Name: Ex Vivo expansão de células-tronco hematopoiéticas do cordão humano hemoderivados CD34+ células usando o ácido valproico (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-11T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: Aprenda a expansão ex vivo de células-tronco hematopoiéticas CD34+ do sangue de cordão umbilical humano usando ácido valproico e coquetel de citocinas. Este método simples aumenta células funcionais para medicina regenerativa e terapia de transplante.

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Este trabalho foi financiado pelo NYSTEM conceder a C030136 de R.H. Gostaríamos de agradecer seu feedback e revisão do manuscrito Bartek Jablonski

O HSC ex vivo protocolo de expansão segue as diretrizes do Comitê de ética de pesquisa no Mount Sinai School of Medicine.
1. o buffer e preparação de meios de comunicação
<ol><li>Preparar o tampão de separação 24 h antes do isolamento do CD34+ células de UBCs, adicionando 2 mL de 0.5 M etileno diamina Tetra-ácido acético (EDTA) e 33 mL de 7,5% albumina de soro bovino (BSA) para 465 mL tamponada solução salina (1X PBS). Misture suavemente e manter o buffer durante a noite a 4 ° C.</li>
	<li>Mídia quente na temperatura de quarto no dia da purificação.</li>
</ol>2. isolamento de células mononucleares (PTM) de UCB unidade
<ol><li>Dispense a unidade inteira da UCB em um balão de2 de 75 cm. Diluir e misture suavemente o UCB com um volume igual de PBS em temperatura ambiente.</li>
	<li>Determine o número de tubos necessários para o processamento de toda a unidade UCB (um tubo cónico de 50 mL pode ser usado para processar 35 mL da UCB diluído). Adicionar 15 mL de mídia de gradiente de densidade (ver Tabela de materiais) para cada tubo e dispense a UCB diluído no topo da mídia gradiente de densidade, criando duas camadas. Nota: Dispense a UCB diluído muito lentamente, mantendo o tubo em um ângulo de 45° para evitar a mistura da camada de mídia gradiente de densidade com a UCB.</li>
	<li>Centrifugar a 400 x g durante 30 min a uma baixa taxa de aceleração e desaceleração. Após a centrifugação, as multinacionais localizar na camada branca (buffy coat) entre a camada de mídia gradiente plasma e densidade.</li>
	<li>2/3 do plasma, Aspire lentamente sem perturbar a camada de revestimento buffy. Transferi com cuidado a camada de revestimento buffy para um novo tubo de 50 mL. Colete todas as multinacionais da mesma unidade UCB em um tubo de 50 mL até atingir 25 mL. Use um tubo novo se o volume das MNCs coletados exceder 25 mL.</li>
	<li>Adicionar 25 mL de PBS frio no tubo contendo 25 mL de multinacionais e misture bem. Centrifugar a 400 x g por 10 min a 4 ° C. Nota: PBS frio é importante para prevenir tampando de anticorpos na superfície das células e reduzir a rotulagem não-específica.</li>
	<li>Aspire cuidadosamente o sobrenadante e suavemente Ressuspender o sedimento celular em 50 mL de PBS frio.</li>
	<li>Remova 20 μL da suspensão de células para a contagem. Conte o número de células corado com iodeto de propidium/laranja de acridina coloração usando um contador automatizado de células. Calcule o número total de multinacionais. Nota: A contagem de células também pode ser realizada pelo método de exclusão azul trypan usando um hemocytometer.</li>
	<li>Centrifugar a 400 x g por 15 min a 4 ° C. Nota: Se não é necessária imediatamente, as multinacionais podem ser congeladas nesta fase.</li>
</ol>3. isolamento de CD34+ células de UCBs
<ol><li>Preparar o CD34+ anticorpo juntamente com solução de grânulos magnético para isolamento de CD34+ células de MNCs. Mix 300 µ l de tampão de separação com 100 µ l de IgG humana humana FcR (Reagente de bloqueio) e 100 µ l de CD34 grânulos magnéticos para isolamento de CD34 + células de cada 108 MNCs. Para o isolamento de um maior número de CD34+ células de (> 108) MNCs, scale-up reagentes em conformidade.</li>
	<li>Aspire cuidadosamente o sobrenadante do tubo centrifugado a passo 2.8. Resuspenda o pellet em solução grânulos magnético CD34 preparada no passo 3.1 (usar 500 µ l de solução por 108 células).</li>
	<li>Misture delicadamente e incubar a 4 ° C por 30 min. Nota: Prepare o dispositivo separador de células (veja a Tabela de materiais) durante o período de incubação. Substituir a solução de armazenamento com a reserva de trabalho, conforme indicado pelas instruções do fabricante e executar um programa de lavagem, seguido de um programa de lavagem.</li>
	<li>Adicione separador de cela fria executando o buffer para o tubo contendo a mistura de célula até que o tubo é totalmente preenchido. Centrifugar a 400 x g por 15 min a 4 ° C.</li>
	<li>Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células no separador de cela fria correr buffer (2 mL/108 células). Transferi a 2 mL da mistura de suspensão de células para tubos de 15 mL.</li>
	<li>Carga 3 conjuntos de tubos de 15 mL dentro do rack de separador de células prechilled a 4 ° C. Um conjunto de tubos contém as multinacionais, o segundo conjunto de tubos será usado para coletar a fração negativa e o terceiro conjunto de tubos será usado para coletar purificada CD34+ células.</li>
	<li>Carregar o rack para o dispositivo separador celular e executar o programa predefinido de posseld2 . Nota: Um método alternativo que utiliza o separador magnético manual pode ser usado para substituir a célula separador dispositivo12 .</li>
	<li>Tubos de centrífuga com a fração positiva a 400 x g durante 15 min a 4 ° C. Aspirar o sobrenadante e ressuspender purificada CD34+ células em 1 mL de soro-free media.</li>
	<li>Conte as células coradas com iodeto de propidium/laranja de acridina usando um contador automatizado de células. Nota: Se não é necessária imediatamente, purificado CD34+ células podem ser congeladas nesta fase.</li>
</ol>4. VPA Ex Vivo expansão de células purificadas de UCB-CD34+ 
<ol><li>Preparar um volume suficiente de mídia para o CD34 purificado da placa+ células em uma densidade de 3.3 x 104 células/mL. A composição de meios de cultura é o meio de cultura livre do soro (ver Tabela de materiais) suplementado com 10 µ l/mL caneta/estreptococos, fator de células-tronco 150 ng/mL (SCF), 100 ng/mL fms-como tirosina quinase do receptor 3 (FLT3 ligante), 100 ng/mL Trombopoietina (TPO), e 50 ng/mL interleucina 3 (IL-3).</li>
	<li>Placa purificado CD34 em uma placa de 12 células+ (5 x 104 CD34+ células / 1,5 mL de mídia / bem) e cultura a 37 ° C numa incubadora umidificado 5% CO2 .</li>
	<li>Avaliar a pureza do CD34 isolado+ células e composição da célula por análise de FACS conforme descrito abaixo na etapa 6.3.</li>
	<li>Adicione VPA em uma concentração final de 1 mM para as culturas de células tratadas para 16 h com cocktail de citocina.</li>
	<li>Cultura das células por mais 7 dias a 37 ° C numa incubadora umidificado 5% CO2 . Nota: Mídia permanece inalterada durante a duração do ex vivo expansão.</li>
</ol>5. anticorpo que mancha para análise de citometria de fluxo
<ol><li>Prepare a solução de anticorpo de coloração para manchar a 2 x 104– 6 x 104 células e isotipo solução para determinar FACS gating estratégia e determinar o nível de ligação não-específica. Diluir a anticorpos (1/100 da APC anti-CD34, 1/200 FITC anti-CD90) e os respectivos isotipos em 50 µ l de tampão de separação (composição de tampão de separação é definida na etapa 1.1). Nota: Realize a única mancha de células com cada anticorpo para um estratégia de retenção de FMO. Kit de compensação anticorpo total (ver Tabela de materiais) pode ser usado para a configuração de compensação.</li>
	<li>Homogeneizar a cultura de células pipetando várias vezes. Contar as células e pipetar 5 x 104 células para um tubo de 1,5 mL.</li>
	<li>Adicione 1 mL de tampão de separação e centrifugador a 400 x g durante 15 minutos à temperatura ambiente.</li>
	<li>Aspirar o sobrenadante e resuspenda o pellet em 50 µ l da solução de coloração. Incube as células por 30 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Adicione 450 µ l de tampão de separação e centrifugador a 400 x g durante 15 minutos à temperatura ambiente.</li>
	<li>Aspirar o sobrenadante e resuspenda o pellet em 100 µ l de tampão de separação. Manter as células no gelo pelo menos 5 min até a realização de análises FACS. Adicione 1 µ l de 7-AAD para portão de células viáveis.</li>
	<li>Carregar a amostra de células coradas na máquina FACS e adquirir as células para a mais baixa taxa de fluxo.</li>
	<li>Para cada fluoróforo, analise o isotipo controles e única células manchadas para configurar gating para FITC (CD90), APC (CD34) e coloração PerCP/Cy5.5 (7-AAD).</li>
	<li>Portão PerCP/Cy5.5 negativo fração e trama do APC vs FITC para determinar a porcentagem de CD34 viável+, CD90+,e CD34+CD90+ células que define a população HSPC/HSC na cultura.</li>
</ol>6. anticorpo que mancha para fluxo Cytometry célula classificação
<ol><li>Ressuspender as células expandidas pipetando várias vezes. Contar o número de celular e transferir toda a cultura para um tubo de 15 mL ou 50 mL.</li>
	<li>Encha o tubo com buffer de separação frio</li>
	<li>Centrifugar a 400 x g por 15 min a 4 ° C.</li>
	<li>Prepare a solução anticorpo-coloração para manchar a 5 x 105– 2 x 106 células e isotipo solução para manchar a 1 x 105 células e determinar a retenção de FACS. Diluir 1/10 (APC anti-CD34), 1/20 (FITC-CD90) anticorpos e os isotipos correspondentes em 500 µ l de separação de buffer por cada condição.</li>
	<li>Prepare os controles de compensação de cor única usando um kit de grânulo anticorpo total compensação de acordo com as instruções do fabricante.</li>
	<li>Transferir o sobrenadante do passo 5.2 para um novo tubo e mantê-lo a 37 ° C. Este meios de cultura será reutilizado para cultura de células classificadas.</li>
	<li>Resuspenda o pellet de células no buffer de separação fria para obter uma concentração de 5 x 105 células / mL. Transferi 1 x 105 células em tubos de 1,5 mL para coloração de isotipo e as células restantes que serão classificadas em outros tubos de 1,5 mL.</li>
	<li>Centrifugar os tubos a 400 x g durante 15 min a 4 ° C.</li>
	<li>Desprezar o sobrenadante e ressuspender pelotas de células no isotipo de coloração da solução e o pellet de células que será classificada no anticorpo que mancha a solução.</li>
	<li>Incubar durante 30 min a 4 ° C.</li>
	<li>Adicionar 450 µ l de tampão de separação e centrifugador a 400 x g durante 15 min a 4 ° C.</li>
	<li>Resuspenda as pelotas com 2 mL de tampão frio separação.</li>
	<li>Para evitar entupimentos, filtre as amostras através de um filtro de célula μm 40 e lugar no gelo até FACS.</li>
	<li>Classificador de pilha de set-up para classificação com os parâmetros corretos.</li>
	<li>Isotype executar amostras para definir a tensão e ganhar para frente e lado scatter e identificação de populações de fluorescência negativa.</li>
	<li>Controles de execução única cor para definir coeficientes de compensação e aplique compensado parâmetro para protocolo de coleção.</li>
	<li>Execute uma pequena alíquota da amostra (Ab) (eventos de ~ 50.000) para estabelecer a estratégia associada.</li>
	<li>Configurar as decisões de classificação para coletar o CD34+ CD90 fração de celular– .</li>
	<li>Células do tipo coleção tubos revestidos com 2 mL de tampão de separação.</li>
	<li>Depois da classificação, recontar as células e centrifugá-los a 400 x g durante 15 min a 4 ° C.</li>
	<li>Desprezar o sobrenadante e ressuspender o precipitado na mídia recuperada na etapa 5.5 para atingir uma concentração final de 3 x 104 células/mL.</li>
	<li>Placa CD34+ CD90– purificado de células em placas de 12 poços com média de 1,5 mL/poço (5 x 104 CD34+ CD90– células/1.5 mL de mídia/poço).</li>
	<li>Avalie a pureza por análise de FACS usando 50 µ l de células contendo mídia.</li>
	<li>Tratar as culturas de CD34+CD90– células com VPA em concentração final de 1mM.</li>
	<li>Incube a 37 ° C numa incubadora umidificado 5% CO2 .</li>
</ol>

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<li>Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Role+in+Stemness+and+Differentiation+of+Hematopoietic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Role in Stemness and Differentiation of Hematopoietic Stem Cells.</a> Stem Cells International. , In press (2019).</li>
<li>Genovese, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+genome+editing+in+human+repopulating+haematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Targeted genome editing in human repopulating haematopoietic stem cells.</a> Nature. 510 (7504), 235-240 (2014).</li>
<li>Perdomo, J., Yan, F., Leung, H. H. L., Chong, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Megakaryocyte+Differentiation+and+Platelet+Formation+from+Human+Cord+Blood-derived+CD34%2B+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (130), e56420(2017).</li>
<li>Fares, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EPCR+expression+marks+UM171-expanded+CD34%28%2B%29+cord+blood+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">EPCR expression marks UM171-expanded CD34(+) cord blood stem cells.</a> Blood. 129 (25), 3344-3351 (2017).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Neste documento, apresentamos um protocolo para rapidamente expandir significativamente o número de linfócitos humanos funcionais de UCBs. Os estudos cinéticos e piloto usando este protocolo indicam que o ex vivo expandidas células prontamente adquirir e manter a expressão de vários marcadores fenotípicos HSC incluindo CD90, bem como os primitivos HSC características metabólicas9.
Ex vivo protocolo de expansão é relativamente simples e confiável. Purificação de CD34<sup...

Ex vivo expansão de células-tronco hematopoiéticas (linfócitos) do sangue do cordão umbilical unidades (UCB) é uma grande promessa para aplicações de HSC na terapia de transplante e medicina regenerativa. Transplante com unidades UCB tem várias vantagens exclusivas, tais como a coleção fácil, alta disponibilidade, risco mínimo de infecção, baixo risco de recaída da doença e de baixa frequência da doença enxerto-versus-hospedeiro (GVHD). No entanto, as principais desvantagens da sua utilização em ambientes clínicos são o número limitado de linfócitos presentes dentro de cada UCB unidade1. O número insuficiente de linfócitos resulta em atrasada enxertia e recuperação hematopoiética, risco de rejeição do enxerto e reconstituição imune aberrante.
Atualmente, vários métodos e estratégias foram desenvolvidas para ex vivo expandir o número limitado de linfócitos de UCBs. Combinações de diferentes citocinas cocktails com pequenas moléculas ou compostos em ex vivo resultado de culturas em vários graus de expansão em HSC números2,3,4,5,6, 7,8. Importante, ex vivo cultura condições induzem estresse, levando à proliferação celular rápida, aumento da atividade metabólico e perda das características primitivas que definem linfócitos primários. Portanto, protocolos em desenvolvimento que levam à expansão de um grande número de linfócitos funcionais com características que se assemelham a primários linfócitos primitivos são necessários.
Culturas de soro livre de CD34+ células isoladas de UCBs e tratados com resultado de (VPA) ácido valproico na expansão de um grande número de linfócitos primitivos4,9,10. A expansão de HSC não é unicamente devido à proliferação dos linfócitos existentes derivado UCBs. Em vez disso, esta expansão é devido à aquisição de um fenótipo primitivo, combinado com um número limitado de divisões celulares e proliferação9. Dentro o inicial 24 – 48 h de incubação com uma combinação de citocinas e VPA, CD34+ células adquirem um perfil fenotípico que caracterizam a longo prazo linfócitos e transcriptomic. O aumento significativo da percentagem de linfócitos é acompanhado por um aumento rápido do número de linfócitos (aumento de 63 vezes dentro de 24 h de tratamento VPA)9. Nomeadamente, a estratégia de expansão do VPA-ex vivo expande linfócitos com baixa atividade metabólica, que destaca ainda mais suas características primitivas.
O método descrito aqui fornece condições e tratamentos que levam a um grau significativo de ex vivo expansão dos linfócitos primitivos para qualquer clínica ou aplicações de laboratório. Ex vivo de estratégia de expansão usa um cocktail de citocina combinado com tratamento de VPA. VPA é um medicamento aprovado pela FDA para o tratamento de transtorno bipolar e outras doenças neurológicas. A expansão de HSC com VPA é rápida e ocorre dentro de 7 dias, minimizando o tempo de manipulação e o risco de contaminação. Importante, este protocolo permite a aquisição de longo prazo marcadores fenotípicos de HSC como CD90 e CD49f dentro de 24-48 h após o tratamento com VPA9. Enxertos HSC expandidos criados com este protocolo têm a capacidade de regenerar o sistema hematopoiético, uma vez que podem se diferenciar em todas as linhagens de células hematopoiéticas e estabelecer a longo prazo enxertia após transplante em ratos NSG myeloablated modelos4. Além disso, este protocolo é altamente reprodutível e permite a rápida e eficiente de isolamento de CD34 viável+ células de UCBs, que é fundamental para a industrialização deste procedimento.
O VPA ex vivo protocolo de expansão também tem potencial para superar a perda significativa de linfócitos, que ocorre durante o gene edição11. Gene edição exige exposição a citocinas, que são necessárias para ciclismo células e ativação dos mecanismos de reparação do DNA. Devido aos efeitos de alerta do tratamento de VPA, esse método pode ser benéfico para a geração de um número maior de células geneticamente modificadas dentro de um período de tempo que é relevante para atualmente utilizados protocolos de modificação genética.

<table><tbody><tr><td>Meios</td><td>de expansão Sigma-Aldrich</td><td>Stemline II meios de expansão de células-tronco S0192-500ML</td><td></td></tr><tr><td>AO / PI (laranja de acridina / iodeto de propídio) solução de coloração para células nucleadas de mamíferos vivos / mortos.</td><td>Nexcelom</td><td>CS2-0106-25mL</td><td></td></tr><tr><td>APC Mouse Anti-Human CD34 Clone 581</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td>555824</td><td></td></tr><tr><td>APC Mouse IgG1, &kappa; Clone de controle de isotipo MOPC-21</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td>555751</td><td></td></tr><tr><td>solução de enxágue autoMACS</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-091-222</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon Tubo de 15 mL</td><td>BD Biosciences</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon 5 mL Tubo de fundo redondo de poliestireno</td><td>BD Biosciences</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon Tubo de 50 mL</td><td>BD Biosciences</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Solução de albumina de soro bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8412</td><td></td></tr><tr><td>CD34 MicroBead Kit, contém grânulos cd34 e reagente bloqueador fcr, humano</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-046-703</td><td></td></tr><tr><td>Analisador de células</td><td>BD Biosciences</td><td>FACS Canto II</td><td></td></tr><tr><td>Analisador e classificador de células</td><td>BD Biosciences</td><td>FACS Aria II</td><td></td></tr><tr><td>Contador de células</td><td>Nexcelom</td><td>Celômetro Auto 2000 Cell Contador</td><td></td>de viabilidade</tr><tr><td>Dispositivo separador</td><td>de células autoMACS Pro Separador Miltenyi Biotec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Câmaras de Contagem</td><td>Nexcelom</td><td>CHT4-PD100-002</td><td></td></tr><tr><td>Mídia de gradiente de densidade</td><td>GE Healthcare Bio-Sciences AB</td><td>17-1440-03</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilenodiamina tetra-acético (EDTA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>E8008-100ML</td><td></td></tr><tr><td>FITC anti-humano CD90 ( Thy1) Clone 5E10</td><td>BIOLEGEND</td><td>328108</td><td></td></tr><tr><td>FITC Mouse IgG1, &kappa; Isotipo Ctrl (FC) Anticorpo</td><td>BIOLEGEND</td><td>400109</td><td></td></tr><tr>Microscópio <td></td><td></td><td></td><td>invertido</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning cellgro</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Proteína ligante humana Flt-3 recombinante</td><td>R& D Systems</td><td>308FKN</td><td></td></tr><tr><td>Proteína Humana Recombinante IL-3 (IL-3)</td><td>R& D Systems</td><td>203-IL</td><td></td></tr><tr><td>Proteína SCF Humana Recombinante</td><td>R& D Systems</td><td>255-SC</td><td></td></tr><tr><td>Proteína de Trombopoetina Humana Recombinante (TPO)</td><td>R& D Systems</td><td>288-TP</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Compensação Total de Anticorpos</td><td>thermofisher</td><td>A10497</td><td></td></tr><tr><td>Programa de Sangue Placentário</td><td>de Cordão Umbilical</td> no Centro de Sangue de Nova York <td>http://nybloodcenter.org/products-services/blood-products/national-cord-blood-program/cord-blood-101/</td><td></td></tr> <tr><td>Sal de sódio de ácido valpróico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4543</td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo expansão de células-tronco hematopoiéticas do cordão humano hemoderivados cd34+ células usando o ácido valproico

Ex Vivo Expansion of Hematopoietic Stem Cells from Human Umbilical Cord Blood-derived CD34+ Cells Using Valproic Acid

Unidades de sangue (UCB) do cordão umbilical fornecem uma fonte alternativa de células-tronco hematopoiéticas humanas (linfócitos) para pacientes que necessitam de transplante de medula óssea alogênico. Enquanto UCB tem várias vantagens exclusivas, o número limitado de linfócitos dentro de cada unidade da UCB limita seu uso na medicina regenerativa e HSC transplante em adultos. Expansão eficiente de linfócitos humanos funcionais pode ser alcançado por ex vivo cultivo de CD34+ células isoladas de UCBs e tratados com um inibidor da deacetilase, ácido valproico (VPA). O protocolo detalhado aqui descreve as condições de cultura e metodologia para isolar rapidamente CD34+ células e expandir para um alto grau, uma piscina de linfócitos primitivos. Os linfócitos expandidos são capazes de estabelecer a enxertia de curto e longo prazo e são capazes de dar origem a todos os tipos de células hematopoiéticas diferenciadas. Esse método também possui potencial para aplicação clínica em terapia de gene autóloga HSC e fornece uma abordagem atraente para superar a perda de linfócitos funcionais associados com a edição de gene.

O ex vivo protocolo descrito aqui aumenta o número de linfócitos primitivos gerados a partir de CD34+ células isoladas de UCBs (Figura 1). Escorva de CD34+ células para 16 h com uma citocina coquetel, seguido de um tratamento com VPA para um adicional 7 dias, leva a um grande grau de expansão do HSC. Notavelmente, o pool de células expandidas é altamente enriquecido para linfócitos, que são fenotipicamente definidos por CD34+C...

Aqui, descrevemos o ex vivo expansão de células-tronco hematopoiéticas do CD34+ células derivadas do sangue do cordão umbilical, tratados com uma combinação de um cocktail de citocinas e VPA. Esse método leva a um grau significativo de ex vivo expansão dos linfócitos primitivos para qualquer clínica ou aplicações de laboratório.

Ex Vivo expansão de células-tronco hematopoiéticas do cordão humano hemoderivados CD34+ células usando o ácido valproico

Umbilical cord blood (UCB) units provide an alternative source of human hematopoietic stem cells (HSCs) for patients who require allogeneic bone marrow ...

A expansão ex vivo de células-tronco hematopoiéticas da unidade sanguínea do cordão umbilical tem grande promessa para a aplicação do HSC em medicina regenerativa e terapia de transplante. Este protocolo usa um coquetel de citocina combinado com o tratamento de ácido valpróico para expandir rapidamente um grande número de HSCs funcionais com características que se assemelham aos HSCs primitivos primários. Devido aos efeitos imediatos do tratamento do ácido valpróico, este método também tem o potencial de superar a perda de HSCs associados à edição de genes.Este método pode ser benéfico para a geração de um maior número de células geneticamente modificadas dentro de um período de tempo que é relevante para protocolos de modificação genética atualmente usados. O protocolo de expansão do ácido valpróico ex vivo é relativamente simples e confiável. A purificação de células CD34 positivas com o dispositivo separador de células é altamente reprodutível e rápida, permitindo a recuperação rápida de células CD34 positivas altamente purificadas.24 horas antes do isolamento das células positivas do CD-34 do sangue do cordão umbilical, prepare o tampão de separação adicionando dois mililitros

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JoVE Journal

Medicine

Medicina

Este protocolo descreve o isolamento ea subsequente expansão de células mesenquimais estromais e as células endoteliais que formam colônias sem o uso de animais soro autólogo para gerar pares para fins de transplante experimental.

Isolamento e animais de Expansão de soro livre de cordão umbilical humano Derivado células mesenquimais estromais (MSCs) e endoteliais Células Progenitoras Colony Forming (ECFCs)

Lentivirus mediada Durante Knockdown Ex Vivo Eritropoese de Células-Tronco Hematopoéticas

Foi desenvolvido um método para derivar directamente células estaminais neurais humanos a partir de células progenitoras hematopoiéticas enriquecidas de células do sangue periférico.

Indução direta de Neurais Human células-tronco de sangue periférico células progenitoras hematopoéticas

O objetivo do presente protocolo é isolar as células progenitoras endoteliais do sangue do cordão umbilical. Algumas das aplicações incluem o uso dessas células como um biomarcador para identificar pacientes com risco cardiovascular, tratamento de doenças isquêmicas, e criando engenharia de tecido vascular e coração válvula de construções.

Isolamento de células progenitoras endoteliais de sangue humano do Cordão Umbilical

O objetivo do presente protocolo é isolar os primatas não-humanos CD34+ células de medula aprontada, gene-modificar estas células com vetores Lentivirus e preparar um produto para infusão no hospedeiro autólogo. O comprimento total do protocolo é aproximadamente 48 h.

Preparação e modificação genética de primatas não humanos tronco hematopoiéticas e células progenitoras

Aqui, nós apresentamos um protocolo para a caracterização immunophenotypic e a diferenciação induzida citocinas do sangue do cabo derivado CD34+ a haste hematopoietic e as pilhas do progenitor às quatro linhagens Myeloid. As aplicações deste protocolo incluem investigações sobre o efeito de mutações da doença Myeloid ou de moléculas pequenas na diferenciação Myeloid das pilhas de CD34+ .

Diferenciação Pan-Myeloid do sangue humano do cabo derivado CD34+ da haste hematopoietic e das pilhas do progenitor

O presente protocolo descreve um procedimento de cultura otimizado de células-tronco hematopoiéticas e células progenitoras (HSPC) para o enxerto robusto de células editadas por genes in vivo.

Edição de Genes CRISPR/Cas9 de Células-Tronco Hematopoiéticas e Progenitoras para Aplicações de Terapia Gênica

Apresentamos aqui um protocolo para iniciar, manter e analisar culturas de células-tronco hematopoéticas de camundongos usando expansão ex vivo à base de álcool polivinílico, bem como métodos para manipulá-las geneticamente por transdução lentiviral e eletroporação.

Ex Vivo Expansão e Manipulação Genética de Células-Tronco Hematopoéticas de Camundongos em Culturas à Base de Álcool Polivinílico

Aqui, estabelecemos osteo-organoides in vivo desencadeados por andaimes de gelatina carregados com proteína 2 morfogenética óssea para colher células-tronco / progenitoras hematopoiéticas terapêuticas para a reconstrução de um sistema hematopoiético e imunológico danificado. No geral, essa abordagem pode fornecer uma fonte celular promissora para terapias celulares.

Abordagem osteoorganoide in vivo para coleta de células-tronco/progenitoras hematopoiéticas terapêuticas

A modelagem da eritropoiese oferece uma chance valiosa de compreender o significado biológico dos atores nesse processo e avaliar novas abordagens terapêuticas que podem aliviar os defeitos de diferenciação. Aqui, descrevemos um método simples e confiável para diferenciar eficientemente células-tronco hematopoiéticas CD34+ e células progenitoras ex vivo.

Um pipeline abrangente para avaliar a eficiência da eritropoiese humana in vitro e ex vivo

Aprenda a expansão ex vivo de células-tronco hematopoiéticas CD34+ do sangue de cordão umbilical humano usando ácido valproico e coquetel de citocinas. Este método simples aumenta células funcionais para medicina regenerativa e terapia de transplante.

Ex Vivo expansão de células-tronco hematopoiéticas do cordão humano hemoderivados CD34⁺ células usando o ácido valproico

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