Avaliar a resposta imune celular de mosca da fruta, Drosophila melanogaster, usando um ensaio de fagocitose em Vivo
10 de abril de 2019
Este protocolo descreve um ensaio in vivo de fagocitose no adulto Drosophila melanogaster para quantificar o fagócito reconhecimento e apuramento das infecções microbianas.
Este ensaio de fagocitose in vivo permite que os pesquisadores realizem telas genéticas e estudos de associação genoma para identificar novos genes que regulam a fagocitose em células sanguíneas adultas. Este experimento é quantitativo, fácil de realizar, e pode ser aplicado à triagem de animais vivos para fatores hospedeiros que influenciam o reconhecimento, absorção e liberação de patógenos. Depois de puxar capilares de vidro de parede fina com um puxador de agulha, use um micrômetro para segurar a agulha sob um microscópio, e use o número cinco, pinças de aço inoxidável de ponta fina para quebrar a ponta para um diâmetro de ponta de 100 micrômetros.
Para medir o volume de líquido que será injetado em cada mosca, carregue uma agulha capilar com coloração de alimentos estéril de 5% em PBS e expela o líquido em uma gota de óleo mineral em um micrômetro de estágio de 0,01 milímetros. Distribua 10 microlitadores de 1,6 miligramas por partículas mililitros em um pequeno quadrado de Parafilm, e puxe o líquido para dentro da agulha. Monte a agulha no bocal do injetor, e forra as moscas anestesiadas ao longo de sua área designada na plataforma de voo, lado ventral para cima, com as cabeças orientadas para a frente da almofada.
Coloque os frascos em áreas correspondentes no banco, e injete as moscas no canto superior do abdômen com cinco bombas de 100 milissegundos de líquido para entregar cerca de 10 nanoliters de partículas totais. Transfira cada mosca para o frasco apropriado à medida que for injetado, observando o tempo no frasco. Em seguida, carregue uma nova agulha com solução 0,4%Trypan Blue, e ajuste o injetor pneumático para o portão, para permitir um fluxo constante de ar para empurrar o líquido para fora da agulha.
30 minutos após a injeção inicial, injete cada abdômen de mosca com Trypan Blue até que os abdômens estejam cheios e distendidos. Monte as moscas em deslizamentos de microscópio com fita elétrica, lado ventral para baixo, empurrando as asas para o lado da mosca para fixá-las à fita. Em seguida, empurre suavemente a cabeça para dentro da fita para garantir que a mosca não se mova.
Imediatamente depois de todas as moscas terem sido protegidas, imagem os insetos, um de cada vez, em uma ampliação 25 ou 32 vezes em um microscópio de fluorescência invertida ligado a uma câmera digital e computador, focando no vaso dorsal de cada mosca usando o software do computador para a câmera digital. Em seguida, regise o tempo de exposição e a ampliação entre os experimentos. Para quantificar a fluorescência, abra um programa de análise de imagem apropriado e abra uma imagem.
Para medir a intensidade da fluorescência do vaso dorsal, desenhe um polígono ao redor do vaso dorsal e selecione Medida para registrar a intensidade da fluorescência dentro do polígono. Para determinar a intensidade da fluorescência de fundo, copie o primeiro polígono e mova-o para uma área adjacente ao vaso dorsal de cada mosca. Em seguida, selecione Medir e regise a intensidade da fluorescência da área de fundo.
Para normalizar a fluorescência do vaso dorsal pela fluorescência de fundo, depois de medir as intensidades de fluorescência do resto das moscas, divida a fluorescência do vaso dorsal pela fluorescência de fundo, e calcule a intensidade média normalizada da fluorescência do vaso dorsal de todas as moscas em uma cepa. Após ser montado lado ventral para baixo em um pedaço de fita elétrica, os dois primeiros segmentos do abdômen, onde o vaso dorsal está localizado, são claramente visíveis. As principais fontes de erro experimental surgem nas etapas de injeção e imagem do procedimento.
Usar a mesma agulha para injetar várias moscas pode fazê-la ficar entupida com tecido de mosca ou partículas. Moscas que não recebem fluorescência trippan azul suficiente brilhantemente em todo o seu abdômen, o que pode reduzir a razão do vaso dorsal para a fluorescência de fundo, diminuindo assim a verdadeira razão de intensidade de fluorescência do animal. As moscas devem ser fotografadas enquanto imobilizadas por dióxido de carbono, pois moscas em movimento ativo produzem imagens embaçadas que não podem ser quantificadas.
Uma linha mutante da coleção Zuker de moscas tratadas com metanosulfonato etílico são incapazes de fagocytose gram-negativas e gram-positivas bactérias e não exibe quase nenhuma fluorescência de vaso dorsal no ensaio de fagocitose in vivo, emparelhado com a cepa de fundo isogênico Zuker e outra cepa comum de controle de laboratório. Acompanhe o tempo e a ordem em que as moscas são injetadas para garantir que as moscas estejam em estágios comparáveis de reconhecimento e absorção de patógenos quando imagens. Os mecanismos moleculares subjacentes aos defeitos fagocíticos podem ser determinados estudando hemócitos únicos com microscopia confocal ou após a triagem celular ativada pela fluorescência ou pelo isolamento magnético de hemócitos adultos.
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Visão Geral
Este protocolo descreve um ensaio de fagocitose in vivo em Drosophila melanogaster adulta para quantificar o reconhecimento e a eliminação de infecções microbianas por fagócitos. Este experimento é quantitativo, fácil de realizar e pode ser aplicado na triagem de animais vivos para identificar fatores do hospedeiro que influenciam o reconhecimento, a internalização e a eliminação de patógenos.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Neurociência
- Imunologia
- Genética
Contexto
- A fagocitose é uma resposta imune crítica.
- Drosophila melanogaster atua como organismo modelo.
- Compreender a função dos fagócitos pode revelar informações sobre a regulação imunológica.
- Este ensaio facilita telas genéticas para identificar genes relevantes.
Objetivo do Estudo
- Quantificar a atividade de fagócitos em resposta a infecções microbianas.
- Identificar novos genes que regulam a fagocitose.
- Ampliar a compreensão das interações entre hospedeiro e patógeno.
Métodos Utilizados
- Preparação de capilares de vidro de parede fina para injeção.
- Uso de corante alimentício estéril em PBS para medição de líquidos.
- Dispensação de partículas sobre Parafilm para injeção em moscas.
- Posicionamento de moscas anestesiadas para injeção precisa.
Resultados Principais
- Quantificação bem-sucedida do reconhecimento e da eliminação por fagócitos.
- Identificação de fatores genéticos que influenciam a fagocitose.
- Demonstração da aplicabilidade do ensaio em animais vivos.
- Facilitação de pesquisas adicionais sobre respostas imunológicas.
Conclusões
- O ensaio de fagocitose in vivo é uma ferramenta valiosa para pesquisadores.
- Permite a exploração das influências genéticas na função imunológica.
- Estudos futuros podem se basear nestes achados para aprimorar a pesquisa imunológica.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este ensaio de fagocitose in vivo em Drosophila melanogaster fornece um sistema geneticamente manipulável para avaliar interações entre hospedeiro e patógeno e identificar reguladores genéticos da imunidade celular. Seu resultado quantitativo e reproduzível permite a validação precoce de alvos e a redução de riscos mecanicistas em programas de descoberta com foco em imunologia. O ensaio apóia campanhas de triagem para priorizar alvos terapêuticos com confiança preditiva na função imune inata.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas mediante a quantificação da captação e destruição de partículas em animais vivos.
- Valor Operacional: Facilita a redução de riscos biológicos por meio de telas genéticas para identificar novos genes que influenciam a fagocitose.
- Valor Preditivo: Apoia a triagem de portfólios ao associar a atividade dos hemócitos aos mecanismos de reconhecimento e eliminação de patógenos.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Fornece medidas quantitativas de fluorescência que permitem a avaliação padronizada da eficiência fagocítica em diferentes origens genéticas.
- Valor Operacional: Oferece um fluxo de trabalho escalável e de fácil execução, compatível com triagem em animais vivos para fatores do hospedeiro.
- Valor de Reprodutibilidade: Garante resultados consistentes por meio da dosagem controlada de partículas e da intensidade de fluorescência normalizada no vaso dorsal.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Fornece um sistema relevante para a doença para estudar mecanismos imunológicos inatos conservados com alinhamento translacional de biomarcadores.
- Valor Operacional: Permite decisões de avanço ajustadas ao risco ao correlacionar defeitos fagocíticos com fenótipos mutantes.
- Valor Preditivo: Apoia a redução de riscos mecanicistas ao identificar fatores genéticos que modulam a captação e a eliminação de patógenos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O ensaio insere-se no estágio inicial de descoberta para apoiar a verificação de hipóteses e a elucidação de vias na imunologia, com aplicação direta na identificação de compostos ativos por meio da triagem genética de fatores hospedeiros que influenciam a eliminação microbiana.
- Biologia da Descoberta: Permite testar hipóteses sobre mecanismos fagocíticos mediante a medição da captação de partículas em hemócitos de Drosophila sob condições controladas.
- Triagem: Oferece prontidão do ensaio e saídas quantitativas para avaliar variantes genéticas que afetam o reconhecimento e a captação de patógenos.
- Análises: Gera leituras de intensidade de fluorescência normalizadas que permitem comparar a atividade fagocítica entre diferentes condições experimentais.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica aproveitando vias imunológicas conservadas evolutivamente entre invertebrados e mamíferos.
- Reutilização Empresarial: Funciona como uma plataforma de triagem reutilizável para alvos em imunologia devido à sua manipulabilidade genética e design quantitativo.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Fornece confiança preditiva na validação de alvos ao reduzir a ambiguidade mecanicista nas respostas imunes celulares.
- Valor Operacional: Garante padronização e reprodutibilidade por meio da injeção precisa de partículas e quantificação da fluorescência.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avançar/não avançar ao permitir a detecção precoce de defeitos fagocíticos em linhagens mutantes.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de alvos com base em sua influência na eficiência de eliminação de patógenos.
Considerações de Implementação
- Requer experiência no manejo de Drosophila, microinjeção e microscopia de fluorescência.
- Depende de injetores pneumáticos, agulhas capilares e sistemas de imagem para entrega e detecção consistentes de partículas.
- Necessita de protocolos padronizados para imobilização e montagem ventral das moscas, a fim de garantir imagens reprodutíveis.
- Requer considerações de adaptação ao estender o ensaio a diferentes tipos de partículas ou modelos de infecção.
- As limitações práticas incluem o entupimento das agulhas por tecido da mosca e a variabilidade na injeção de Azul de Tripano, afetando a fluorescência de fundo.
