Name: Genotyping de Anemone de mar durante o desenvolvimento adiantado (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-13T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Aprenda a genotipar Nematostella vectensis durante a gastrulação sem sacrificar o embrião. Esta técnica não letal permite identificar mutantes em anêmonas do mar para análise de fenótipos pós-embrionários.

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Agradecemos revisores anônimos por comentários sobre a versão anterior do manuscrito, que melhorou o manuscrito. Este trabalho foi apoiado por fundos da Universidade de Arkansas.

1. indução de desova, fertilização in vitro e de-jellying
<ol><li>Manter Nematostella vectensis em água do mar com uma salinidade de 12 partes por mil (ppt) na escuridão a 16 ° c, alimentando Artemia diariamente.</li>
	<li>No dia antes da indução de desova, coloque os animais em uma incubadora de temperatura e luz controlada. Programe a incubadora para que os animais sejam expostos a 8 h de luz a 25 ° c. Opcional: alimente uma pequena peça (< 1 mm3) de ostra para animais individuais antes de colocá-los na incubadora para melhorar a desova.</li>
	<li>Deixe os animais na incubadora por 1 h a 16 ° c.</li>
	<li>Retire os animais da incubadora e deixe-os em um de bancada com luz à temperatura ambiente (RT) para permitir a desova. A desova geralmente ocorre dentro dos próximos 1,5 – 2 h.</li>
	<li>Se machos e fêmeas estiverem em recipientes separados, coloque os pacotes de ovos do recipiente fêmea em um recipiente masculino contendo espermatozóides usando uma pipeta de transferência cuja ponta é cortada para ampliar a abertura para que os ovos não sejam danificados pelo estresse mecânico durante Transferência. Permitir que os ovos sejam fertilizados, deixando-os no recipiente macho durante pelo menos 15 min.</li>
	<li>De-Jelly os pacotes de ovos em água do mar contendo 3% de cisteína (pH 7,4) em uma placa de Petri ou em um tubo de 15 mL. Agitar suavemente em uma coqueteleira por 12 min.</li>
	<li>Use uma pipeta plástica para romper aglomerados e continuar a agitar por outro 2-3 min até completamente de-jellied.</li>
	<li>Remover cisteína, substituindo a mídia com água do mar fresco por pelo menos 5x.</li>
	<li>Mantenha os ovos fertilizados em um prato de Petri de vidro a 16 ° c ou RT.</li>
</ol>2. remoção cirúrgica de um tecido aboral de um embrião de gástrula
<ol><li>Prepare um tampão de extração de DNA consistindo de 10 mM de Tris-HCl (pH 8), 50 mM KCl, 1 mM EDTA, 0,3% Tween20, 0,3% NP40 e 1 mg/mL de proteinase K. Use 20 mL do tampão de extração por embrião. Misture bem por vortexing e alíquota o buffer em tubos de PCR.</li>
	<li>Dissolver 1% de agarose na água do mar e despeje-o em uma placa de Petri para cobrir o fundo. Esfrie em um de bancada para fazer uma cama do gel. Despeje a água do mar fresca para cobrir a cama de gel no prato de Petri.</li>
	<li>Transfira os embriões da borne-fecundação de 24 h (HPF) (cedo-à fase meados de-gastrula) no prato de Petri que contem uma cama do gel do agarose.</li>
	<li>Inserir uma agulha de tungstênio em um suporte de agulha e esterilizar por mergulhar a ponta da agulha em álcool (70% ou superior) e colocando-o em chamas para queimar o álcool.</li>
	<li>um microscópio de dissecação (em 20x à ampliação 40x), use a agulha do tungstênio para fazer uma depressão na cama do agarose removendo uma parte de agarose de superfície sobre o tamanho de um embrião a ser manipulado, e coloc o embrião na depressão com seu lateral lado virado para baixo, a fim de restringir o movimento do embrião para a microcirurgia.</li>
	<li>Use a agulha de tungstênio para extirpar cirurgicamente um pedaço de tecido aboral localizado oposto à abertura blastoporal oral. Um aboral um terço a um quarto do tecido embrionário ao longo do eixo oral-aboral é geralmente suficiente.</li>
	<li>Use uma pipeta P20 para transferir o tecido aboral isolado (em < 2 mL) para um tubo de PCR contendo 20 mL de tampão de extração de DNA.</li>
	<li>Transfira o embrião da borne-cirurgia em um poço que contem pelo menos 500 mL do seawater fresco em uma placa 24 ou 96-well.</li>
	<li>Repita os passos 2.4 – 2.8 para o número de embriões, conforme necessário.</li>
	<li>Coloque a placa de poço contendo embriões pós-cirurgia em uma incubadora a 16 ° c ou RT até que a genotipagem seja concluída.</li>
</ol>3. extração do ADN de Genomic e PCR genotipagem
<ol><li>Gire momentaneamente para baixo os tubos do PCR que contêm o amortecedor da extração do ADN e os tecidos embrionário isolados usando um mini-centrifugador (por exemplo. em 2.680 x g para 10 s).</li>
	<li>Para extrair o ADN genomic dos únicos embriões, incubar os tubos do PCR em 55 ° c para 3 h. Vortex para 30 s cada 30 minutos para assegurar o rompimento de aglomerações da pilha e para realçar o lysis da pilha.</li>
	<li>Incubar os tubos do PCR em 95 ° c por 5 minutos para inativar o proteinase K.</li>
	<li>Mantenha os extratos de gDNA a 4 ° c ou no gelo e prossiga imediatamente para a PCR. Nota: o protocolo pode ser pausado aqui colocando extratos de gDNA em um freezer de-20 ° c.</li>
	<li>Configurar uma reação de PCR usando gDNA extraído como um modelo para amplificar o locus genómico de interesse.<ol>
<li>Se os alelos diferentes no locus do interesse diferem no tamanho de modo que a diferença do tamanho possa ser detectada pela electroforese do gel do agarose, projete um único jogo dos primers para amplificar o locus inteiro.</li>
		<li>Alternativamente, use os primers alelo-específicos que geram produtos do PCR somente na presença do alelo específico; por exemplo, projetando o primer que se liga a uma região contendo mutações de inserção/deleção.</li>
		<li>Use uma mistura típica da reação do PCR de 20 mL como segue: 5 mL de extratos de gDNA, 8 mL da água nuclease-livre, 4 mL do amortecedor do PCR, 0,2 mL de dNTPs de 10mM, 0,6 mL de DMSO, 1 mL da primeira demão para diante de 10 milímetros, 1 mL da primeira demão reversa de 10 milímetros e 0,2 mL de DNA polimerase (ver tabela de materiais). Nota: os primers múltiplos podem ser usados em uma reação do PCR. Por exemplo, uma primeira demão para diante universal e dois primers reversos alelo-específicos podem ser combinados, contanto que os dois primers reversos forem projetados gerar produtos do PCR de tamanhos distintos de modo que a presença/ausência dos dois alelos possa ser inequivocamente determinada por electroforese em gel (ver secção de resultados representativos).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Execute a electroforese do gel do agarose para determinar o tamanho e a presença/ausência de produtos do PCR. Ajuste a condição da electroforese do gel do agarose (por exemplo, porcentagem do gel do agarose, V/cm, e duração) dependendo do tamanho esperado de produtos do PCR.</li>
	<li>Use os resultados do PCR a respeito do tamanho e da presença/ausência de produtos do PCR para atribuir um genótipo a cada embrião da borne-cirurgia. Por exemplo, se os alelos diferentes são esperados gerar produtos do PCR de tamanhos diferentes, use a informação do tamanho para atribuir o genótipo para cada embrião. Se forem utilizados primers alelo-específicos, os dados sobre a presença/ausência de produtos de PCR devem ser utilizados para atribuir um genótipo a cada embrião.</li>
	<li>Ordenar embriões de acordo com o genótipo.</li>
</ol>

<ol><li>Medina, M., Collins, A. G., Silberman, J. D., Sogin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+hypotheses+of+basal+animal+phylogeny+using+complete+sequences+of+large+and+small+subunit+rRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Evaluating hypotheses of basal animal phylogeny using complete sequences of large and small subunit rRNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (17), 9707-9712 (2001).</li>
<li>Erwin, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cambrian+Conundrum%3A+Early+Divergence+and+Later+Ecological+Success+in+the+Early+History+of+Animals%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The Cambrian Conundrum: Early Divergence and Later Ecological Success in the Early History of Animals.</a> Science. 334 (6059), 1091-1097 (2011).</li>
<li>Putnam, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sea+anemone+genome+reveals+ancestral+eumetazoan+gene+repertoire+and+genomic+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Sea anemone genome reveals ancestral eumetazoan gene repertoire and genomic organization.</a> Science. 317 (5834), 86-94 (2007).</li>
<li>Magie, C. R., Daly, M., Martindale, M. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrulation+in+the+cnidarian+Nematostella+vectensis+occurs+via+invagination+not+ingression%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Gastrulation in the cnidarian Nematostella vectensis occurs via invagination not ingression.</a> Developmental Biology. 305 (2), 483-497 (2007).</li>
<li>Nakanishi, N., Martindale, M. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+knockouts+reveal+an+endogenous+role+for+ancient+neuropeptides+in+regulating+developmental+timing+in+a+sea+anemone%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">CRISPR knockouts reveal an endogenous role for ancient neuropeptides in regulating developmental timing in a sea anemone.</a> eLife. 7, e39742(2018).</li>
<li>He, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+axial+Hox+code+controls+tissue+segmentation+and+body+patterning+in+Nematostella+vectensis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An axial Hox code controls tissue segmentation and body patterning in Nematostella vectensis.</a> Science. 361 (6409), 1377(2018).</li>
<li>Ikmi, A., McKinney, S. A., Delventhal, K. M., Gibson, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TALEN+and+CRISPR%2FCas9-mediated+genome+editing+in+the+early-branching+metazoan+Nematostella+vectensis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">TALEN and CRISPR/Cas9-mediated genome editing in the early-branching metazoan Nematostella vectensis.</a> Nature Communications. 5, 5486(2014).</li>
<li>Servetnick, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas9-mediated+excision+of+Nematostella+brachyury+disrupts+endoderm+development%2C+pharynx+formation+and+oral-aboral+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cas9-mediated excision of Nematostella brachyury disrupts endoderm development, pharynx formation and oral-aboral patterning.</a> Development. 144 (16), 2951-2960 (2017).</li>
<li>Kraus, Y., Aman, A., Technau, U., Genikhovich, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-bilaterian+origin+of+the+blastoporal+axial+organizer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Pre-bilaterian origin of the blastoporal axial organizer.</a> Nature Communications. 7, 11694(2016).</li>
<li>Fritzenwanker, J. H., Genikhovich, G., Kraus, Y., Technau, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+development+and+axis+specification+in+the+sea+anemone+Nematostella+vectensis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Early development and axis specification in the sea anemone Nematostella vectensis.</a> Developmental Biology. 310 (2), 264-279 (2007).</li>
<li>Lee, P. N., Kumburegama, S., Marlow, H. Q., Martindale, M. Q., Wikramanayake, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+developmental+potential+along+the+animal-vegetal+axis+in+the+anthozoan+cnidarian%2C+Nematostella+vectensis%2C+is+mediated+by+Dishevelled%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Asymmetric developmental potential along the animal-vegetal axis in the anthozoan cnidarian, Nematostella vectensis, is mediated by Dishevelled.</a> Developmental Biology. 310 (1), 169-186 (2007).</li>
<li>Shinzato, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+the+Acropora+digitifera+genome+to+understand+coral+responses+to+environmental+change%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+%28London%29%22%5BJournal%5D)">Using the Acropora digitifera genome to understand coral responses to environmental change.</a> Nature (London). 476 (7360), 320-323 (2011).</li>
<li>Gold, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome+of+the+jellyfish+Aurelia+and+the+evolution+of+animal+complexity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Ecology+%26+Evolution%22%5BJournal%5D)">The genome of the jellyfish Aurelia and the evolution of animal complexity.</a> Nature Ecology & Evolution. 3 (1), 96-104 (2019).</li>
<li>Clevesa, P. A., Strader, M. E., Bay, L. K., Pringle, J. R., Matz, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-mediated+genome+editing+in+a+reef-building+coral%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-mediated genome editing in a reef-building coral.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (20), 5235-5240 (2018).</li>
<li>Momose, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+doses+of+CRISPR%2FCas9+ribonucleoprotein+efficiently+induce+gene+knockout+with+low+mosaicism+in+the+hydrozoan+Clytia+hemisphaerica+through+microhomology-mediated+deletion%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">High doses of CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein efficiently induce gene knockout with low mosaicism in the hydrozoan Clytia hemisphaerica through microhomology-mediated deletion.</a> Scientific Reports. 8, 11734(2018).</li>
<li>Artigas, G. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gonad-expressed+opsin+mediates+light-induced+spawning+in+the+jellyfish+Clytia%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A gonad-expressed opsin mediates light-induced spawning in the jellyfish Clytia.</a> eLife. 7, e29555(2018).</li>
</ol>

O autor não tem nada a revelar.

Descrito aqui um protocolo PCR-baseado para genótipo um único embrião do Anemone de mar sem sacrificar o animal. Depois de desova e de-jellying, os ovos fertilizados são autorizados a desenvolver-se em gastrulae. A região aboral de cada embrião do gástrula é removida cirùrgica, e o tecido aboral isolado é usado para a extração genomic subseqüente do ADN, quando os embriões restantes da borne-cirurgia curarem e continuarem o desenvolvimento. Os extratos de gDNA são usados então para um ensaio do PCR para determinar o genó...

Os cnidarians representam um grupo diverso de animais que incluem Medusa, corais, e Anemones de mar. São diploblastos, compostos por ectoderma e endoderma que são separados por uma matriz extracelular (mesoglea). Cnidaria é um grupo de irmãs a especiosos Bilateria, a que os modelos animais tradicionais tais como a Drosophila e o Mus pertencem1. Além disso, pensa-se que a divergência Cnidaria-Bilateria ocorreu no período pré-cambriano2. Como tal, estudos comparativos de cnidários e bilaterianos são essenciais para obter insights sobre a biologia de seu ancestral comum mais recente. Recentemente, a genômica comparativa revelou que os cnidários e os bilaterianos compartilham muitos genes de kit de ferramentas de desenvolvimento, como notch e bhlh, implicando que seu ancestral comum já tinha esses genes3. Entretanto, o papel destes genes desenvolventes do Toolkit no último antepassado comum de Cnidaria e de Bilateria é comparàvel menos bem compreendido. Para abordar este problema, é crítico estudar como estes genes profundamente conservados funcionam em cnidarians.
Um dos modelos genéticos cnidários emergentes é o cnidários nematostella vectensis. Seu genoma foi seqüenciado3, e uma variedade de ferramentas genéticas, incluindo o knockdown do gene morpholino-negociado, o transgenesis meganuclease-negociado, e as knockins e os Knockouts do gene de Crispr-Cas9-negociados, estão agora disponíveis para o uso neste animal. Além disso, o desenvolvimento de Nematostella é relativamente bem compreendido. Durante a embriogênese, a gastrulação ocorre pela invaginação4, e o embrião se desenvolve em uma larva de Planula de natação livre. A Planula posteriormente se transforma em um pólipo séptil com uma boca e tentáculos circunorais. O pólipo cresce e atinge a maturidade sexual.
A mutagenese segmentada por crispr-Cas9 é agora rotineiramente utilizada para estudar a função gênica em nematostella vectensis5,6, 7,8,9. Para gerar mutantes Knockout em Nematostella, um coquetel contendo RNAs de guia único Locus-específicos e a proteína de endonuclease Cas9 é injetado pela primeira vez em ovos não fertilizados ou fertilizados para produzir animais fundadores da F0 que tipicamente mostram mosaicism. Os animais F0 são subsequentemente levantados para a maturidade sexual e cruzados uns com os outros para produzir uma população de F1, um subconjunto do que pode ser mutantes Knockout6. Alternativamente, os animais de F0 sexualmente maduros podem ser cruzados com animais do tipo selvagem para gerar animais heterozigotos F1, e os heterozygotes F1 que carregam um alelo de nocaute no locus de interesse podem então ser cruzados uns com os outros para produzir descendentes de F2, um quarto dos quais são esperados para ser mutantes Knockout5. Ambas as abordagens requerem um método para identificar mutantes de nocaute de uma população geneticamente heterogênea. Os tentáculos de pólipo podem ser usados para extrair o DNA genómico para a genotipagem6,7. No entanto, nos casos em que a função de desenvolvimento do gene de interesse está sendo investigada e os embriões mutantes não atingem o estágio pólipo (isto é, devido à letalidade larval associada à mutação), os mutantes Knockout precisam ser identificados precocemente na ontogenia. É descrito aqui um protocolo PCR-baseado para genótipo animais individuais no estágio do gástrula sem sacrificar o animal, que permite a identificação de mutantes do Knockout de uma população genetically heterogênea dos embriões. A duração de todo o processo de genotipagem depende do número de embriões a serem rastreados, mas requer minimamente 4-5 h.

<table><tbody><tr><td>Incubadora refrigerada Shellab</td><td></td><td>SRI6PF</td> de Drosophila Peltier <td>Usado para indução de desova</td></tr><tr><td>Sal marinho oceânico instantâneo</td><td>Oceano instantâneo</td><td>138510</td><td></td></tr><tr><td>Cistos de artêmia</td><td>Aquatic Eco-Systems, Inc.</td><td>BS90</td><td></td></tr><tr><td>Cloridrato de L-cisteína</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7352</td><td></td></tr><tr><td>Agitador orbital padrão, modelo 3500</td><td>VWR</td><td>89032-092</td><td></td></tr><tr><td>TRIS-HCl, 1M, pH8.0</td><td>QUALIDADE BIOLÓGICA</td><td>351-007-01</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>VWR</td><td>BDH9258</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, 0,5M pH8</td><td>VWR</td><td>BDH7830-1</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet-P40 Substituto</td><td>US Biológico</td><td>N3500</td><td></td></tr><tr><td>Solução de proteinase K (20 mg / mL), grau de RNA</td><td>ThermoFisher</td><td>25530049</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>VWR</td><td>710</td><td></td></tr><tr><td>Suporte de agulha de microdissecação</td><td>Roboz</td><td>RS-6060</td><td></td></tr><tr><td>Agulha de dissecação de tungstênio</td><td>Roboz</td><td>RS-6063</td><td></td></tr><tr><td>PCR Eppendorf Mastercycler Thermal Cyclers</td><td>Eppendorf</td><td>E6336000024</td><td></td></tr><tr><td>Phusion DNA polimerase de alta fidelidade</td><td>New England BioLabs</td><td>M0530L</td><td></td></tr><tr><td>dNTP mix</td><td>New England BioLabs</td><td>N0447L</td><td></td></tr><tr><td>GLWamide primer direto</td><td></td><td></td> universal <td>5'- CATGCGGAGACCAAGCGCAAGGC-3'</td></tr><tr><td>Primário invertido específico para glw-a</td><td></td><td></td><td>5'-CCAGATGCCTGGTGATAC-3'</td></tr><tr><td>Primer reverso específico para glw-c </td><td></td><td></td><td>5'- CGGCCGGCGCATATATAG-3'</td></tr></tbody></table>

genotyping de anemone de mar durante o desenvolvimento adiantado

Genotyping of Sea Anemone during Early Development

Descrito aqui é um protocolo PCR-baseado para genótipo o embrião do estágio do gástrula do vectensis cnidários cnidários do nematostella sem sacrificar a vida do animal. Após a fertilização in vitro e de-jellying, zigítos são autorizados a desenvolver por 24 h à temperatura ambiente para chegar ao estágio inicial-a meados de gastrula. Os embriões do gástrula são coloc então em uma cama do gel do agarose em um prato de Petri que contem o seawater. o microscópio de dissecação, uma agulha de tungstênio é usada para separar cirurgicamente um fragmento de tecido aboral de cada embrião. Os embriões pós-cirúrgicos são então autorizados a curar e continuar o desenvolvimento. O DNA de Genomic é extraído do fragmento isolado do tecido e usado como um molde para o PCR locus-específico. O genótipo pode ser determinado com base no tamanho dos produtos de PCR ou presença/ausência de produtos de PCR alelo-específicos. Os embriões pós-cirúrgicos são então ordenados de acordo com o genótipo. A duração de todo o processo de genotipagem depende do número de embriões a serem rastreados, mas requer minimamente 4 – 5 h. Este método pode ser usado para identificar mutantes Knockout de uma população geneticamente heterogênea de embriões e permite análises de fenótipos durante o desenvolvimento.

O genoma de Nematostella tem um único Locus que codifica uma proteína precursora para o neuropeptídeo GLWamide. Três alelos do mutante do Knockout neste Locus (GLW-a, GLW-b, e GLW-c) foram relatados previamente5. Quatro machos heterozygous que carreg um selvagem-tipo alelo (+) e alelo do Knockout GLW-cno locus do glwamide (genótipo: +/GLW-c) foram cruzados com uma fê...

O objetivo deste protocolo é genótipo o vectensis do nematostella do Anemone de mar durante o gastrulação sem sacrificar o embrião.

Genotyping de Anemone de mar durante o desenvolvimento adiantado

Described here is a PCR-based protocol to genotype the gastrula stage embryo of the anthozoan cnidarian Nematostella vectensis without sacrificing the ...

Este protocolo permite que um pesquisador identifique anêmonas marinhas mutantes durante a embrigênese precoce para que o fenótipo pós-embrionário possa ser analisado. A principal vantagem dessa técnica é que ela pode ser usada para genótipo de anêmonas marinhas individuais no início da ongênio sem sacrificar a vida do animal. Demonstrando esse procedimento será Miguel Silva, um estudante de pós-graduação do meu laboratório.No dia anterior à indução da desova, coloque a anêmona nematostella vectensis em uma incubadora controlada pela temperatura e luz, programando a incubadora para que os animais sejam expostos a oito horas de luz a 25 graus Celsius. No dia seguinte, retire os animais da incubadora e deixe-os em um banco em temperatura ambiente com a luz acesa para permitir a desova, que ocorrerá dentro de uma hora e meia a duas horas. Use uma pipeta de transferência que a ponta é cortada para ampliar a abertura para colocar embalagens de óvulos do recipiente feminino em um recipiente masculino contendo esperma e deixá-los no recipiente masculino por pelo menos 15 minutos para permitir a fertilização.Após a fertilização, para dejelly as embalagens de ovos, coloque-os em água do mar contendo 3% de cisteína em uma placa de vidro Petri e agitar suavemente em um agitador por 12 minutos. Em seguida, separe os aglomerados com uma pipeta de plástico e continue agitando por mais dois ou três minutos até que completamente desembarado. Mantenha os ovos fertilizados no mesmo prato a 16 graus Celsius ou à temperatura ambiente.No dia seguinte, prepare o tampão de extração de DNA como descrito no manuscrito, misture bem por vórtice e aliquot-lo em tubos PCR adicionando 20 microliters a cada tubo. Dissolva 1% de agarose na água do mar, despeje-a em uma placa de Petri para cobrir o fundo, e esfrie em um topo de banco para fazer uma cama de gel. Cubra o leito de gel com água doce do mar.Transfira embriões pós-fertilização 24 horas usando uma pipeta na placa de Petri contendo gel de agarose. Insira uma agulha de tungstênio em um suporte de necessidade e esterilize mergulhando sua ponta em álcool e colocando-a em chamas para queimar o álcool. Sob um microscópio dissecando, faça uma depressão na ágarose usando a agulha de tungstênio para remover um pedaço de superfície que surgiu do tamanho de um embrião a ser manipulado.Em seguida, usando a agulha de tungstênio, coloque o embrião na depressão com seu lado lateral voltado para baixo, a fim de restringir o movimento do embrião para microcirurgia. Para realizar uma cirurgia bem sucedida, é fundamental restringir o movimento do embrião. Com a agulha de tungstênio, remova cirurgicamente um pedaço de tecido aboral ao longo do eixo aboral oral, localizado em frente à abertura blastoporal oral.Com uma pipeta P20, transfira o tecido aboral isolado para um tubo PCR contendo 20 microliters de tampão de extração de DNA. Transfira o embrião pós-cirurgia para um poço de uma placa de 24 poços contendo pelo menos 500 microliters de água doce do mar. E coloque a placa contendo embriões pós-cirurgia em uma incubadora a 16 graus Celsius até que a genotipagem seja concluída.Para extrair DNA genômico de embriões únicos, primeiro gire brevemente os tubos PCR contendo o tampão de extração de DNA e tecidos embrionários isolados usando uma mini centrífuga. Em seguida, incubar os tubos a 55 graus Celsius por três horas enquanto o vórtice por 30 segundos a cada 30 minutos para garantir o rompimento de aglomerados celulares e melhorar a lise celular. Depois de inativar proteinase K a 95 graus Celsius por quatro minutos, configure uma reação pcr usando DNA genômico extraído como modelo para amplificar o lócus de interesse.Projeto de primers desejados como descrito no manuscrito. Configure uma reação pcr de 20 microliter. Após a conclusão do PCR, execute a agarose gel eletrophoresis para determinar o tamanho e presença ou ausência de produtos PCR, certificando-se de ajustar a condição de eletroforese de gel agarose dependendo do tamanho esperado dos produtos PCR.Use os resultados do PCR em relação ao tamanho e presença ou ausência ou produtos PCR para atribuir um genótipo a cada embrião pós-cirúrgico e, em seguida, classificar embriões de acordo com seu genótipo. O genoma nematostella tem um único lócus que codifica uma proteína precursora para o neuropeptídeo, GLWamide. Três alelos mutantes nocauteados no lócus foram previamente relatados.PcR resulta de embriões amostrados aleatoriamente entre a prole de um cruzamento de F1 entre uma fêmea heterozigous carregando um alelo nocaute A e machos heterozigos carregando um alelo nocaute C mostram genótipos diferentes. Embriões um e dois mostram uma única banda PCR correspondendo ao tamanho esperado de A knockout alelo. Embriões três e seis mostram duas bandas PCR com os tamanhos esperados para os alelos nocauteados A e C.Embryos quatro, sete e oito mostram uma única banda PCR correspondente ao tamanho esperado de C knockout allele.O embrião 5 não mostra bandas, sugerindo a falta de ligação de primer. Para descartar a possibilidade de falha genômica de extração de DNA, outro PCR foi executado usando um primer reverso que pode se ligar à sequência do tipo selvagem. Quando um produto PCR de tamanho esperado foi detectado, a extração genômica de DNA foi bem sucedida.Considerando que nenhum produto sugeriu uma falha na extração. Embora este protocolo seja projetado para embriões de anêmona marinha, com certeza será possível aplicar esse método a outros cnidários, como corais e águas-vivas, onde informações genômicas e embriões são acessíveis. Após este procedimento, os mutantes identificados são usados para avaliar o fenótipo do desenvolvimento.Por exemplo, técnicas histológicas como a imunostaining podem ser usadas para avaliar defeitos na morfologia, enquanto na hibridização in situ, RT-PCR quantitativo em tempo real e RNA-seq podem ser usados para avaliar defeitos na expressão genética. Além disso, imagens vivas podem ser usadas para avaliar defeitos de comportamento durante o desenvolvimento pós-embrionário, como em larvas ou em pólipos precoces.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

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Métodos que produzem embriões morphant são essenciais para estudar mecanismos de desenvolvimento e redes de regulação gênicas. A estrela do mar Patiria miniata é um sistema modelo emergente para estes estudos. Aqui apresentamos um protocolo para a obtenção de gametas, produzindo culturas de embriões, e microinjeção rápida de zigotos de esta espécie.

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