Name: Métodos para testar a perturbação endócrina na Drosophila melanogaster (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Aprenda métodos para testar a perturbação endócrina em Drosophila melanogaster, avaliando fecundidade, fertilidade, tempo de desenvolvimento e longevidade. Este protocolo oferece uma abordagem prática para estudar disruptores endócrinos in vivo.

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Os autores agradecem Orsolina Petillo pelo apoio técnico. Os autores agradecem ao Dr. Mariarosaria Aletta (CNR) pelo apoio bibliográfico. Os autores agradecem ao Dr. Gustavo Damiano Mita por apresentá-los ao mundo EDC. Os autores agradecem à Leica Microsystems e ao Pasquale romano por sua assistência. Esta pesquisa foi apoiada pelo projeto PON03PE_00110_1. "Sviluppo di nanotecnologie Orientate Alla rigenerazione e ricostruzione tissutale, Implantologia e sensoristica em odontoiatria/oculistica" sigla "sorriso"; Committente: PO FESR 2014-2020 CAMPANIA; Projeto PO FESR Campania 2007-2013 "NANOTECNOLOGIE PER IL RILASCIO CONTROLLATO DI MOLECOLE BIO-ATTIVE NANOTECNOLOGIE".

Os autores não têm nada a revelar.

O Fruit Fly D. melanogaster tem sido extensivamente empregado como um sistema in vivo modelo para investigar os efeitos potenciais de EDCs ambientais, tais como DBP28, BPA, 4-NP, 4-tert-op29, MP30, EP31, 32, DEHP33, e EE234. Várias razões levaram seu uso como modelo neste campo de pesquisa. Aparte de suas vantagens indiscutíveis como u...

As actividades humanas têm vindo a libertar no ambiente uma enorme quantidade de produtos químicos, que representam um grave problema para os organismos e para os ecossistemas naturais1. Destes poluentes, estima-se que cerca de 1.000 produtos químicos diferentes podem alterar o equilíbrio normal dos sistemas endócrinos; de acordo com esta propriedade, eles são classificados como produtos químicos de desregulação endócrina (EDCs). Especificamente, com base em uma definição recente pela sociedade endócrina, os EDCs são "um produto químico exógeno, ou mistura de produtos químicos, que podem interferir com qualquer aspecto da ação hormonal"2. Ao longo das últimas três décadas, tem havido crescente evidência científica de que os EDCs podem afetar a reprodução e o desenvolvimento de animais e plantas3,4,5,6,7, a 8. Além disso, a exposição à EDC tem sido relacionada à crescente prevalência de algumas doenças humanas, incluindo câncer, obesidade, diabetes, doenças da tireoide edistúrbios comportamentais9,10,11.
Mecanismos gerais de EDC
Devido às suas propriedades moleculares, os EDCs comportam-se como hormônios ou precursores hormonais3,4,5,6,7,8,9, 10,11,12. Neste sentido, eles podem se ligar ao receptor de um hormônio e perturbar os sistemas endócrinos, quer imitando a atividade hormonal ou bloqueando hormônios endógenos obrigatório. No primeiro caso, após a ligação ao receptor, eles podem ativá-lo como seu hormônio natural faria. No outro caso, a ligação do EDC ao receptor impede a ligação de seu hormônio natural, de modo que o receptor é bloqueado e não pode mais ser ativado, mesmo na presença de seu hormônio natural3. Consequentemente, os EDCs podem afetar vários processos, como a síntese, secreção, transporte, metabolismo ou ação periférica de hormônios endógenos que são responsáveis pela manutenção da homeostase, reprodução, desenvolvimento e/ou comportamento de o organismo. A ligação do receptor não é a única maneira de ação descrita até agora para os EDCs. Agora é evidente que eles também podem atuar recrutando coativadores ou corepressores em vias enzimáticas ou modificando marcadores epigenéticosdesregulando a expressão gênica10,11,12,13 ,14, com conseqüências não somente para a geração atual mas também para a saúde das gerações para vir8.
Hormônios da Drosophila
Os efeitos potenciais dos EDCs selecionados têm sido amplamente estudados, tanto nas espécies de animais selvagens como em vários sistemas de modelos nos quais os mecanismos endócrinos são razoavelmente conhecidos. Para os invertebrados, os sistemas endócrinos que influenciam o crescimento, o desenvolvimento e a reprodução têm sido extensivamente caracterizados em insetos por várias razões, envolvendo seu uso extensivo no campo da pesquisa biológica, sua importância econômica e Finalmente, o desenvolvimento de inseticidas capazes de interferir especificamente com o sistema hormonal de insetos pragas.
Em particular, entre os insetos, o fruto mosca D. melanogaster provou ser um sistema de modelo muito poderoso para avaliar os efeitos endócrinos potenciais de EDCs. Em D. melanogaster, bem como em vertebrados, os hormônios desempenham um papel importante ao longo de todo o ciclo de vida. Neste organismo, existem três principais sistemas hormonais, que envolvem a hormona esteróide 20-hidroxiecdysona (20e)15,16, o hormônio juvenil sesquiterpenóide (JH)17, e os neuropeptídeos e peptídeos/proteínas hormônios18. Este terceiro grupo consiste em vários peptídeos descobertos mais recentemente, mas claramente envolvidos em uma enorme variedade de processos fisiológicos e comportamentais, como longevidade, homeostase, metabolismo, reprodução, memória e controle locomotor. 20E é homóloga aos hormônios esteróides derivados do colesterol, como o estradiol, enquanto JH compartilha algumas semelhanças com o ácido retinóico; Ambos são os hormônios mais conhecidos em Drosophila19,20. Seu equilíbrio é vital na coordenação da muda e metamorfose, bem como no controle de vários processos pós-desenvolvimentais, tais como reprodução, vida útil e comportamento21, oferecendo assim diferentes possibilidades para testar a glândula endócrina perturbação na Drosophila. Além disso, os hormônios ecdiesteróide e JHS são os principais alvos dos chamados inseticidas de terceira geração, desenvolvidos para interferir com os processos de desenvolvimento e mediado por endócrinos em insetos. O modo de ação agonista ou antagonista desses produtos químicos é bem conhecido e, portanto, eles podem servir como padrões de referência para avaliar os efeitos de potenciais EDCs sobre o crescimento, reprodução e desenvolvimento de insetos22. Por exemplo, o Methoprene, que tem sido amplamente utilizado no controle de mosquitos e outros insetos aquáticos23,24, funciona como um agonista JH e reprisa a transcrição e metamorfose do gene 20e-induced.
Além dos hormônios, a superfamília de receptores nucleares (NR) em Drosophila também é bem conhecida; consiste em 18 fatores de transcrição evolutivamente conservados envolvidos no controle de vias de desenvolvimento dependentes de hormônio, bem como na reprodução e fisiologia25. Estes NRS da hormona pertencem a todos os seis subtypes da superfamília do NR, incluindo aqueles envolvidos na neurotransmissão26, dois para NRS do ácido retinóico, e aqueles para NRS esteróides que, nos Vertebrates, representam um dos alvos preliminares de EDCs27.
Drosophila como um sistema modelo para estudar EDCs
Atualmente, com base em Propriedades moleculares, várias agências ambientais em todo o mundo estão atribuindo o potencial de interferir com os sistemas endócrinos para diferentes produtos químicos feitos pelo homem. Dado que os FED constituem um problema global e onipresente para o ambiente e para os organismos, o objectivo geral da investigação neste domínio é reduzir a sua carga de doença, bem como proteger os organismos vivos dos seus efeitos adversos. A fim de aprofundar o entendimento sobre os potenciais efeitos endócrinos de um produto químico, é necessário testá-lo in vivo. Para este fim, D. melanogaster representa um sistema de modelo válido. Até o momento, a mosca-das-frutas tem sido amplamente utilizada como modelo in vivo para avaliar os efeitos de vários EDCs ambientais; foi relatado que a exposição a vários EDCs, como o ftalato de dibutilo (PAD)28, bisfenol A (BPA), 4-nonylphenol (4-NP), 4-tert-Octilfenol (4-tert-op)29, metilparabeno (MP)30, Etilparabeno (EP)31, 32, bis-(2-ethylhexyl) phthalate (dehp)33, e 17-α-Etinilestradiol (EE2)34, influencia o metabolismo e as funções endócrinas como em modelos vertebrados. Várias razões levaram ao seu uso como modelo neste campo de pesquisa. Além de um excelente conhecimento de seus sistemas endócrinos, outras vantagens incluem seu ciclo de vida curto, baixo custo, genoma facilmente manipulável, uma longa história de pesquisa e várias possibilidades técnicas (consulte o site do FlyBase, http://flybase.org/). D. melanogaster também fornece um modelo poderoso para facilmente estudar efeitos transgeracionais e respostas da população a fatores ambientais8 e evita questões éticas relevantes para estudos in vivo em animais mais elevados. Além, a mosca da fruta compartilha de um alto nível da conservação do gene com os seres humanos que puderam fazer possível para que os ensaios de Drosophila EDC ajudem em prever ou em sugerir efeitos potenciais destes produtos químicos para a saúde humana. Além de ampliar o entendimento sobre os efeitos da saúde humana, a Drosophila pode ajudar a avaliar os riscos da exposição ao ambiente EDC, como a perda de biodiversidade e a degradação ambiental. Finalmente, a mosca da fruta oferece a vantagem adicional de ser usado nos laboratórios, onde os fatores que afetam potencial seu desenvolvimento, reprodução, e vida útil podem ser mantidos o controle a fim atribuir toda a variação à substância a ser testada.
Com isso em mente, otimizamos os ensaios de condicionamento físico simples e robusto para determinar os efeitos do EDC em alguns traços hormonais da Drosophila, como fecundidade/fertilidade, tempo de desenvolvimento e vida adulta. Estes ensaios têm sido amplamente utilizados para alguns EDCs23, 24,25,26,27. Em particular, foram utilizados os seguintes protocolos para avaliar os efeitos da exposição ao estrogênio sintético EE234 e ao BPA e ao BISFENOL AF (BPA F) (dados não publicados). Esses protocolos podem ser facilmente modificados para investigar os efeitos de um determinado EDC de cada vez, bem como os efeitos combinados de múltiplos EDCs em D. melanogaster.

<table><tbody><tr><td>Ágar 17&alfa;-etinilestradiol</td><td>Sigma</td><td>E4876-1G</td><td></td></tr><tr><td>para Drosophila meio</td><td>BIOSIGMA</td><td>789148</td><td></td></tr><tr><td>Bisfenol A</td><td>Sigma</td><td>239658-50G</td><td></td></tr><tr><td>Bisfenol AF</td><td>Sigma</td><td>90477-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Fubá</td><td>CA' BIANCA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Éter dietílico</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Frascos de Drosophila</td><td>BIOSIGMA</td><td>789008</td><td>25 mm x 95 mm</td></tr><tr><td>Frascos de Drosophila</td><td>789009</td><td>29 mm x 95 mm</td><td></td></tr><tr><td>Frascos de Drosophila</td><td>Kaltek</td><td>187</td><td>22 mm x 63 mm</td></tr><tr><td>Gaiola de coleta de embriões</td><td>Crafts</td><td></td><td>Cilindro de plexiglass (12,5 mm x 7 cm) com uma extremidade aberta e a outra extremidade fechada por uma base retangular na qual uma ranhura permite a inserção de bandejas especiais para assentamento</td></tr><tr><td>de etanol</td><td>FLUKA</td><td>2860</td><td></td></tr><tr><td>Etherizer</td><td>Crafts</td><td></td><td>recipiente de vidro cilíndrico com plugue de algodão</td></tr><tr><td>Garrafa de vidro Garrafas</td><td></td><td></td><td>de 250 mL</td></tr><tr><td>Frascos de vidro</td><td>Microtech</td><td>ST 10024</td><td>Tubo de fundo plano 100 x 24</td></tr><tr><td>Varinha mágica Pimmy</td><td>Ariete</td><td></td><td>processador de alimentos</td></tr><tr><td>Instantâneo Fermento de sucesso</td><td>ESKA</td><td></td><td>Fermento em pó</td></tr><tr><td>Bandeja de assentamento</td><td>Artesanato</td><td></td><td>bandejas de plexiglass (11 cm x 2,6 cm) para derramar meio para assentamento</td></tr><tr><td>Metil4-hidroxibenzoato</td><td>SIGMA</td><td>H5501</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri</td><td>Falcon</td><td>351016</td><td>60x5</td></tr><tr><td>Corante vermelho nº 40</td><td>SIGMA</td><td>16035</td><td></td></tr><tr><td>Estereomicroscópio com luzes LED</td><td>Leica</td><td></td><td>S4E</td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>HIMEDIA</td><td>MB025</td><td></td></tr><tr><td>Molho de tomate</td><td>Cirio</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

métodos para testar a perturbação endócrina na drosophila melanogaster

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

Nos últimos anos, tem havido uma crescente evidência de que todos os organismos e o meio ambiente estão expostos a produtos químicos semelhantes a hormônios, conhecidos como produtos químicos do disruptor endócrino (EDCs). Estes produtos químicos podem alterar o equilíbrio normal dos sistemas endócrinos e levar a efeitos adversos, bem como um número crescente de distúrbios hormonais na população humana ou o crescimento perturbado e redução da reprodução nas espécies selvagens. Para alguns EDCs, existem efeitos de saúde documentados e restrições sobre a sua utilização. No entanto, para a maioria deles, ainda não há evidências científicas nesse sentido. A fim de verificar os potenciais efeitos endócrinos de um produto químico no organismo completo, precisamos testá-lo em sistemas de modelo adequados, bem como na mosca da fruta, Drosophila melanogaster. Aqui nós relatamos detalhado in vivo protocolos para estudar o rompimento da glândula endócrina em Drosophila, abordando efeitos de EDC na fecundidade/fertilidade, no sincronismo desenvolvente, e no tempo da mosca. Nos últimos anos, utilizamos esses traços de vida de Drosophila para investigar os efeitos da exposição a 17-α-Etinilestradiol (EE2), bisfenol A (BPA) e bisfenol AF (BPA F). Ao todo, esses ensaios cobriram todos os estágios de vida da Drosophila e possibilitava avaliar o rompimento endócrino em todos os processos mediados por hormônios. Os ensaios de fecundidade/fertilidade e tempo de desenvolvimento foram úteis para mensurar o impacto do EDC no desempenho reprodutivo de mosca e em estágios de desenvolvimento, respectivamente. Finalmente, o ensaio da vida envolveu exposições crônicas do EDC aos adultos e mediu sua sobrevivência. No entanto, esses traços de vida também podem ser influenciados por vários fatores experimentais que tiveram que ser cuidadosamente controlados. Assim, neste trabalho, sugerimos uma série de procedimentos que otimizamos para o resultado correto desses ensaios. Estes métodos permitem que os cientistas estabeleçam o rompimento da glândula endócrina para todo o EDC ou para uma mistura de EDCs diferentes em Drosophila, embora identifique o mecanismo da glândula endócrina responsável para o efeito, uns essays mais adicionais poderiam ser necessários.

Nesta seção, as etapas-chave dos protocolos acima são relatadas a forma de esquemas simplificados. Dado que as moscas tendem a evitar compostos inpalatáveis, a primeira coisa a fazer é o ensaio do gosto do EDC selecionado. Isto pode ser feito misturando uma coloração de alimento (por exemplo, corante vermelho do alimento no. 40)35 com o alimento suplementado com o EDC selecionado em várias doses ou com o solvente sozinho. Moscas alimentadas com esses meios são examinadas um estereomicroscópio e a ...

Os produtos químicos do disruptor da glândula endócrina (EDCs) representam um problema sério para organismos e para ambientes naturais. A Drosophila melanogaster representa um modelo ideal para estudar os efeitos da EdC in vivo. Aqui, nós apresentamos métodos para investigar o rompimento da glândula endócrina em Drosophila, abordando efeitos de EDC na fecundidade, na fertilidade, no sincronismo desenvolvente, e no tempo da mosca.

Métodos para testar a perturbação endócrina na Drosophila melanogaster

In recent years there has been growing evidence that all organisms and the environment are exposed to hormone-like chemicals, known as endocrine disruptor ...

Drosophila melanogaster é um modelo poderoso para avaliar in vivo os potenciais efeitos tóxicos e endócrinos de produtos químicos, como disruptores endócrinos, que representam um grave problema para a saúde humana e ambientes naturais. Abordando o efeito dos EDCs sobre os traços hormonais de vida da mosca, como fecundidade, fertilidade, tempo de desenvolvimento e a vida útil. É uma maneira fácil, barata e rápida de investigar a interrupção endócrina in vivo.A fertilidade, o desenvolvimento e a vida útil em Drosophila podem ser afetados por vários fatores que devem ser cuidadosamente controlados para garantir o sucesso deste protocolo. Portanto, é necessária máxima atenção na criação e manuseio de moscas. Para avaliar o sabor do EDC selecionado, após a anestesia, transfira 15 moscas jovens do leito de mosca para quatro frascos paralelos contendo meio de fubá misturado com uma coloração alimentar.O frasco de controle contém apenas o solvente, e os outros três frascos são suplementados com diferentes doses dos EDCs selecionados. Mantenha os frascos em uma incubadora umidificada por um dia com uma luz natural de 12 horas. Depois de anestesiar as moscas novamente, transfira as moscas imobilizadas para um papel branco, e coloque-a sob um microscópio estéreo para observar.Compare a coloração abdominal de cada grupo de tratamento em relação ao grupo controle. Para avaliar o desempenho reprodutivo das moscas, prepare três frascos de moscas para cada EDC como frascos parentais, com oito fêmeas e quatro machos em 10 mililitros de meio de fubá suplementados com EE2. Para o controle, prepare seis frascos de moscas, cada um com oito fêmeas e quatro machos em 10 mililitros de alimentos médios de fubá suplementados com solvente EE2.A traseira voa em uma incubadora a 25 graus Celsius. Durante seu desenvolvimento, evite a superlotação das larvas. Após quatro dias, inverta cada frasco sobre um eternte para remover os pais e devolva os frascos à incubadora por mais cinco dias.No final da tarde do nono dia, inverta cada frasco sobre um etherizer para remover todas as moscas recém-emergidas dos frascos e coloque os frascos em outra incubadora a 18 graus Celsius durante a noite. Na manhã do dia 10, em uma estação de trabalho de dióxido de carbono Drosophila, inverta cuidadosamente o frasco de cultura para evitar que moscas anestesiadas caiam em meio e insira um tubo de borracha com uma agulha no frasco entre a rolha de algodão e a parede do frasco. Abra a válvula para fornecer dióxido de carbono.Em questão de segundos, transfira as moscas para uma cama de mosca sob um microscópio. Colete fêmeas virgens e machos jovens separadamente em dois grupos na cama de mosca. Subdividir aleatoriamente cada grupo de moscas em pequenos subgrupos, com 10 fêmeas ou 20 machos por frasco preenchido com meio de fubá correspondente fresco.Continue a incubação e colete 30 fêmeas virgens e 30 machos para cada EDC, e 90 fêmeas virgens e 90 machos para o controle. Abriga esses grupos de moscas a 25 graus Celsius até que tenham quatro dias de idade após a eclosão. Em seguida, transfira-os para novos frascos contendo meio correspondente fresco a cada dois dias.Verifique se não há larvas nos frascos de fêmeas. Em seguida, rotule frascos com uma série diferente de números sequenciais para o seguinte tratamento. Após a anestesia, transfira uma fêmea tratada com solvente EE2 em um pequeno frasco contendo meio de tomate de fubá fresco sem EE2 e adicione um macho tratado com solvente EE2 para o controle.Emparelhe um macho tratado com EE2 com fêmea tratada com solvente EE2 ou fêmea tratada com eE2 com macho tratado com solvente EE2 para cada tratamento. Casa 20 cruzes únicas a 25 graus Celsius. Transfira cada par de acasalamento para frascos médios de tomate de fubá fresco sem EDC todos os dias durante os 10 dias seguintes.Inspecione visualmente cada frasco todos os dias em busca dos ovos e informe seu número na planilha de fertilidade. Em cada frasco, verifique de perto as moscas recém-emergidas e registe o número diário de progens adultos durante o período de 10 dias. Após 10 dias do acasalamento inicial, remova os pais da última série de frascos.Nos protocolos de ensaio de eclosão, primeiro, para cada grupo de tratamento, estabeleceu 10 frascos de moscas jovens e saudáveis com menos de dois dias de idade, cada um com seis fêmeas e três machos em 10 mililitros de alimentos de fubá sem EDC. Crie as moscas na comida por 24 horas e deixe-as acasalar. Em seguida, prepare outros 10 frascos paralelos por grupo de tratamento com 10 mililitros cada um de alimentos frescos de fubá suplementados com diferentes concentrações de EDC ou o solvente EE2 sozinho para o controle.Transfira as moscas acasaladas para estes novos frascos. Faça uma planilha de desenvolvimento para gravar as diferentes séries. Deixe as moscas colocarem ovos por 16 horas.Então, remova os pais dos frascos. Incubar os frascos a 25 graus Celsius por três a quatro dias, ou até que as larvas errantes sejam visíveis. Todos os dias, conte o número de pupas novas em cada frasco escrevendo um número em sequência por cada pupa do lado de fora do frasco para evitar contar a mesma pupa duas vezes.Informe o número de pupas recém-emergidas por três a quatro dias, ou até que não haja mais forma de pupae. A partir do nono dia, conte o número de adultos emergentes diariamente, até que não surjam mais adultos. Denuncie-o na planilha de desenvolvimento e realize o resto do ensaio de encerramento de acordo com o manuscrito.No protocolo de vida útil, primeiro montou 20 frascos com oito fêmeas e quatro machos, cada um cheio de 10 mililitros de alimentos de fubá e abriga-os a 25 graus Celsius. Depois de quatro dias, descarte as moscas e coloque os frascos de volta na incubadora. No final da tarde do nono dia, remova todas as moscas recém-emergidas dos frascos e devolva os frascos para a incubadora.Após 16 a 24 horas, divida 250 moscas adultas de um dia de ambos os sexos em quatro grupos sob anestesia de dióxido de carbono leve e transfira-as para garrafas de 250 mililitros contendo alimentos médios adultos, três complementadas com diferentes concentrações de EDC e uma só com o solvente EE2. Mantenha as moscas a 25 graus Celsius por dois a três dias para permitir que acasalem. Então, classifique cada coorte de moscas por sexo em dois grupos.Dentro de cada condição de tratamento, para ambos os sexos, subdividir aleatoriamente cada grupo em cinco frascos paralelos a uma densidade de 20 indivíduos por frasco. Prepare uma planilha de vida em que o número de moscas mortas é subtraído do número de moscas sobreviventes da transferência anterior, de modo que o número de sobreviventes em cada transferência seja obtido automaticamente. Após três dias, transfira as moscas sem anestesia para novos frascos contendo os alimentos correspondentes ao mesmo tempo e verifique se há morte.Regissua a idade das moscas e o número de moscas mortas. Repita a transferência a cada três dias até que todas as moscas morram. Neste experimento, as curvas de vida foram traçadas como a sobrevivência cumulativa versus os dias decorridos para cada concentração de EDC e o controle.Para o controle, após um longo período inicial em que a curva de sobrevivência permaneceu relativamente alta, ela declinou exponencialmente após cerca de 60 dias. Após a exposição ao EDC, a curva de sobrevivência das moscas tratadas foi afetada significativamente e apresentou declínio dramático após 36 dias. É aconselhável que os frascos paralelos em análise devem ser muito semelhantes, caso contrário será difícil entender qual descartar.Por isso, sugerimos tomar muito cuidado, adotando uma boa prática experimental, utilizando um grande tamanho amostral. Seguindo esses protocolos, também é possível avaliar o impacto transgeracional de um disruptor endócrino selecionado, bem como testar os potenciais efeitos aditivos de uma combinação de diferentes disruptores endócrinos.

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