Name: Um modelo in vivo de deficiência de estrogênio mouse para triagem tratamentos de estrogênio exógeno de disfunção cardiovascular após a menopausa (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 18 s
Description: Aprenda a realizar ovariectomia bilateral em camundongos apoE -/- para criar um modelo de deficiência de estrogênio. Este método permite triar tratamentos de estrogênio exógeno para disfunção cardiovascular pós-menopausa.

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Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de ciências naturais da China (81202526 para J.X.), a Fundação Nacional de ciências naturais da China (81302769 a B.S.), a Fundação Municipal de ciência natural de Pequim (47144226 a B.S.), o pós-doutorado chinês Science Foundation (20110490325 a J.X.), e a Fundação de programas de doutorado do Ministério da educação da China (20121106120031 a B.S.).

Todos os cuidados com os animais e protocolos experimentais foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais da Academia Chinesa de ciências médicas e Peking Union Medical College (permissão no.: SYXK (Pequim) 2013-0023). A origem dos ratos APOE-/- é C57Bl/6J9,10.
1. ovariectomia bilateral via incisão dorsal-lateral dupla em camundongos apoE-/-
<ol><li>No desmame (idade 28 dias), anestesiar camundongos apoE-/- C57Bl/6J fêmeas com avertina (tribromoetanol; 200 mg/kg; intraperitonealmente). Nota: 32 APOE-/- camundongos foram divididos aleatoriamente em 4 grupos: Sham, OVX, OVX/E2 e grupo OVX/PPD (n = 8 por grupo).</li>
	<li>Coloque o animal em posição prona em uma almofada de aquecimento. Aplique o lubrificante do olho para a proteção de olho durante a anestesia.</li>
	<li>Manter a temperatura corporal dentro de 36 ± 0,5 ° c. Administrar 5 mg/kg de peso corporal do analgésico carprofeno por via subcutânea para o aspecto lateral do pescoço do rato.</li>
	<li>Depilar um 3 x 5 cm2 rato área cefólica da crista ilíaca. Antes de cobrir o animal com uma folha cirúrgica de 3 x 5 cm2 abertura, limpe a área raspada completamente com iodo e, em seguida, 70% etanol. Use instrumentos estéreis e luvas durante o experimento.</li>
	<li>Use tesouras e fórceps para fazer uma incisão 1 cm lateral para a linha média e 1 cm lateral para as costelas costais.</li>
	<li>Dissecar bluntly o tecido subcutaneous usando o fórceps.</li>
	<li>Use óculos de dissecação (ver tabela de materiais) para identificar o tecido adiposo branco na cavidade abdominal.</li>
	<li>Use Microtesoura e micropinça para fazer uma incisão de 0,5-1 cm através da fáscia até que a cavidade abdominal seja atingida. Nota: Para o grupo Sham-operated, feche as feridas diretamente. Suturar a camada muscular e a pele separadamente usando uma sutura de monofilamento.</li>
	<li>Quando o tecido adiposo branco na cavidade abdominal pode ser visto, pegue o tecido adiposo usando micropinça e puxe-o suavemente para fora. Um ovário cor-de-rosa Mulberry-shaped envolvido pelo tecido adiposo na cavidade abdominal pode ser visto.</li>
	<li>Ligate a embarcação proximal de 0.5-1 cm e o chifre uterine usando uma sutura do monofilamento. Retire o ovário usando Microtesoura e coloque o tecido restante de volta na cavidade abdominal. Nota: Os principais sintomas adversos para a operação OVX são a ligadura ureteral que leva à alta mortalidade em camundongos operados por OVX. Isto pode ser evitado identificando os tecidos usando um Goggle de dissecação.</li>
	<li>Fechem as feridas. Suturar a camada muscular e a pele separadamente usando uma sutura de monofilamento.</li>
	<li>Use tesouras e fórceps para fazer uma outra incisão 1 cm lateral para a linha média e 1 cm lateral para as costelas costais do outro lado. Repita o procedimento acima (1,5 a 1,11).</li>
	<li>Deixe o animal acordar da anestesia. Separadamente manter o mouse no primeiro dia após a cirurgia.</li>
	<li>Limpe ou substitua a gaiola freqüentemente durante a fase de recuperação.</li>
	<li>Aproximadamente 24 h após a cirurgia, administrar outro 5 mg/kg de peso corporal do analgésico carprofeno subcutaneamente.</li>
</ol>2. administração oral de 17β-estradiol ou PPD via propagação de avelã
<ol><li>Dissolva completamente 17β-estradiol ou PPD em óleo de gergelim e, em seguida, misture o óleo de gergelim com propagação de avelã (ver tabela de materiais). Uma porção diária para cada rato de 30 g contém 3 μg de 17β-estradiol ou 15 μg de PPD, 4 μL de óleo de gergelim e 60 mg de propagação de avelã. Prepare um placebo para cada rato de 30 g contém 4 μL de óleo de gergelim e 60 mg de propagação de avelã. Nota: A porção diária da administração de 17β-estradiol ou PPD foi baseada em estudos prévios6,11 e experimentos preliminares.</li>
	<li>Uma semana após OVX, alimentar os ratos com uma dieta de colesterol elevado (1,25% colesterol, 0% cholate) por 12 semanas. Um esquema de tratamento experimental típico, como utilizado neste estudo, é ilustrado na Figura 1.</li>
	<li>5 dias antes da administração oral de avelã propagação na semana 4, treinar os ratos para comer o placebo contendo aproximadamente 30 mg de avelã propagação para 2-5 camundongos por 5 dias. Treinar os ratos em grupos em suas gaiolas de casa durante os primeiros 3 dias. Coloque os camundongos em gaiolas separadas no quarto e quinto dias de treinamento e sirva a porção diária para se assemelhar à situação experimental.</li>
	<li>Durante as últimas 9 semanas, coloc os ratos em gaiolas separadas e sirva então uma parcela diária a parcela da propagação da avelã para cada ocasião de alimentação. Nota: Sirva uma porção diária contendo 17β-estradiol (0,1 mg · kg-1) ou PPD (0,5 mg · kg-1) via avelã ESPALHADA no grupo OVX/E2 e OVX/PPD, respectivamente; Sirva uma porção diária contendo a propagação de avelãs sem hormônio no grupo SHAM e OVX.</li>
</ol>3. determinação da espessura íntima-média e da disfunção cardíaca usando um sistema Microultrasound
<ol><li>
Biomicroscopia ultrassonográfica
	<ol>
<li>Um dia antes da terminação, examine a espessura do íntima-Media e a deficiência orgânica cardíaca usando um sistema microultrasound (veja a tabela de materiais) como descrito previamente21.</li>
		<li>Antes do exame, dê a cada camundongo uma injeção intraperitoneal de 200 mg/kg de avertina (tribromoetanol) como anestesia (n = 8 camundongos por grupo).</li>
		<li>Raspar o cabelo do pescoço de cada rato com cuidado. Aplique o gel morno da transmissão do ultra-som liberalmente para assegurar a qualidade óptima da imagem.</li>
		<li>Obter imagens ultrassonográficas de base da raiz aórtica e aorta ascendente com a cabeça de varredura de 30 MHz a um foco de 12,7 mm e uma resolução de 40 μm.</li>
		<li>Use a eletrocardiografia com uma configuração de chumbo II para monitoramento.</li>
		<li>Capturar imagens de eixo longo do paraesternal direito da aorta ascendente, arco aórtico e ramo da artéria braquiocefálico em um plano na sístole (Figura 3).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Medições de íntima-média e espessura máxima da chapa
	<ol>
<li>Ajuste a distância entre o transdutor e o local arterial prontamente para obter imagens claras.</li>
		<li>Armazene um loop de Cine de 10 s digitalmente para exame off-line em um sistema de análise de imagem.</li>
		<li>Escolha manualmente uma imagem Ultrasonographic do Freeze-frame ideal para umas medidas mais adicionais. Verifique as imagens na curvatura menor da aorta ascendente. Se a placa na aorta ascendente puder ser observada, meça a espessura máxima da chapa. Se a placa na aorta ascendente não puder ser observada, meça o IMT máximo.</li>
		<li>Meça o IMT (distância entre a relação Luminal-intimal vascular e a relação medial-adventtial). Meça a espessura máxima da chapa (a distância mais grossa entre a borda do lúmen vascular e a camada adventícia).</li>
		<li>Dados médios de três sítios de lesão (Figura 3).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Determinação da disfunção cardíaca com ecocardiografia Nota: examine a função cardíaca através da Ecocardiografia usando um sistema microultrasound, como descrito previamente22.<ol>
<li>Dirija um feixe de ultra-som em direção ao coração, perto dos músculos papilares.</li>
		<li>Obtenha visualização de quilohertz com base em eletrocardiograma bidimensional.</li>
		<li>Realize a Ecocardiografia transtorácica in vivo do ventrículo esquerdo usando uma cabeça da varredura de 30 megahertz.</li>
		<li>Medir os parâmetros associados à função cardíaca digitalmente dos traçados do modo M.</li>
		<li>Média dos dados de três a cinco ciclos cardíacos (tabela 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Variabilidade intra e interobservador
	<ol>
<li>Para validação da variabilidade intraobservador, analisar os dados por um operador em duas ocasiões diferentes.</li>
		<li>Para avaliação da variabilidade interobservador, analisar os dados por um operador diferente.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. medição semanal do peso corporal e determinação do colesterol total do plasma (TC) e triglicerídeos (TG)
<ol><li>Medição semanal do peso corporal
	<ol>
<li>Medir pesos corporais uma vez por semana a partir da semana-1 para a semana 12. Nota: n = 8 ratos por grupo.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação do plasma
	<ol>
<li>Antes de recolher amostras de sangue através de punção intracardíaca, prepare seringas e tubos. Use EDTA como um anticoagulante. Adicione 10 μL de 0,5 M de EDTA a cada seringa de 2 mL e adicione 8 μL de EDTA de 0,5 M a cada tubo de 1,5 mL.</li>
		<li>Na semana 12, após um jejum noturno, anestesiar os camundongos com avertina (tribromoetanol; 200 mg/kg; intraperitonealmente). Nota: n = 3 ratos por grupo.</li>
		<li>Prepare a área torácica ventral com 70% de etanol.</li>
		<li>Use tesouras e fórceps para abrir a cavidade torácica e cortar as costelas até que o coração batendo é exposto.</li>
		<li>Insira a agulha de 25 G no ventrículo direito. Aspirar lentamente até que o sangue começa a fluir para a seringa. Nota: Utilizamos seringas descartáveis em condições estéreis com agulhas de 25 G (ver tabela de materiais).</li>
		<li>Continue a aspirar com pressão constante, mesmo. Se não for observado sangue, reposicione a agulha e repita a aspiração.</li>
		<li>Mantenha os ratos profundamente anestesiados antes de recolher o volume sanguíneo necessário. Normalmente, podem ser recolhidos até 1 mL de sangue. Eutanizar os camundongos por luxação cervical esta condição anestésica profunda.</li>
		<li>Pipetar amostras de sangue em 1,5 tubos de mL e inverter o sangue completamente para garantir a mistura de EDTA no sangue. Em seguida, coloque amostras de sangue no gelo imediatamente.</li>
		<li>Centrifugue amostras para 20 minutos em 400 x g em 4 ° c dentro de 30 minutos da coleção.</li>
		<li>Colete o sobrenadante com cuidado. Alíquota e armazenar amostras de plasma a-80 ° c.</li>
	</ol></li>
	<li>Construa curvas padrão para medição de conteúdo TC ou TG
	<ol>
<li>Para a curva padrão TC, prepare várias concentrações de padrões de colesterol: 0 mmol/L, 0,52 mmol/l, 1, 3 mmol/L, 2, 7 mmol/l, 4,14 mmol/L, 6,20 mmol/L, 8,27 mmol/L e 10,34 mmol/L. medida O.D. para cada padrão de colesterol. Defina a média de O.D. para cada padrão de colesterol. Como o valor do eixo vertical (Y), defina a concentração como o valor do eixo horizontal (X). Crie uma curva padrão usando um software estatístico.</li>
		<li>Para a curva padrão do TG, prepare várias concentrações de padrões de TG: 0 mmol/L, 0,45 mmol/l, 0,90 mmol/L, 1,81 mmol/l, 3,62 mmol/L, 5,42 mmol/L, 7,23 mmol/L e 9, 4 mmol/L. medida O.D. para cada padrão de TG. Defina a média de O.D. para cada padrão TG como o valor do eixo vertical (Y); definir a concentração como o valor do eixo horizontal (X). Crie uma curva padrão usando um software estatístico. Nota: Utilizou-se o encaixe de curva logística de quatro parâmetros (4-pl) para a construção da curva padrão no presente estudo. Verifique a curva padrão antes de medir as amostras de plasma e certifique-se de que r2 é maior que 0,995.</li>
	</ol></li>
	<li>Medição de conteúdo TC
	<ol>
<li>Rotule o frasco do reagente da cor (25 mL) do jogo do ensaio do TC como "a solução de trabalho TC".</li>
		<li>Vórtice os espécimes refrigerados brevemente. Preparar diluições: 20 μL de plasma em 80 μL de água destilada. Brevemente diluições vortex.</li>
		<li>Adicionar 2,5 μL de padrões de colesterol (5,17 mmol/L) ou 2,5 μL de plasma diluído ou 2,5 μL de água destilada (em branco) aos poços apropriados de uma placa de poço de 96. Recomenda-se triplicação.</li>
		<li>Para todos os poços, adicione 250 μL do reagente de cor.</li>
		<li>Incubar a 37 ° c durante 10 min.</li>
		<li>Ligue o leitor de microplacas e deixe um aquecimento de 10 min.</li>
		<li>Retire a placa (s) da incubadora e leia o leitor de microplacas a 510 nm. Assegure-se de que nenhuma bolha ou poeira estejam presentes nos poços de microtitula ou na parte inferior da placa, respectivamente.</li>
		<li>Calcule a concentração TC da seguinte forma: TC cont. = padrões de colesterol cont. × (amostra de plasma O.D.-Blank O. D)/(padrões de colesterol O.D.-Blank O. D)</li>
	</ol></li>
	<li>Medição de conteúdo TG
	<ol>
<li>Rotule o frasco do reagente da cor (25 mL) do jogo do ensaio do TG como "a solução de trabalho TG".</li>
		<li>Vórtice os espécimes refrigerados brevemente.</li>
		<li>Adicionar 2,5 μL de normas TG (2,26 mmol/L) ou 2,5 μL de plasma diluído ou 2,5 μL de água destilada (em branco) aos poços apropriados de uma placa de poço de 96. Recomenda-se triplicação.</li>
		<li>Para todos os poços, adicione 250 μL do reagente de cor.</li>
		<li>Incubar a 37 ° c durante 10 min.</li>
		<li>Ligue o leitor de microplacas e deixe um aquecimento de 10 min.</li>
		<li>Retire a placa (s) da incubadora e leia o leitor de microplacas a 510 nm. Nota: Certifique-se de que não há bolhas ou poeira estão presentes nos poços de de microtitulação ou na parte inferior da placa.</li>
		<li>Calcule a concentração de TG da seguinte forma: TG cont. = normas TG cont. × (amostra de plasma O.D.-Blank O. D)/(TG normas O.D.-Blank O. D)</li>
	</ol></li>
</ol>5. análise da face de lesões ateroscleróticas aórticas
<ol><li>Isolação e excisão da aorta
	<ol>
<li>Na semana 12, após um jejum noturno, anestesiar os camundongos com avertina (tribromoetanol; 200 mg/kg; intraperitonealmente). Eutanizar os camundongos por luxação cervical esta condição anestésica profunda. Nota: Utilizamos 3 camundongos por grupo.</li>
		<li>Prepare a área torácica ventral com 70% de etanol. Use tesouras e fórceps para abrir a cavidade torácica e cortar as costelas até que o coração batendo é exposto.</li>
		<li>Encha uma seringa de 50 mL com soro fisiológico tamponado com fosfato em pH 7,4 (ver tabela de materiais). Insira um 25 G de agulha no ventrículo esquerdo e corte o átrio direito para evitar a alta pressão da perfusão.</li>
		<li>Realize a perfusão in situ a um caudal de 0,05-0,08 mL/min. absorva o fluido de perfusão com os tecidos.</li>
		<li>Retire as costelas e os pulmões na cavidade torácica com tesouras e fórceps. Em seguida, abra a cavidade abdominal e retire os órgãos dentro para uma melhor visão da aorta.</li>
		<li>Retire a aorta segurando o coração com o microfórceps e separando a aorta da espinha dorsal com microscisssors até a bifurcação ilíaca. Nota: Quando dissecando perto dos ramos atriais renais, corte profundamente usando Microtesoura para evitar danos na aorta.</li>
		<li>Fixar o coração e aorta para 48 h em 4% paraformaldeído. Guarde as aortas em soro fisiológico à temperatura ambiente ou a 2-8 ° c durante algumas horas. Nota: Este procedimento facilitará a limpeza.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação da aorta
	<ol>
<li>Retire o coração. Remova com cuidado os tecidos adventitial do aortas usando o microfórceps e o microscisssors um stereomicroscope. Use soro fisiológico para manter o tecido úmido durante a limpeza. Nota: Tenha cuidado para não rasgar ou Nick a aorta e alguns ramos importantes, como a artéria innominada, artéria carótida comum esquerda, e artéria subclávia esquerda.</li>
		<li>Deixe 1 milímetro das artérias carotídeas comuns inominada e esquerdas e corte a artéria subclávia esquerda inteira.</li>
		<li>Corte abrir a curvatura externa através da artéria innominada, em seguida, para a artéria carótida comum esquerda, e depois para a artéria subclávia esquerda.</li>
		<li>Corte aberto ao longo da curvatura interna da porção ascendente até o fundo da porção abdominal.</li>
		<li>Fixar a aorta plana sobre uma folha de plástico preto e aplicar soro fisiológico para manter aortas de secagem.</li>
	</ol></li>
	<li>Imagem da região intimal da aorta
	<ol>
<li>Tire fotos de aortas en face com um microscópio estéreo. Inclua uma régua de escala milímetro nas imagens para calibrar as medições.</li>
		<li>Inclua o arco e as regiões torácicas na mesma imagem e na região abdominal em outro. Salvar imagens como JPEG ou TIFF. Nota: A região do arco é da junção do miocárdio a 3 mm distal da artéria subclávia esquerda, a região torácica é de 3 mm distal à artéria subclávia esquerda até a última Artéria intercostal, e a região abdominal é a última Artéria intercostal ao ilíaco Bifurcação.</li>
	</ol></li>
	<li>Quantificação da lesão aterosclerótica-en face Method
	<ol>
<li>Calibração<ol>
<li>Abra a imagem com o software de análise de imagem (consulte a tabela de materiais), vá para calibração espacial e siga as instruções.</li>
			<li>Altere as unidades de referência para mm posicionando a régua sobre a linha.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Medição<ol>
<li>Defina a calibração correta para cada imagem.</li>
			<li>Medir 3 mm na régua.</li>
			<li>Medida do arco e da região torácica: delineie a região do arco a partir da junção do miocárdio a 3 mm distal da artéria subclávia esquerda e da região torácica de 3 mm distal à artéria subclávia esquerda até a última Artéria intercostal. Trace lesões no arco e região torácica e olhe para a aorta através do microscópio.</li>
			<li>Medida da região abdominal: delinear a região abdominal do final da região torácica até a bifurcação ilíaca. Trace lesões na região abdominal e olhe a aorta através do microscópio.</li>
			<li>Calcule a área da lesão em relação à superfície interna da aorta.</li>
			<li>Verificar a quantificação através de um segundo observador que é cego para os grupos de estudo.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

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Os autores não declaram conflitos de interesse.

A metodologia descrita aqui é um modelo de rato que se assemelha a perturbação lipídica e aterosclerose observada em mulheres menopausadas. É bem documentado que a deficiência de estrogênio em mulheres na pós-menopausa pode agravar a incidência de hipercolesterolemia pré-existente ou em curso com lesões ateroscleróticas progressivamente complexas e disseminadas1. Para imitar o estado propenso à aterosclerose na clínica, camundongos deficientes APOE, uma fonte de animais reprodutível e conveniente ...

Estudos epidemiológicos e clínicos mostraram que as mulheres na pós-menopausa têm um risco consideravelmente maior de doença cardiovascular do que as mulheres na pré-menopausa1,2. A terapia de reposição hormonal (HRT) pode reduzir o risco relativo de doença cardiovascular para 0,37-0,793. Entre outras complicações, a aterosclerose causada por doenças cardiovasculares é a principal causa de morte no mundo4. No entanto, modelos de laboratório envolvendo camundongos deficientes em estrogênio apresentando estado propenso à aterosclerose estão faltando. Este protocolo fornece um modelo in vivo de deficiência de estrogênio mouse para triagem de tratamentos de estrogênio exógena de disfunção cardiovascular após a menopausa.
Estudos prévios mostram que a aplicação de OVX em roedores ateroscleróticos alimentados com uma dieta de alto colesterol pode imitar mulheres na pós-menopausa que sofrem de aterosclerose5,6,7,8. Um modelo animal reprodutível e conveniente assemelhando-se ao estado aterosclerótico em mulheres menopausadas é a base da pesquisa exógena de estrogênio. Aqui, uma incisão dorsal-lateral dobro da ovariectomia bilateral foi aplicada em ratos da apolipoproteína E do Knockout da aterosclerose-propensas (APOE-/-)9,10. Comparado com a incisão abdominal ou dorsal média, a incisão dorsal-lateral dobro é um método mais fácil, menos demorada que possa evitar a adesão e a inflamação severas da cavidade abdominal. A administração oral via propagação de avelãs (ver tabela de materiais) é não invasiva e conveniente, tornando-a amplamente aplicável como um modo de administração a longo prazo11. Implantação de pellet de liberação lenta também é popular6. No entanto, os implantes preagravam a incidência de infecção, especialmente em camundongos submetidos a OVX. Outros modos de administração não invasivos, como gavagem oral e administração de água, também têm muitos inconvenientes. Gavagem oral tipicamente ratos do esforço e pode causar ferimento esofágico. Administrar o hormônio via água potável é altamente benéfico; no entanto, a adição de DMSO como emulsificante é inevitável, pois os estrogênios exógenos são insolúveis em água. Aqui, nós escolhemos o 17β-estradiol oral ou a recolocação da hormona do fitoestrógeno através da propagação da avelã para a administração a longo prazo.
Recentemente, o efeito benéfico da HRT sobre o sistema cardiovascular de mulheres na pós-menopausa tem sido contestada em ensaios de iniciativa de saúde da mulher (WHI)12. Por um lado, o estrogênio exógeno sozinho exerce um efeito benéfico sobre o sistema cardiovascular; por outro lado, pode combinar com acetato de metohidroxiprogesterona para aumentar o risco de eventos cardiovasculares. Mais seriamente, HRT pode conduzir à progressão do peito e do tumor uterine, e este efeito limitou acentuadamente seu uso13,14. Mais interesse tem sido focado nos efeitos protetores cardiovasculares dos estrogênios exógenos que faltam a atividade mitótica nas células tumorais15,16,17. Estudos múltiplos em humanos e animais sugerem que os fitoestrogênios com estruturas semelhantes às dos estrogênios podem desempenhar um papel benéfico na proteção cardiovascular15,16.
Assim, os objetivos do presente trabalho são (i) construir um modelo de camundongo de deficiência de estrogênio in vivo por ovariectomia bilateral por meio de incisão dorsal-lateral dupla em camundongos apoE-/- e (II) comparar os efeitos protetores cardiovasculares de peroralmente administrado 17β-estradiol e pseudoprotodioscina (PPD), através da propagação da avelã. 17β-estradiol é um tipo de estrogênio exógeno que pertence a hormônios sexuais femininos6,11,12. PPD, saponina esteróide e fitoestrogênio de plantas de Dioscorea , tem sido relatado anteriormente para exercer propriedades antitumorais20.

<table><tbody><tr><td>17&beta;-estradiol, >98%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E8875-250MG</td> seringas descartáveis da <td>hormona estrogênica</td></tr><tr><td>(com agulhas de 25 G)</td><td>Hunan Luzhou Huikang Development Co., Ltd</td><td>0.5*19TWLB</td><td>sangramento cardíaco</td></tr><tr><td>Dieta do rato do Alto-colesterol</td><td>Bio-Technology</td><td>N/A</td><td>1,25% colesterol de Huafukang, colesterol de 0%</td></tr> de <tr><td>alta resolução no sistema</td> <td>vivo da Micro-imagemVisualSonics</td><td>Vevo&reg; 770</td><td>Medições de espessura da íntima-média e disfunção cardíaca</td></tr><tr><td>2-Metil-2-butanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>152463-250ML</td><td>Preparação de pinça</td></tr><tr><td>de micro dissecação avertin, curvado 8mm</td><td>Kanghua Medical Equipment Co., Ltd</td><td></td><td>Ferramentas cirúrgicas</td></tr><tr><td>Micro Pinça de dissecação, Reta 8 mm</td><td>Kanghua Medical Equipment Co., Ltd</td><td></td><td>Ferramentas cirúrgicas</td></tr><tr><td>Micro tesoura de dissecação, curva/afiada 8 milímetros</td><td>Kanghua Medical Equipment Co., Ltd</td><td></td><td>Ferramentas cirúrgicas</td></tr><tr><td>Micro tesoura de dissecação, em linha reta/afiada 8 milímetros</td><td>Kanghua Medical Equipment Co., Ltd</td><td></td><td>Ferramentas cirúrgicas</td></tr><tr><td>Sutura do monofilamento 4-0 1/2 5 x 12 19 milímetros</td><td>Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., Ltd</td><td>R413</td><td>Sutura e ligadura dos tecidos Creme de</td></tr><tr><td>nozes (Nutella)</td><td>Ferrero</td><td>N/A</td><td>Meio para 17&beta;-estradiol peroral ou</td></tr><tr><td>PPD OptiVisor lupa binocular de vidro óptico</td><td>Dohegan Optical Company Inc.</td><td>N/A</td><td>Assistente de identificação dos tecidos durante a ovariectomia</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato a pH 7,4</td><td>SIGMA</td><td>P3813</td><td>Preparação de solução salina de 1 L</td></tr><tr><td>Pro MultiLabel Microplate Reader</td><td>Tecan</td><td>Infinite M1000</td><td>Plasma TC e TG determinação</td></tr><tr><td>Pseudoprotodioscina</td><td>Shanghai Winherb Medical S & T Desenvolvimento</td><td>W-0427</td><td>Registro CAS nº 102115-79-7</td></tr><tr><td>Rimadyl, 50 mg / mL</td><td>Pfizer Pharma GmbH</td><td>462986</td><td>Analgesia pós-operatória após ovariectomia</td></tr><tr><td>Óleo de gergelim</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3547-1L</td><td>Dissolução do 17-beta;-estradiol ou PPD</td></tr><tr><td>Solcoseryl Eye-Gel</td><td>Menarini, Solco Basle Ltd.</td><td></td><td>Proteção ocular durante a anestesia</td></tr><tr><td>Microscópio estéreo</td><td>MCALON MCL-6STV</td><td></td><td>Imagem da região intimal da aorta</td></tr><tr><td>Centrífuga de alta velocidade modelo de mesa</td><td>SIGMA</td><td>1-14K</td><td>Preparação de plasma</td></tr><tr><td>Tesoura, ligeira curva (14 cm)</td><td>Kanghua Medical Equipment Co., Ltd</td><td></td><td>Ferramentas</td></tr><tr><td>cirúrgicas Tesoura, reta Plana (14 cm)</td><td>Kanghua Medical Equipment Co., Ltd</td><td></td><td>Ferramentas cirúrgicas</td></tr><tr><td>Pinça de tecido, serrilhada, ligeira Curva (14 cm)</td><td>Kanghua Medical Equipment Co., Ltd</td><td></td><td>Ferramentas cirúrgicas</td></tr><tr><td>Pinça de tecido, serrilhada, reta Plana (14 cm)</td><td>Kanghua Medical Equipment Co., Ltd</td><td></td><td>Ferramentas cirúrgicas</td></tr><tr><td>Tribromoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T48402-5G</td><td>Preparação do kit</td></tr> <tr><td></td><td>de ensaio de triglicerídeos (TG) avertinInstituto de Nanjing Jiancheng Engenharia de Biologia</td><td>A110-1</td><td>Determinação de TG de plasma</td></tr><tr><td>Kit de ensaio de colesterol total (TC)</td><td>Instituto de Engenharia de Biologia de Nanjing Jiancheng</td><td>A111-1</td><td>Determinação de TC de plasma</td></tr></tbody></table>

um modelo in vivo de deficiência de estrogênio mouse para triagem tratamentos de estrogênio exógeno de disfunção cardiovascular após a menopausa

An In Vivo Estrogen Deficiency Mouse Model for Screening Exogenous Estrogen Treatments of Cardiovascular Dysfunction After Menopause

Mulheres na pós-menopausa estão em maior risco de desenvolver doenças cardiovasculares do que as mulheres na pré-menopausa. Camundongos fêmeas ovariectomizados (OVX) na exposição ao desmame aumentaram as lesões ateroscleróticas na aorta em comparação com camundongos fêmeas com função ovariana intacta. Entretanto, faltam modelos laboratoriais envolvendo camundongos deficientes em estrogênio com estado propenso à aterosclerose. Esse déficit é crucial porque a deficiência clínica de estrogênio em mulheres menopausadas pode agravar a incidência de distúrbios lipídicos pré-existentes ou contínuos e aterosclerose. Neste estudo, nós estabelecemos um modelo in vivo estrogênio-deficiente do rato pela ovariectomia bilateral através de uma incisão dorsal-lateral dobro em apolipoproteína E (APOE)-/- ratos. Nós comparamos então os efeitos de 17β-estradiol e de pseudoprotodioscin (PPD) (um phytoestrogen) administrado peroralmente através da propagação da avelã. Nós achamos que apesar de PPD exercer algum efeito na redução do peso corporal final e do plasma TG em camundongos OVX apoE-/- , tem capacidades antiateroscleróticas e de proteção cardíaca comparáveis com sua contraparte de 17β-estradiol. PPD é um fitoestrogênio que tem sido relatado para exercer propriedades antitumorais. Assim, o método proposto é aplicável para a triagem de fitoestrogênios via administração oral para substituir a terapia de reposição hormonal tradicional em mulheres na pós-menopausa, que tem sido relatado para ter fatores potencialmente deletério Capacidade. A administração oral através da propagação da avelã é não invasora, tornando-a extensamente aplicável a muitos pacientes. Este artigo contem demonstrações passo a passo da ovariectomia bilateral através da incisão dorsal-lateral dobro no APOE-/- ratos e na recolocação oral do hormônio 17β-estradiol ou do fitoestrógeno através da propagação da avelã. Análises da função lipídica e cardiovascular do plasma usando a Ecocardiografia seguem.

Um esquema de tratamento experimental típico, como utilizado neste estudo, é ilustrado na Figura 1. No desmame (idade 28 dias), os ratos fêmeasde APOE-/- C57Bl/6J foram anestesiados withavertin (tribromoethanol; 200 mg/kg; intraperitoneally). Camundongos foram bilateralmente OVX ou Sham operados através de uma incisão dorsal de 1 cm. Uma semana após OVX bilateral, os ratos foram alimentados com uma dieta de alto colesterol (1,25% colesterol, 0% cho...

Clinicamente, a deficiência de estrogênio em mulheres menopáusicas pode agravar a incidência de ruptura lipídica e aterosclerose. Nós estabelecemos um modelo in vivo da deficiência do estrogen pelo ovariectomia bilateral através de uma incisão dorsal-lateral dobro em APOE-/- ratos. O modelo do rato é aplicável para a triagem de tratamentos de estrogênio exógena de disfunção cardiovascular após a menopausa.

Um modelo in vivo de deficiência de estrogênio mouse para triagem tratamentos de estrogênio exógeno de disfunção cardiovascular após a menopausa

Postmenopausal women are at greater risk of developing cardiovascular diseases than premenopausal women. Female mice ovariectomized (OVX) at weaning ...

Modelos de laboratório envolvendo camundongos deficientes de estrogênio apresentando dados de pons arteriosclerose. Este procedimento é especialmente útil para a triagem de tratamentos exógenos de estrogênio de disfunção cardiovascular após a menopausa. A principal vantagem dessa técnica é que a ovariectomia sem incisão dorsolateral dupla é um método mais fácil e demorado que evita a adesão e inflamação severas da cavidade abdominal.Demonstrando o procedimento será Yue-Zhang Yin, um estudante de pós-graduação do meu laboratório. Para realizar uma ovaectomia bilateral em camundongos nocauteados APOE, primeiro confirme a falta de resposta ao reflexo do pedal e coloque o animal na posição propensa em uma almofada de aquecimento. Aplique pomada nos olhos do animal e cubra o animal com uma cortina cirúrgica.Faça uma incisão de um centímetro lateral para a linha média, e um centímetro lateral para as costelas costais, e use fórceps para dissecar sem rodeios o tecido subcutâneo. Usando óculos de dissecação, identifique o tecido adiposo branco na cavidade abdominal. Usando micro tesouras e micro fórceps, faça uma incisão de 0,5 a um centímetro através da fáscia, até que a cavidade abdominal seja atingida, e use os micro fórceps para retrair suavemente o tecido adiposo branco.Um ovário rosa em forma de amora, envolto em tecido adiposo, deve ser observado dentro da cavidade abdominal. Use uma sutura de monofilamento para ligar o vaso proximal de 0,5 a um centímetro e chifre uterino, e use a micro tesoura para colher o ovário. Devolva o tecido restante à cavidade abdominal e use suturas individuais de monofilamento para fechar separadamente as camadas musculares e de pele.Em seguida, colde o ovário no lado contralateral do animal, como apenas demonstrado, e permita que o rato se recupere em uma almofada de aquecimento com monitoramento, até a recumbência total. Uma vez por semana, da semana anterior às 12 semanas após a cirurgia, meça o peso corporal de cada bicho falso e experimental em um equilíbrio. Para a medição total de colesterol e triglicerídeos plasmádricos, na semana 12, prepare a área do peito ventral com 70% de etanol, e insira uma agulha de calibre 25 no ventrículo direito.Aspire lentamente, até que um mililitro de sangue flua para dentro da seringa, e distribua a amostra em um tubo de coleta de 1,5 mililitro contendo dez microlitres de 0,5 molar EDTA. Inverta o tubo várias vezes completamente para misturar o EDTA no sangue, e coloque imediatamente o tubo no gelo. Dentro de 30 minutos de coleta, centrifugar a amostra por 20 minutos a 400 vezes G e quatro graus Celsius.Colete cuidadosamente o supernante de plasma para armazenamento a menos 80 graus Celsius. Para isolar a aorta, na semana 12, conecte uma agulha de calibre 25 a uma seringa de 50 mililitros cheia de PBS, e insira a agulha no ventrículo esquerdo do animal experimental. Corte o átrio direito para evitar alta pressão da perfusão, e perfunde o tecido cardíaco a uma taxa de fluxo de 05 a 08 mililitros de PBS por minuto.Absorva o fluido de perfusão com tecidos de laboratório e use tesouras e fórceps para remover as costelas e pulmões. Abra a cavidade abdominal para remover os órgãos internos, para uma melhor visão da aorta. Segure o coração com micro fórceps para permitir a separação da aorta dorsalmente, da coluna vertebral, até a bifurcação ilícíaca.Em seguida, fixar o coração e a aorta por 48 horas em 4% de paraformaldeído, antes de armazenar a amostra de tecido em soro fisiológico a temperatura ambiente ou a dois a oito graus Celsius por algumas horas. Após doze semanas de dieta de colesterol alto, camundongos ovariectomizados demonstram um aumento notável nas concentrações totais de colesterol e triglicerídeos plasmáticos. Camundongos ovariectomizados, por administrados oralmente com estradiol 17-beta, ou PPD via propagação de avelã, apresentam concentrações significativamente menores de colesterol total plasmático do que camundongos operados por vergonha.Os níveis de triglicerídeos de plasma diminuem em camundongos ovariectomizados, por administrado oralmente com estradiol 17-beta, mas não com PPD. Embora uma tendência para um aumento do peso corporal seja observada em camundongos ovariectomizados, em comparação com camundongos operados por vergonha, não são observadas mudanças significativas no peso corporal no geral, entre os quatro grupos de animais. A placa máxima da aorta ascendente é aumentada em camundongos ovaectomizados, em comparação com todos os outros grupos, em conjunto com uma diminuição geral da função cardíaca, observada nesses animais.Além disso, o percentual médio da área da lesão aórtica, em relação a toda a área aórtica, é significativamente aumentado em camundongos ovaectomizados. Como esperado, a presença dessas lesões é diminuída com tratamento de 17 beta oestradiol, ou TRATAMENTO PPD. O principal risco para a operação da ovariectomia é a ligadura ureteral, o que resulta em uma alta mortalidade.Lembre-se também de cortar profundamente perto dos ramos da artéria renal, para evitar danos aórticos.

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A adsorção de peptídeos em plásticos durante diluições seriais tradicionais baseadas em ponteiras pode afetar significativamente a determinação da potência e confundir a compreensão das relações estrutura-atividade usadas para identificação de chumbo e fases de otimização de chumbo da descoberta de medicamentos. Aqui são descritos métodos para diluição serial acústica automatizada sem contato de amostras de peptídeos.

Automated acústico de distribuição para a diluição de série do Peptide agonistas em potência Determinação Ensaios

Aqui, nós descrevemos a preparação e utilização de uma sonda com base na actividade (ARN14686, undec-10-ynyl- N - [(3 S) -2-oxoazetidin-3-il] carbamato de metilo), que permite a detecção e quantificação da forma activa da enzima pró-inflamatória N-amidase ácido -acylethanolamine (NAAA), tanto in vitro como ex vivo.

preparação e<em&gt; In Vivo</em&gt; O uso de uma sonda baseado em atividades para<em&gt; N</em&gt; Amidase Ácido -acylethanolamine

Alterações nas taxas metabólicas de medição é fundamental para compreender a progressão de várias doenças e envelhecimento. Aqui, apresentamos uma nova técnica para medir o consumo de oxigênio de toda a cabeça que mais de perto se assemelha o estado fisiológico e pode ajudar a revelar novos medicamentos que modificam a atividade mitocondrial.

Medindo e interpretando a taxas de consumo de oxigênio em toda a cabeça segmentos de voar

Aprenda a realizar ovariectomia bilateral em camundongos apoE -/- para criar um modelo de deficiência de estrogênio. Este método permite triar tratamentos de estrogênio exógeno para disfunção cardiovascular pós-menopausa.

Um modelo in vivo de deficiência de estrogênio mouse para triagem tratamentos de estrogênio exógeno de disfunção cardiovascular após a menopausa (Vídeo) | JoVE Journal

Um modelo in vivo de deficiência de estrogênio mouse para triagem tratamentos de estrogênio exógeno de disfunção cardiovascular após a menopausa

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