução em água desionizada. Prepare os padrões de Zn e o espaço em branco com um modificador de matriz de 0,1% (1 g/L) mg (NO3)2 . Nota: o LOD de Zn é 0, 1 ppb (μg/L). Ao aumentar a concentração das normas, determinou-se o limite de linearidade do Zn a 20 ppb (Figura 3).</li>
		<li>Medida padrão e amostras as mesmas condições otimizadas: vazão de introdução de 250 mL/min, temperatura de injeção de 20 ° c e temperatura GF de 1.800 ° c. Nota: a temperatura GF foi aumentada para 2450 ° c para as etapas de limpeza, antes da injeção de uma nova amostra ou padrão.</li>
		<li>Otimize a lâmpada (C-HCL) para uma corrente de 20 A, comprimento de onda de 213,9 nm e fenda de 0,7 nm.</li>
		<li>Meça as amostras mineralizadas usando a curva padrão de Zn para determinar o conteúdo metálico. Como pequenos volumes são medidos, as amostras podem evaficar se as medições demoram longos períodos de tempo. Conseqüentemente, recomenda-se adicionar a água às amostras. Diluir as amostras com água purificada de 18 MΩ tratada com 0, 1% de HNO3 (grau analítico) se os dados obtidos estiverem além do LOD. Nota: normalmente, as amostras são diluídas para um volume de 500 μL, colocadas no amostrador automático automatizado do AAS a ser medido logo após a curva padrão ser estabelecida. O volume necessário deve ser determinado pelo usuário e deve considerar os cálculos finais das concentrações. O acabamento das determinações de Zn por AAS de um experimento completo em uma tentativa é recomendado. Pausar as medições pode levar a grandes variações experimentais e inconsistências.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Converta as medições de PPB em molaridade como obtido a partir de Zn medido via AAS. Considere a massa de Zn (65,39 Amu). Divida a quantidade de PPB obtida pelo AAS em 63.390.000. Nas células, as concentrações de Zn variam de unidades de pmol a μmol.<ol>
<li>Divida a concentração de Zn (pmol ou μmol) pela massa inicial de proteína na amostra determinada por Bradford (etapa 2,4). Este cálculo irá processar a quantidade de metal (pmol ou μmol Zn) contido por mg de proteína da amostra. Nota: é importante considerar os fatores de diluição utilizados durante as determinações metálicas.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A espectroscopia de absorvância atômica é um método altamente sensível para quantificação de Zn em amostras biológicas de pequeno volume/massa. A otimização descrita da medição de Zn faz com que a aplicação deste método seja simples e garante condições analíticas ideais. Aqui, utilizando-se GF-AAS, determinou-se a concentração de Zn em células inteiras, e em frações citosónicas e nucleares, de diferentes linhagens celulares. Os resultados mostram que essa técnica se torna comparável àquelas obtidas por sondas fluorescent...

A transição e os metais pesados, como Zn, UC, MN e Fe, são encontrados naturalmente no ambiente em ambos os nutrientes em alimentos e poluentes. Todos os organismos vivos necessitam de diferentes quantidades destes micronutrientes; no entanto, a exposição a níveis elevados é deletério para os organismos. A aquisição de metais é principalmente através da dieta, mas os metais também podem ser inalados ou absorvidos pela pele1,2,3,4,5. É importante notar que a presença de metais em partículas atmosféricas está aumentando e tem sido largamente associada a riscos para a saúde. Devido às atividades antropogênicas, o aumento dos níveis de metais pesados como o AG, as, CD, CR, Hg, Ni, Fe e PB foram detectados em material particulado atmosférico, água da chuva e solo6,7. Estes metais têm o potencial de competir com oligoelementos fisiológicos essenciais, particularmente Zn e Fe, e induzem efeitos tóxicos pela inativação de enzimas fundamentais para processos biológicos.
O elemento traço Zn é redox neutro e se comporta como um ácido de Lewis em reações biológicas, o que o torna um cofator fundamental necessário para a dobradura de proteínas e atividade catalítica em mais de 10% das proteínas de mamíferos8,9, de 10; Conseqüentemente, é essencial para diversas funções fisiológicas8,11. No entanto, como muitos oligoelementos, há um equilíbrio delicado entre estes metais facilitando a função fisiológica normal e causando toxicidade. Em mamíferos, as deficiências de Zn levam à anemia, retardo de crescimento, hipogonadismo, anormalidades cutâneas, diarréia, alopecia, distúrbios do paladar, inflamação crônica e funções imunes e neurológicas comprometidas11,12, 13,14,15,16,17,18. Em excesso, o Zn é citotóxico e prejudica a absorção de outros metais essenciais como o cobre19,20,21.
Adicionalmente, alguns metais como o UC e o FE têm o potencial para participar em reações prejudiciais. A produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) via química de Fenton pode interferir com a montagem de proteínas cluster de enxofre de ferro e alterar o metabolismo lipídico22,23,24. Para evitar este dano, as células utilizam chaperonas de ligação metálica e transportadores para evitar efeitos tóxicos. Indubitàvelmente, a homeostase do metal deve ser controlada firmemente para assegurar-se de que os tipos específicos da pilha mantenham níveis apropriados de metais. Por este motivo, há uma necessidade significativa de avançar técnicas para a medida exata de metais de traço em amostras biológicas. Em desenvolver e em organismos maduros existe uma necessidade biológica diferencial para oligoelementos no nível celular, em estágios desenvolventes diferentes, e em circunstâncias normais e patológicas. Conseqüentemente, a determinação precisa de níveis do tecido e do metal sistemático é necessária para compreender a homeostase do metal do organismo.
A espectrometria de absorção atômica da fornalha da grafita (GF-AAS) é uma técnica altamente sensível usada para volumes pequenos da amostra, fazendo o ideal medir a transição e os metais pesados atuais em amostras biológicas e ambientais25,26 , 27 anos de , 28. Além disso, devido à alta sensibilidade da técnica, demonstrou-se apropriado para o estudo das propriedades de transporte fino de na+/K+-ATPase e H+/k+-ATPase gástrica usando Xenopus Os oócitos como um sistema modelo29. Em GF-AAS, os elementos atomizados dentro de uma amostra absorvem um comprimento de onda de radiação emitida por uma fonte luminosa contendo o metal de interesse, com a radiação absorvida proporcional à concentração do elemento. A excitação eletrônica elementar ocorre em cima da absorção da radiação ultravioleta ou visível em um processo quantized original para cada elemento químico. Em um único processo de elétron, a absorção de um fóton envolve um elétron movendo-se de um nível de energia mais baixo para um nível mais alto dentro do átomo e GF-AAS determina a quantidade de fótons absorvidos pela amostra, que é proporcional ao número de radiação absorvendo elementos atomizados no tubo de grafite.
A seletividade desta técnica depende da estrutura eletrônica dos átomos, em que cada elemento tem uma linha espectral específica de absorção/emissão. No caso do Zn, o comprimento de onda da absorvência é 213,9 nm e pode ser distinguido precisamente de outros metais. No geral, o GF-AAS pode ser utilizado para quantificar o Zn com limites adequados de detecção (LOD) e alta sensibilidade e seletividade25. As mudanças no comprimento de onda absorvido são integradas e apresentadas como picos de absorção de energia em comprimentos de onda específicos e isolados. A concentração do Zn em uma determinada amostra é geralmente calculada a partir de uma curva padrão de concentrações conhecidas de acordo com a lei Beer-Lambert, na qual a absorvência é diretamente proporcional à concentração de Zn na amostra. No entanto, a aplicação da equação de Beer-Lambert às análises de GF-AAS também apresenta algumas complicações. Por exemplo, variações na atomização e/ou concentrações não homogêneas das amostras podem afetar as medições metálicas.
A atomização do metal exigida para a análise elementar do traço do GF AAS consiste em três etapas fundamentais. O primeiro passo é a desolvação, onde o solvente líquido é evaporado; deixando compostos secos após o forno atinge uma temperatura de cerca de 100 ° c. Em seguida, os compostos são vaporizado por aquecendo-os de 800 a 1.400 ° c (dependendo do elemento a ser analisado) e tornar-se um gás. Finalmente, os compostos no estado gasoso são atomizados com temperaturas que variam de 1.500 a 2.500 ° c. Como discutido acima, o aumento das concentrações de um metal de interesse irá render aumentos proporcionais na absorção detectada pelo GF-AAS, mas o forno reduz a gama dinâmica de análise, que é a gama de trabalho de concentrações que podem ser determinado pelo instrumento. Assim, a técnica requer baixas concentrações e uma cuidadosa determinação da amplitude dinâmica do método, determinando o LOD e o limite de linearidade (LOL) da lei Beer-Lambert. O LOD é a quantidade mínima necessária para que uma substância seja detectada, definida como três vezes o desvio padrão de Zn na matriz. O LOL é a concentração máxima que pode ser detectada usando a lei de Beer-Lambert.
Neste trabalho, descrevemos um método padrão para analisar os teores de Zn em extratos celulares inteiros, frações citoplasmáticas e nucleares, e em proliferar e diferenciar células cultivadas (Figura 1). Adaptamos o rápido isolamento do protocolo de núcleos a diferentes sistemas celulares para evitar a perda de metal durante a preparação da amostra. Os modelos celulares utilizados foram mioblasts primários derivados de células de satélite de camundongo, células de neuroblastoma murino (N2A ou Neuro2A), adipócitos murino 3T3 L1, uma linha celular epitelial de mama não tumorigênica humana (MCF10A) e rim canino Madin-Darby epitelial ( MDCK). Estas pilhas foram estabelecidas das linhagens diferentes e são bons modelos para investigar variações específicas da linhagem de níveis do metal in vitro.
Os mioblastos preliminares derivados das pilhas satélites do rato constituem um modelo in vitro well-adequado para investigar a diferenciação do músculo esqueletal. A proliferação destas pilhas é rápida quando cultivada condições elevadas do soro. A diferenciação na linhagem muscular é então induzida por baixas condições do soro30. O neuroblastoma murino (N2A) estabeleceu a linha celular foi derivado da crista neural do rato. Estas pilhas apresentam a morfologia neuronal e amebóide da pilha de haste. Em cima do estímulo da diferenciação, as pilhas N2A apresentam diversas propriedades dos neurônios, tais como neurofilamentos. N2A células são usadas para investigar a doença de Alzheimer, o crescimento do neurite e a neurotoxicidade31,32,33. Os pré-adipócitos murinos de 3T3-L1 estabelecidos na linhagem celular são comumente utilizados para investigar as alterações metabólicas e fisiológicas associadas à adipogênese. Essas células apresentam uma morfologia fibroblástica, mas uma vez estimuladas para diferenciação, apresentam ativação enzimática associada à síntese lipídica e acúmulo de triglicerídeos. Isso pode ser observado como alterações morfológicas para produzir gotas lipídicas citoplasmáticas34,35. MCF10A é uma linha celular epithelial mamária do não-tumor derivada de uma mulher na pré-menopausa com doença fibrocística mamária36. Tem sido amplamente utilizado para estudos bioquímicos, moleculares e celulares relacionados à carcinogênese mamária, como proliferação, migração celular e invasão. O rim canino de Madin-Darby (MDCK) linha de pilha epithelial foi usado extensivamente para investigar as propriedades e os eventos moleculars associados com o estabelecimento do phenotype epithelial. Ao chegar à confluência, estas células tornam-se polarizadas e estabelecem aderências de células celulares, características dos tecidos epiteliais de mamíferos37.
Para testar a capacidade de AAS para medir os níveis de Zn em células de mamíferos, analisamos frações inteiras e subcelulares (citosol e núcleo) dessas cinco linhagens celulares. As medidas do AAS mostraram concentrações diferentes de Zn nestes tipos da pilha. As concentrações foram menores em proliferating e diferenciando-se os mioblastos preliminares (4 a 7 nmol/mg da proteína) e mais altamente nas quatro linhas de pilha estabelecidas (que variam de 20 a 40 nmol/magnésio da proteína). Um aumento não-significativo pequeno em níveis de Zn foi detectado em diferenciar mioblastos preliminares e pilhas do neuroblastoma quando comparado às pilhas proliferating. O efeito oposto foi detectado em adipocytes diferenciados. Entretanto, as pilhas 3T3-L1 proliferating exibiram umas concentrações mais elevadas do metal comparadas às pilhas diferenciadas. É importante ressaltar que, nessas três linhagens celulares, o fracionamento subcelular mostrou que o Zn é distribuído diferencialmente no citosol e no núcleo de acordo com o estado metabólico dessas células. Por exemplo, em proliferating mioblasts, células N2A, e 3T3-L1 pré-adipócitos, a maioria do metal é localizada ao núcleo. Em cima da indução da diferenciação usando tratamentos de pilha específicos, Zn localizado ao citosol nestes três tipos da pilha. Curiosamente, ambas as linhagens epiteliais mostraram níveis mais elevados de Zn durante a proliferação quando comparados ao alcance da confluência, em que uma monocamada apertada característica foi formada. Na proliferação de células epiteliais, a linhagem celular mamária MCF10A apresentou igual distribuição de Zn entre o citosol e o núcleo, enquanto na linhagem celular derivada do rim, a maior parte do metal foi localizada no núcleo. Nestes dois tipos da pilha, quando as pilhas alcangaram a confluência, Zn foi ficada situada predominantly ao cytosol. Esses resultados demonstram que a GF-AAS é uma técnica altamente sensível e precisa para a realização de análises elementares em amostras de baixo rendimento. GF-AAS acoplado com fracionamento subcelular e pode ser adaptado para investigar os níveis de oligoelementos metálicos em diferentes linhagens celulares e tecidos.

<table><tbody><tr><td>3-isobutil-1-metilxantina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1005706</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo anti-Brg1 (G7)</td><td>Santa Cruz biotechnologies</td><td>sc-17796</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-b-tubulina (BT7R)</td><td>Thermo Scientific</td><td>MA5-16308</td><td></td></tr><tr><td>Bradford</td><td>Biorad</td><td>5000205</td><td></td></tr><tr><td>Dexametasona</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>Meio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM)</td><td>ThermoFischer-Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Meio de Eagle Modificado de Dulbecco/Mistura de Nutrientes (DMEM/F12)</td><td>ThermoFischer-Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr> Solução salina <tr><td>tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS)</td><td>ThermoFischer-Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Fator de Crescimento Epidêmico (EGF)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E9644</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino (FBS)</td><td>ThermoFischer-Gibco</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>Fator de Crescimento Fibroblástico-Básico (FGF) (AA 10-155)</td><td>ThermoFischer-Gibco</td><td>PHG0024</td><td></td></tr><tr><td>Soro de cavalo</td><td>ThermoFischer-Gibco</td><td>16050122</td><td></td></tr><tr><td>Hidrocortisona</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H0888</td><td></td></tr><tr><td>Peróxido de hidrogênio (H2O2)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>95321</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>91077C</td><td></td></tr><tr><td>Insulina-Transferrina-Selênio-A</td><td>ThermoFischer</td><td>51300044</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Nítrico (HNO3)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>438073</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P-40 (NP-40)</td><td>Thermo Scientific</td><td>85125</td><td></td></tr><tr><td>OptiMEM (Meio de Soro Reduzido)</td><td>ThermoFischer-Gibco</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>ThermoFischer-Gibco</td><td>15140148</td><td></td></tr><tr><td>PureCol (Colágeno)</td><td>Advanced BioMatrix</td><td>5005</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Retionic</td><td>Sigma Aldrich</td><td>PHR1187</td><td></td></tr><tr><td>Troglitazona</td><td>Sigma Aldrich</td><td>648469-M</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25%), vermelho</td> <td>de fenolThermoFischer-Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Zinco (Zn) Pure Single-Element Standard, 1,000 &micro; g/mL, 2% HNO3</td><td>Perkin Elmer</td><td>N9300168</td><td></td></tr><tr><td>Linhas Celulares Estabelecidas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3T3-L1 Coleção de</td><td>Cultura de Tipo Americano</td><td>CL-173</td><td></td></tr><tr><td>MCDK</td><td>Coleção de Cultura de Tipo Americano</td><td>CCL-34</td><td></td></tr><tr><td>MCF10A</td><td>Coleção de Cultura de Tipo Americano</td><td>CRL-10317</td><td></td></tr><tr><td>N2A</td><td>Americana Tipo Coleção</td><td>de Cultura CCL-131</td><td></td></tr><tr><td>Equipamento</td>Espectrofotômetro de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Absorção Atômica</td><td>PerkinElmer</td><td>Aanalyst 800</td><td></td></tr><tr><td>Bioruptor</td><td>Diagnode</td><td>UCD-200</td><td></td></tr></tbody></table>

espectroscopia de absorvância atômica para medir piscinas de zinco intracelular em células de mamíferos

Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells

Os metais de transição são micronutrientes essenciais para os organismos, mas podem ser tóxicos para as células em altas concentrações, competindo com metais fisiológicos em proteínas e gerando estresse redox. As condições patológicas que levam à depleção ou acúmulo de metal são agentes causais de diferentes doenças humanas. Alguns exemplos incluem anemia, Acrodermatite enteropática, e as doenças de Wilson e Menkes. Portanto, é importante poder medir os níveis e o transporte de metais de transição em amostras biológicas com alta sensibilidade e precisão, a fim de facilitar a pesquisa explorando como esses elementos contribuem para as funções fisiológicas normais e Toxicidade. O zinco (Zn), por exemplo, é um cofator em muitas proteínas de mamíferos, participa em eventos de sinalização, e é um mensageiro secundário nas pilhas. Em excesso, Zn é tóxico e pode inibir a absorção de outros metais, enquanto no déficit, pode levar a uma variedade de condições potencialmente letais.

A espectroscopia de absorção atômica do forno de grafite (GF-AAS) fornece um método altamente sensível e efetivo para a determinação de Zn e outras concentrações metálicas de transição em diversas amostras biológicas. A atomização Eletrotérmica via GF-AAS quantifica metais por atomização de pequenos volumes de amostras para posterior análise seletiva de absorção usando o comprimento de onda da excitação do elemento de interesse. Dentro dos limites da linearidade da lei Beer-Lambert, a absorvância da luz pelo metal é diretamente proporcional à concentração do analito. Comparado a outros métodos de determinação do teor de Zn, o GF-AAS detecta Zn livre e complexado em proteínas e possivelmente em pequenas moléculas intracelulares com alta sensibilidade em pequenos volumes amostrais. Além disso, GF-AAS também é mais prontamente acessível do que a espectrometria de massa plasmática indutivamente acoplada (ICP-MS) ou fluorescência de raios-X à base de síncrotron. Neste método, descreve-se a preparação sistemática de amostras de diferentes linhagens de células cultivadas para análises em GF-AAS. As variações neste elemento de traço foram comparadas em lysates inteiros da pilha e em frações subcellular de pilhas proliferating e diferenciadas como a prova do princípio.

Testou-se a capacidade do GF-AAS em detectar níveis de Zn em células mamíferas (Figura 1). Assim, nós cultivou os mioblastos preliminares derivados das pilhas satélites do rato, e as linhas de pilha estabelecidas N2A (neuroblastoma derivado), 3T3 L1 (adipocytes), MCF10A (epitélio da mama), e pilhas de MDCK (epitélio do rim do cão). Primeiramente, foram isoladas frações de células inteiras, citosónicas e nucleares de todos esses tipos de células e avaliaram a ...

Linhas celulares primárias ou estabelecidas cultivadas são comumente usadas para abordar questões biológicas e mecanísticas fundamentais como uma abordagem inicial antes de usar modelos animais. Este protocolo descreve como preparar extratos de células inteiras e frações subcelulares para estudos de zinco (Zn) e outros oligoelementos com espectroscopia de absorvância atômica.

Espectroscopia de absorvância atômica para medir piscinas de zinco intracelular em células de mamíferos

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in ...

O papel dos metais de transição no desenvolvimento dos mamíferos é em grande parte subestimado. Evidências emergentes mostram que a homeostase metálica continua a mudar de acordo com o estágio de desenvolvimento das células e tecidos. Além disso, os destinos celulares específicos dos metais também variam em desenvolvimento, e, claro, é desafiador identificar sua localização.Até o momento, diferentes técnicas analíticas foram desenvolvidas para quantificar metais, mas a maioria é cara ou inacessível. A pesquisa intensiva é focada para melhorar as determinações metálicas de forma mais acessível e eficiente. Espectroscopia de absorção atômica do forno de grafite, GF-AAS, tem duas principais vantagens.Fornece baixos limites de detecção para zinco, permitindo uma análise precisa do zinco. É também uma técnica que não requer grandes volumes de amostra, microliters de solução tendem a ser suficientes para realizar a análise. A combinação dessas duas vantagens torna o GF-AAS ideal para analisar elementos de rastreamento em amostras de baixo volume.Várias condições patológicas humanas estão relacionadas a desequilíbrios metálicos. Alguns exemplos são anemia, acrodermatite enteropathica e doenças de Wilson e Menkes. Por isso, é importante desenvolver métodos eficientes e confiáveis para medir os níveis de metais de transição em amostras biológicas com alta sensibilidade e precisão.GF-AAS é um excelente exemplo em uma tecnologia que facilita a determinação de qualquer metal em condições fisiológicas normais e em casos patogênicos. O método é muito versátil. Pode ser aplicado a muitos sistemas e muitos elementos podem ser análises usando GF-AAS.Os desafios são estabelecer o limite de método de detecção na realidade, garantindo que as amostras se enquadram nesse limite. Dado o fato de que o volume de amostras é baixo, não há muito espaço para testes, por isso o exame cuidadoso dos dados precisa ocorrer desde o início. Após a primeira análise das amostras, precisamos estabelecer qual é o fator de diluição necessário para levar as amostras aos limites necessários para quantificação.Certifique-se de que você é capaz de fracionar os núcleos corretamente antes de ir para o AAS. Manchas ocidentais são sempre uma boa validação antes da análise espectroscópica. Enquanto o GF-AAS requer volumes baixos, as piscinas intracelulares já estão em volumes baixos.Isso dá pouco espaço para testes. As primeiras medidas precisam ser cuidadosamente feitas e examinadas, para que o tratamento amostral possa ser minimizado para apenas um fator de diluição. Para começar, cultura as células de interesse em placas de 55 centímetros quadrados.Use uma armadilha de vácuo para aspirar a mídia cultural. Certifique-se de remover todos os traços da mídia. Use PBS gelado livre de cálcio e magnésio para enxaguar as células dos pontos de tempo desejados, ou condições de cultura, três vezes.Em seguida, adicione um mililitro de PBS gelado à placa, e raspe as células da placa. Transfira as suspensões celulares para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro e mantenha-a no gelo. Centrifugar por 10 segundos a 10.000 vezes G, e remover o supernatante por aspiração.Se for desejada a análise metálica de frações citoplasmáticas e nucleares, resuspenque a pelota celular em 400 microliters de PBS gelado contendo 0,1%NP-40, um detergente não iônico. Transfira 100 microliters para um novo tubo de microcentrifuuge como amostra de células inteiras, e armazene-o a menos 20 graus celsius. Para isolar os núcleos, use uma ponta de micropipette P1000 para pipeta a suspensão celular de 400 microliter para cima e para baixo cinco a dez vezes no gelo.Em seguida, extraia cinco microlitros da suspensão celular e transfira-o para um deslizamento de vidro microscópio. Coloque os cinco microlitros sob um microscópio leve usando um objetivo de 40 vezes para verificar a integridade dos núcleos. Centrifugar a suspensão de 395 microliter lysate de células restantes por 10 segundos a 10.000 vezes G.Transfira o supernatante contendo a fração citosófica para um novo tubo de microcentrifuuagem.Em seguida, adicione 500 microliters do PBS contendo 0,1%NP-40 para enxaguar a pelota com a fração nuclear, e centrífuga por 10 segundos a 10.000 vezes G.Remova o supernante e resuspenque a pelota contendo os núcleos em 100 microliters da mesma solução. Para lise as células, use um Bioruptor para sonicar toda a célula e núcleos contendo solução três vezes, cada uma por cinco minutos. Prossiga para realizar o controle de qualidade da pureza das frações por mancha ocidental, usando anticorpos específicos para as frações nucleares ou citosóicas.Primeiro, adicione um volume igual de ácido nítrico concentrado de grau metálico de traço a toda a célula, citoplasmática e frações nucleares contendo 100, 500 e 100 microliters de suspensão celular em tubos de microcentrifuge de 1,5 mililitro, e coloque-os em um bloco térmico a 80 graus celsius para mineralizar a cultura celular por uma hora. Depois disso, retire os tubos do bloco térmico e coloque-os em um rack para continuar a digestão ácida durante a noite a 20 graus celsius. Pare a reação adicionando 30% do volume amostral de peróxido de hidrogênio.Leve o volume amostral para 500 microliters com 18 mega Ohm de água purificada. Em seguida, em um tubo Falcon de 15 mililitros dilui óxido nítrico padrão de grau analítico em água purificada a 18 mega Ohms para preparar dois por cento de volume solução de ácido nítrico como a solução em branco durante a calibração. Em seguida, use a solução de ácido nítrico de dois volumes para diluir uma solução comercialmente disponível de 1.000 ppm de zinco com uma concentração de 1.000 partes por bilhão.Prepare soluções padrão de trabalho a partir da solução padrão de 1.000 partes por milhão de zinco, a solução de 1.000 partes por bilhão, em seguida, dilui-a para 5, 8, 10, 15, 20 e 25 ppb diretamente com 2 volumes por cento solução de ácido nítrico. Coloque um mililitro de 0,1% de modificador de matriz de nitrato de magnésio em copos de amostra de polipropileno e, em seguida, carregue os copos no carrossel autosampler. Programe o espectrômetro de absorção atômica para adicionar automaticamente cinco microliters do modificador de matriz aos padrões de zinco e ao em branco.Defina a mesma condição otimizada no espectrômetro de absorção atômica para as soluções padrão e as amostras, com taxa de fluxo de introdução em 250 mililitros por minuto, temperatura de injeção a 20 graus celsius e temperatura do forno de grafite atingindo 1.800 graus celsius em quatro processos de etapa. Todos os padrões e amostras de um único experimento devem ser medidos ao mesmo tempo para evitar erros devido a diferenças de calibração ou evaporação. Otimize a lâmpada C-HCL a uma corrente de 20 amperes, comprimento de onda de 213,9 nanômetros e fenda de 0,7 nanômetros.Pipeta as amostras em copos de amostra de polipropileno, e coloque-as no carrossel autosampler. O limite mais baixo de detecção de zinco é de 0,01 partes por bilhão. Ao aumentar a concentração dos padrões, o limite superior de detecção de zinco é determinado em 20 partes por bilhão.Após a obtenção de uma curva padrão de zinco, meça as amostras mineralizadas para determinar o teor de metal. Se os dados obtidos ultrapassarem o limite de detecção, diluir as amostras com 18 mega Água Purificada Ohm tratada com ácido nítrico de grau analítico de 0,1%. Neste rápido isolamento do protocolo dos núcleos, uma mancha ocidental representativa de diferenciar myoblasts primários mostra a pureza das frações subcelulares.A enzima remodelador de cromatina Brg1 foi usada para identificar a fração nuclear, e tubulina foi usada para identificar a fração citosolítica. Esta figura mostra micrografias de luz representativas para monocamadas proliferadoras e diferenciadas ou confluentes de cada tipo celular, e o teor correspondente de zinco em extratos celulares inteiros, frações citosóis e nucleares. Todas as linhas celulares analisadas neste estudo mostraram concentrações de zinco na faixa de nanomolar.Myotubes primários diferenciados apresentaram níveis mais altos de zinco do que células proliferadoras. Uma distribuição subcelular semelhante de zinco foi detectada na linha celular derivada do neuroblastoma N2A. Por outro lado, a linha celular 3T3-L1 estabelecida apresentava níveis mais elevados de zinco quando os pré-adipócitos estavam proliferando do que quando foram induzidos ou diferenciados.As células MCF10A apresentaram níveis iguais de zinco entre frações citosóicas e nucleares em células proliferadoras. Uma vez que as células MCF10A atingem confluência, uma redução de 40% nos níveis inteiros de zinco celular foi detectada, e o metal foi encontrado mais concentrado na fração citosolica. Espectrometria de absorção atômica do forno de grafite é uma técnica altamente sensível para medir a transição e metais pesados em amostras biológicas e ambientais.Devem ser tomados cuidados especiais e limpeza na preparação de frações subcelulares, pois a contaminação mínima provavelmente interferirá na análise, devido à sensibilidade do equipamento. Dado os baixos volumes e níveis de traço de metais em cada experimento, é difícil pensar em uma técnica melhor e mais precisa para medir zinco do que o GF-AAS. Não existem técnicas atuais que possam fornecer os limites de detecção e baixo volume necessários ao custo relativamente baixo do GF-AAS.A espectrometria de absorção atômica do forno de grafite é precisa, sensível, econômica e acessível. Esta técnica analítica continuará a melhorar à medida que as tecnologias de detecção elementar continuarem avançando. A aplicação futura para detecção de zinco e outros metais pelo GF-AAS incluirá órgãos, tecidos obtidos a partir de modelos animais e biópsias de pacientes com doenças associadas a desequilíbrios metálicos sistêmicos.O ácido nítrico é um ácido extremamente corrosivo capaz de causar queimaduras químicas graves muito rapidamente. Este produto químico também pode reagir violentamente com certos compostos, como pós metálicos. Devido ao perigo representado pelo ácido nítrico, é importante tomar medidas rigorosas de segurança sempre que manusear ácido nítrico.Ao manusear ácido nítrico, recomendamos fortemente que você use óculos químicos de segurança, escudo facial para proteção de respingos, luvas e respiração de vapor aprovada se a ventilação não for adequada.

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