Um modelo in vivo de deficiência de estrogênio mouse para triagem tratamentos de estrogênio exógeno de disfunção cardiovascular após a menopausa
13 de agosto de 2019
Clinicamente, a deficiência de estrogênio em mulheres menopáusicas pode agravar a incidência de ruptura lipídica e aterosclerose. Nós estabelecemos um modelo in vivo da deficiência do estrogen pelo ovariectomia bilateral através de uma incisão dorsal-lateral dobro em APOE-/- ratos. O modelo do rato é aplicável para a triagem de tratamentos de estrogênio exógena de disfunção cardiovascular após a menopausa.
Modelos de laboratório envolvendo camundongos deficientes de estrogênio apresentando dados de pons arteriosclerose. Este procedimento é especialmente útil para a triagem de tratamentos exógenos de estrogênio de disfunção cardiovascular após a menopausa. A principal vantagem dessa técnica é que a ovariectomia sem incisão dorsolateral dupla é um método mais fácil e demorado que evita a adesão e inflamação severas da cavidade abdominal.
Demonstrando o procedimento será Yue-Zhang Yin, um estudante de pós-graduação do meu laboratório. Para realizar uma ovaectomia bilateral em camundongos nocauteados APOE, primeiro confirme a falta de resposta ao reflexo do pedal e coloque o animal na posição propensa em uma almofada de aquecimento. Aplique pomada nos olhos do animal e cubra o animal com uma cortina cirúrgica.
Faça uma incisão de um centímetro lateral para a linha média, e um centímetro lateral para as costelas costais, e use fórceps para dissecar sem rodeios o tecido subcutâneo. Usando óculos de dissecação, identifique o tecido adiposo branco na cavidade abdominal. Usando micro tesouras e micro fórceps, faça uma incisão de 0,5 a um centímetro através da fáscia, até que a cavidade abdominal seja atingida, e use os micro fórceps para retrair suavemente o tecido adiposo branco.
Um ovário rosa em forma de amora, envolto em tecido adiposo, deve ser observado dentro da cavidade abdominal. Use uma sutura de monofilamento para ligar o vaso proximal de 0,5 a um centímetro e chifre uterino, e use a micro tesoura para colher o ovário. Devolva o tecido restante à cavidade abdominal e use suturas individuais de monofilamento para fechar separadamente as camadas musculares e de pele.
Em seguida, colde o ovário no lado contralateral do animal, como apenas demonstrado, e permita que o rato se recupere em uma almofada de aquecimento com monitoramento, até a recumbência total. Uma vez por semana, da semana anterior às 12 semanas após a cirurgia, meça o peso corporal de cada bicho falso e experimental em um equilíbrio. Para a medição total de colesterol e triglicerídeos plasmádricos, na semana 12, prepare a área do peito ventral com 70% de etanol, e insira uma agulha de calibre 25 no ventrículo direito.
Aspire lentamente, até que um mililitro de sangue flua para dentro da seringa, e distribua a amostra em um tubo de coleta de 1,5 mililitro contendo dez microlitres de 0,5 molar EDTA. Inverta o tubo várias vezes completamente para misturar o EDTA no sangue, e coloque imediatamente o tubo no gelo. Dentro de 30 minutos de coleta, centrifugar a amostra por 20 minutos a 400 vezes G e quatro graus Celsius.
Colete cuidadosamente o supernante de plasma para armazenamento a menos 80 graus Celsius. Para isolar a aorta, na semana 12, conecte uma agulha de calibre 25 a uma seringa de 50 mililitros cheia de PBS, e insira a agulha no ventrículo esquerdo do animal experimental. Corte o átrio direito para evitar alta pressão da perfusão, e perfunde o tecido cardíaco a uma taxa de fluxo de 05 a 08 mililitros de PBS por minuto.
Absorva o fluido de perfusão com tecidos de laboratório e use tesouras e fórceps para remover as costelas e pulmões. Abra a cavidade abdominal para remover os órgãos internos, para uma melhor visão da aorta. Segure o coração com micro fórceps para permitir a separação da aorta dorsalmente, da coluna vertebral, até a bifurcação ilícíaca.
Em seguida, fixar o coração e a aorta por 48 horas em 4% de paraformaldeído, antes de armazenar a amostra de tecido em soro fisiológico a temperatura ambiente ou a dois a oito graus Celsius por algumas horas. Após doze semanas de dieta de colesterol alto, camundongos ovariectomizados demonstram um aumento notável nas concentrações totais de colesterol e triglicerídeos plasmáticos. Camundongos ovariectomizados, por administrados oralmente com estradiol 17-beta, ou PPD via propagação de avelã, apresentam concentrações significativamente menores de colesterol total plasmático do que camundongos operados por vergonha.
Os níveis de triglicerídeos de plasma diminuem em camundongos ovariectomizados, por administrado oralmente com estradiol 17-beta, mas não com PPD. Embora uma tendência para um aumento do peso corporal seja observada em camundongos ovariectomizados, em comparação com camundongos operados por vergonha, não são observadas mudanças significativas no peso corporal no geral, entre os quatro grupos de animais. A placa máxima da aorta ascendente é aumentada em camundongos ovaectomizados, em comparação com todos os outros grupos, em conjunto com uma diminuição geral da função cardíaca, observada nesses animais.
Além disso, o percentual médio da área da lesão aórtica, em relação a toda a área aórtica, é significativamente aumentado em camundongos ovaectomizados. Como esperado, a presença dessas lesões é diminuída com tratamento de 17 beta oestradiol, ou TRATAMENTO PPD. O principal risco para a operação da ovariectomia é a ligadura ureteral, o que resulta em uma alta mortalidade.
Lembre-se também de cortar profundamente perto dos ramos da artéria renal, para evitar danos aórticos.
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Visão Geral
Este estudo estabelece um modelo de deficiência de estrogênio in vivo utilizando ooforectomia bilateral em camundongos apoE -/- para investigar a disfunção cardiovascular após a menopausa. O modelo é particularmente útil para triagem de tratamentos com estrogênio exógeno.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Saúde Cardiovascular
- Endocrinologia
Contexto
- A deficiência de estrogênio pode agravar a disrupção lipídica e a aterosclerose em mulheres na menopausa.
- Os modelos laboratoriais existentes para estudar a deficiência de estrogênio e a arteriosclerose são limitados.
- A ooforectomia é um método comum para induzir deficiência de estrogênio em modelos animais.
- Este estudo tem como objetivo aperfeiçoar a técnica de ooforectomia para minimizar complicações.
Objetivo do Estudo
- Criar um modelo confiável para estudar disfunção cardiovascular devido à deficiência de estrogênio.
- Avaliar a eficácia de tratamentos com estrogênio exógeno.
- Aprimorar técnicas cirúrgicas para induzir deficiência de estrogênio em camundongos.
Métodos Utilizados
- Ooforectomia bilateral realizada em camundongos apoE -/-.
- Técnica de incisão dupla dorsolateral utilizada para minimizar complicações.
- Avaliação da resposta dos camundongos ao reflexo plantar para confirmar anestesia.
- Aplicação de pomada protetora nos olhos durante a cirurgia.
Resultados Principais
- A técnica de ovariectomia foi realizada com sucesso com complicações mínimas.
- O modelo demonstrou potencial para triagem de tratamentos com estrogênio.
- Métodos cirúrgicos aprimorados reduziram o risco de aderência abdominal e inflamação.
- Os achados apoiam pesquisas futuras sobre disfunção cardiovascular após a menopausa.
Conclusões
- O modelo estabelecido é eficaz para o estudo da deficiência de estrogênio.
- Técnicas cirúrgicas aperfeiçoadas aumentam a confiabilidade dos resultados.
- Esta pesquisa contribui para a compreensão da saúde cardiovascular em mulheres na menopausa.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A deficiência de estrogênio em mulheres pós-menopausa agrava o risco cardiovascular por meio da desregulação lipídica e da progressão da aterosclerose. Modelos in vivo confiáveis são essenciais para reduzir os riscos das terapias com estrogênio exógeno antes da translação clínica. Este modelo de camundongo ovariectomizado apoE-/- permite a triagem mecanicista de fitoestrogênios e análogos de estradiol para proteção cardiovascular.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Avalia a hipótese terapêutica da proteção cardiovascular mediada pelo estrogênio em contextos geneticamente predispostos à aterosclerose.
- Valor Operacional: Oferece validação funcional de alvos do estrogênio exógeno por meio de administração peroral em um sistema relevante para a doença.
- Valor Preditivo: Apoia a identificação de compostos promissores ao comparar a eficácia de fitoestrogênios com padrões de referência de 17β-estradiol.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Gera leituras quantitativas de lipídios plasmáticos e lesões aórticas para triagem de compostos.
- Valor Operacional: Permite administração peroral padronizada e reprodutível por meio de pasta de avelã, compatível com alto rendimento.
- Prontidão do Ensaio: Fornece pontos finais mensuráveis, incluindo colesterol total, triglicerídeos e área de lesão aórtica, para validação posterior de hits.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para a Doença: Modela o risco cardiovascular pós-menopausa em camundongos apoE-/- que exibem progressão aterosclerótica semelhante à humana.
- Continuidade Translacional: Conecta a descoberta à validação pré-clínica ao demonstrar a capacidade antiaterosclerótica do PPD comparável à do estradiol.
- Redução de Riscos: Reduz a ambiguidade mecanicista na triagem de terapias com estrogênio por meio do monitoramento longitudinal de lipídios e função.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este modelo se insere na continuidade entre descoberta e pré-clínico, apoiando a verificação de hipóteses na fase inicial de descoberta, o desenvolvimento de ensaios para campanhas de triagem e a validação translacional de desfechos cardiovasculares antes da otimização do composto líder.
- Biologia do Descobrimento: Testa hipóteses mecanicistas da deficiência de estrogênio sobre o metabolismo lipídico e a patologia vascular.
- Triagem: Fornece saídas quantitativas padronizadas para avaliar compostos exógenos de estrogênio.
- Análises: Oferece perfilagem de lipídios plasmáticos e métricas funcionais derivadas de ecocardiografia para análise comparativa.
- Pesquisa Translacional: Alinha-se à continuidade pré-clínica demonstrando efeitos cardioprotetores em modelos predispostos à aterosclerose.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma cirúrgica e de dosagem reutilizável para programas de triagem em endocrinologia cardiovascular.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva na validação de alvos por meio da redução da ambiguidade mecanicista nas vias de sinalização estrogênica.
- Valor Operacional: Técnica cirúrgica padronizada e administração não invasiva por via oral aumentam a reprodutibilidade e a escalabilidade.
- Valor Estratégico: Orienta decisões de prosseguir ou não ao reduzir o risco de falha biológica em estágios avançados da terapia hormonal cardiovascular.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de candidatos a fitoestrogênios com perfis duplos de atividade anti-tumoral e cardioprotetora.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em técnicas microcirúrgicas e no monitoramento da anestesia em modelos murinos.
- Depende de instrumentos de precisão, incluindo tesouras microcirúrgicas, pinças e óculos para dissecação.
- Necessita padronização entre equipes nos protocolos de administração por via oral por meio de pasta de avelã e de análise de lipídios plasmáticos.
- As considerações para adaptação incluem a adequação do modelo para outras vias responsivas ao estrogênio além dos desfechos cardiovasculares.
- As limitações práticas incluem o risco de mortalidade cirúrgica devido à ligadura ureteral, caso a proximidade com a artéria renal não seja respeitada.
