Name: Geração de Organoids de vias biliares extra-hepáticas Mouse (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Aprenda a gerar organoides de vias biliares extra-hepáticas de camundongos para estudar biologia de colangiócitos e regeneração tecidual. Este método reprodutível e econômico permite cultivar número ilimitado de células.

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Este trabalho foi apoiado pela Associação Americana para o estudo do fígado doenças Pinnacle award (para S.O.) e o National Institutes of Health, Instituto Nacional de Diabetes e digestivo e doenças renais (prêmios P30 DK34933 de S.O., P01 DK062041 para J.L.M.). Agradecemos o Dr. Ramon Ocadiz-Ruiz (Universidade de Michigan) pela ajuda com o desenvolvimento desta metodologia.

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de uso (IACUC) da Universidade de Michigan e institucional Cuidado Animal.
1. preparação de equipamentos e materiais para isolamento de Mouse EHBD
<ol><li>Preparar o meio de semeadura e tampão de lavagem (Tabela de materiais) em 50 mL tubos cónicos e mantê-los em 4 ° C ou em gelo até o uso.</li>
	<li>Configure uma mesa cirúrgica (figura 1B). Prepare os instrumentos cirúrgicos esterilizados (Figura 1).</li>
	<li>Coloque uma placa estéril de 24 a 37 ° C incubadora de cultura de tecidos de pré-aquecimento.</li>
	<li>Coloque uma parte alíquota da matriz de porão no gelo. Use o porão matriz somente quando ele é completamente liquefeito.</li>
</ol>2. EHBD isolamento e cultura de organoides biliar
<ol><li>
Isolamento e preparação de uma suspensão de célula única do mouse EHBD
	<ol>
<li>Eutanásia em um rato adulto (mais de 2 meses) de acordo com as orientações institucionais. Coloque o mouse em uma posição supina. Abrir a cavidade abdominal, usando uma abordagem de linha média e retração do fígado para descansar sobre o diafragma.</li>
		<li>Identifica o ducto biliar comum localizado imediatamente abaixo do hilo hepático, puxando suavemente o duodeno proximal com uma pinça hemostática. EHBD separe os tecidos circunvizinhos usando uma lâmina de bisturi. Segurando a extremidade proximal do ducto biliar comum com fórceps, dissecá-lo distalmente logo acima de sua junção com o duodeno, em seguida, dissecar a extremidade proximal do ducto do fígado (Figura 1). Imediatamente coloque isolado EHBD (Figura 1E) no frio de tampão de lavagem.</li>
		<li>Remover o EHBD do buffer de lavar e picar em seções de 0,5 mm, usando uma lâmina de bisturi estéril. Coloque o tecido sobre uma placa de vidro no gelo durante o procedimento (figura 1B).</li>
		<li>Coloca as seções EHBD num tubo contendo 500 µ l de buffer de dissociação. Incubar durante 20 min a 37 ° C. Neutralize o buffer de dissociação adicionando 500 µ l do meio de cultura celular gelada.</li>
		<li>Triture a suspensão de eritrócitos e descer progredir através de agulhas de 18 e 20 G, 20 vezes cada um. Filtrar a suspensão através de um filtro de célula 70 µm e coletar o escoamento em um tubo de 50 mL. Nota: Pré-condição do filtro com 500 µ l de tampão fosfato solução salina estéril (PBS) antes da filtragem para facilitar a passagem da suspensão celular.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Estabelecimento de EHBD organoids
	<ol>
<li>Centrifugue a passagem da etapa 2.1.5 a 300 x g por 5 min a 4 ° C.</li>
		<li>Remova cuidadosamente o sobrenadante. Ressuspender as células em 1 mL de PBS estéril gelada. Transferi a ressuspensão em um novo tubo de 1,5 mL. Repita a etapa 2.2.1.</li>
		<li>Após a centrifugação, Retire cuidadosamente o sobrenadante de lavado células coletadas na parte inferior do tubo. Resuspenda o pellet de células em 120 µ l de matriz liquefeito cave gelada pipetando subir e descer usando dicas P200. Nota: Ressuspensão de sedimento celular em matriz de porão tem de ser realizada em banho de gelo.</li>
		<li>Placa de 40 µ l da ressuspensão de célula na matriz de porão para o centro de um poço em uma placa de 24 previamente aquecido. Nota: Evite a aspiração de ar durante a manipulação de matriz do porão para evitar a formação de bolhas.</li>
		<li>Devolve a chapa com células resuspended na matriz de porão para a incubadora de cultura de tecidos de 37 ° C por 15 min ou até a matriz do porão é solidificado. Adicione 600 µ l do meio de propagação aquecido a 37 ° C para cada poço (Tabela de materiais). Devolve a chapa para a incubadora de cultura de tecidos de 37 ° C.</li>
		<li>Substitua o meio de semeadura com 600 µ l do meio de cultura fresco organoides em 3 dias e depois a cada 3 dias. Monitorar o crescimento de organoides com um microscópio invertido. Uso organoids para uma aplicação a jusante ou divididos em 7 a 9 dias antes de acumulação do colapso de restos e organoides intraluminal são observados (Figura 2A).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. EHBD organoides passagem e armazenamento
<ol><li>
Passagem de EHBD organoids 1:3 a 1:4 em 7 a 9 dias
	<ol>
<li>Retire o meio do poço e adicione 400 µ l de PBS gelado. Ressuspender o organoids pipetando suavemente a mistura acima e para baixo 10 vezes no poço. Transfira a mistura para um tubo de 1,5 mL.</li>
		<li>Passagem a mistura através de uma agulha 25g 4 vezes para dissociar o organoids. Centrifugue a mistura a 400 x g durante 4 min a 4 ° C.</li>
		<li>Remova cuidadosamente o sobrenadante e ressuspender as células em uma matriz de porão (1:3 a 1:4) para mais de cultivo (etapa 2.2.4.) ou lavar as células com gelo frio PBS para processamento adicional. Nota: Normalmente, as células de 250-300 são banhadas na placa de 24 para aplicações a jusante. Chapeamento de eficiência pode ser avaliado pela microscopia de campo claro, usando um microscópio invertido no dia 3-5, após a passagem pela contagem do número de organoids e calcular seus por cento do número de célula inicial. mRNA pode ser isolado de EHBDOs lavados em PBS, usando o protocolo padrão usando extração de guanidínio tiocianato-fenol-clorofórmio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Armazenamento a longo prazo de organoids EHBD
	<ol>
<li>Retire o meio do poço e lave o organoids com temperatura PBS. Remova o PBS do poço sem perturbar a queda de matriz do porão.</li>
		<li>Adicione 500 µ l de cela gelada congelamento médio para o poço. Delicadamente resuspenda o organoids na matriz de porão liquefeito e célula congelamento médio e transfira a mistura dentro dos frascos criogênicos.</li>
		<li>Armazene os frascos de-80 ° C por 48 h. transferência os frascos para um tanque de nitrogênio para armazenamento a longo prazo em uma fase de vapor.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. EHBD Pprocessing de organoides para a incorporação de parafina
<ol><li>Ressuspender os EHBDOs em 500 µ l de PBS gelado (4 ° C) por pipetagem e descer de 5 a 10 vezes. Colete EHBDO ressuspensão em matriz liquefeito porão em um tubo de 1,5 mL. Nota: Para evitar a interrupção organoids, cortar a parte inferior 2-3mm de uma dica de P1000 e remover o sobrenadante com muito cuidado.</li>
	<li>Centrífuga EHBD organoids a 350 x g durante 5 min. Retire com cuidado o sobrenadante sem perturbar o sedimento de organoides.</li>
	<li>Adicionar 1 mL de gelado paraformaldeído 4% (PFA) para o organoids e incubar a organoids em 4% PFA overnight a 4° C. Remover 4% PFA do organoids usando uma dica P1000 após incubação durante a noite.</li>
	<li>Adicionar 1000 µ l de PBS temperatura ambiente para o tubo com o organoids e incubar durante 5 min à temperatura ambiente (RT). Centrifugar o tubo com organoids em PBS em 350 x g durante 5 min. Repita este processo mais duas vezes.</li>
	<li>PBS de remover e adicionar 1 mL de etanol a 30% para o organoids. Incubar durante 5 min à RT.</li>
	<li>Centrifugar o tubo a 350 x g durante 5 min à RT. Remove 30% de etanol. Adicione 1 mL de etanol a 70% e incubar durante 5 min à RT</li>
	<li>Centrifugate a 350 x g durante 5 min. remover etanol a 70%. Adicione 1 mL de etanol 100% e incubar durante 5 min à RT Nota: Organoids podem ser mantidos em etanol 100% à temperatura ambiente por até 48 h antes de processamento adicional.</li>
	<li>Aqueça o gel de processamento da amostra no microondas por 20 s ou até liquefeito. Adicione 50 µ l de amostra de gel dentro do tubo com organoids de processamento. Coloca o tubo no gelo até o espécime processamento gel é solidificado.</li>
	<li>Retirar a gota de gel com organoids do tubo de processamento de amostra e coloque entre as almofadas de esponja azul em uma gaveta para processamento adicional no processador de tecido. Use 15 min para cada etapa em embedder a parafina durante a transformação...</li>
	<li>Seção organoids de parafina numa amostra de processamento gel em 4 µm. Proceda com imuno-histoquímica coloração como descrito anteriormente,16.</li>
</ol>

<ol><li>Lazaridis, K. N., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cholangiopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Mayo+Clinic+Proceedings%22%5BJournal%5D)">The Cholangiopathies.</a> Mayo Clinic Proceedings. 90 (6), 791-800 (2015).</li>
<li>Carpino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem%2FProgenitor+Cell+Niches+Involved+in+Hepatic+and+Biliary+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Stem/Progenitor Cell Niches Involved in Hepatic and Biliary Regeneration.</a> Stem Cells International. 2016, 3658013(2016).</li>
<li>DiPaola, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+intramural+epithelial+networks+linked+to+peribiliary+glands+that+express+progenitor+cell+markers+and+proliferate+after+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Identification of intramural epithelial networks linked to peribiliary glands that express progenitor cell markers and proliferate after injury in mice.</a> Hepatology. 58 (4), 1486-1496 (2013).</li>
<li>Venter, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+functional+characterization+of+extrahepatic+cholangiocyte+lines+from+normal+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Digestive+And+Liver+Disease%22%5BJournal%5D)">Development and functional characterization of extrahepatic cholangiocyte lines from normal rats.</a> Digestive And Liver Disease. 47 (11), 964-972 (2015).</li>
<li>Glaser, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+and+functional+heterogeneity+of+the+mouse+intrahepatic+biliary+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratry+Investigation%22%5BJournal%5D)">Morphological and functional heterogeneity of the mouse intrahepatic biliary epithelium.</a> Laboratry Investigation. 89 (4), 456-469 (2009).</li>
<li>Cardinale, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipotent+stem%2Fprogenitor+cells+in+human+biliary+tree+give+rise+to+hepatocytes%2C+cholangiocytes%2C+and+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Multipotent stem/progenitor cells in human biliary tree give rise to hepatocytes, cholangiocytes, and pancreatic islets.</a> Hepatology. 54 (6), 2159-2172 (2011).</li>
<li>De Assuncao, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cholangiocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratry+Investigation%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of human-induced pluripotent stem cell-derived cholangiocytes.</a> Laboratry Investigation. 95 (6), 684-696 (2015).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+expansion+of+single+Lgr5%2B+liver+stem+cells+induced+by+Wnt-driven+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration.</a> Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+of+genome-stable+bipotent+stem+cells+from+adult+human+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver.</a> Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).</li>
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<li>Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease+Modeling+in+Stem+Cell-Derived+3D+Organoid+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+In+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Disease Modeling in Stem Cell-Derived 3D Organoid Systems.</a> Trends In Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).</li>
<li>Sampaziotis, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+better+bile+ducts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Building better bile ducts.</a> Science. 359 (6380), 1113(2018).</li>
<li>Sampaziotis, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+the+mouse+extrahepatic+biliary+tree+using+primary+human+extrahepatic+cholangiocyte+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of the mouse extrahepatic biliary tree using primary human extrahepatic cholangiocyte organoids.</a> Nature Medicine. 23 (8), 954-963 (2017).</li>
<li>Nakagawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biliary+epithelial+injury-induced+regenerative+response+by+IL-33+promotes+cholangiocarcinogenesis+from+peribiliary+glands%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+Of+The+Natural+Academy+Of+Science+Of+The+United+States+Of+America%22%5BJournal%5D)">Biliary epithelial injury-induced regenerative response by IL-33 promotes cholangiocarcinogenesis from peribiliary glands.</a> Proceedings Of The Natural Academy Of Science Of The United States Of America. 114 (19), E3806-E3815 (2017).</li>
<li>Razumilava, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+signaling+modulates+IL-33-dependent+extrahepatic+bile+duct+cell+proliferation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology+Communications%22%5BJournal%5D)">Hedgehog signaling modulates IL-33-dependent extrahepatic bile duct cell proliferation in mice.</a> Hepatology Communications. , (2018).</li>
<li>Boyer, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bile+formation+and+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Comprehensive+Physiology%22%5BJournal%5D)">Bile formation and secretion.</a> Comprehensive Physiology. 3 (3), 1035-1078 (2013).</li>
<li>Carpino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biliary+tree+stem%2Fprogenitor+cells+in+glands+of+extrahepatic+and+intraheptic+bile+ducts%3A+an+anatomical+in+situ+study+yielding+evidence+of+maturational+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Biliary tree stem/progenitor cells in glands of extrahepatic and intraheptic bile ducts: an anatomical in situ study yielding evidence of maturational lineages.</a> Journal Of Anatomy. 220 (2), 186-199 (2012).</li>
<li>Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrigel%3A+a+complex+protein+mixture+required+for+optimal+growth+of+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture.</a> Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).</li>
<li>Williamson, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+High-Throughput+Organoid+Microinjection+Platform+to+Study+Gastrointestinal+Microbiota+and+Luminal+Physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+And+Molecular+Gastroenterology+And+Hepatology%22%5BJournal%5D)">A High-Throughput Organoid Microinjection Platform to Study Gastrointestinal Microbiota and Luminal Physiology.</a> Cellular And Molecular Gastroenterology And Hepatology. 6 (3), 301-319 (2018).</li>
<li>Wan, A. C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recapitulating+Cell-Cell+Interactions+for+Organoid+Construction+-+Are+Biomaterials+Dispensable%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+In+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Recapitulating Cell-Cell Interactions for Organoid Construction - Are Biomaterials Dispensable?</a> Trends In Biotechnology. 34 (9), 711-721 (2016).</li>
</ol>

Os autores declaram que eles têm não tem interesses concorrente.

Este trabalho descreve a geração de um modelo de 3-dimensional organotypic do mouse cholangiocytes EHBD. Passos importantes na geração de cultura EHBDO incluem minuciosa dissecação de EHBD para evitar a contaminação de células do pâncreas, manutenção de condições estéreis para evitar a contaminação bacteriana e fúngica e manipulação cuidadosa após a centrifugação, para evitar o perda de material celular. Uma estreita aderência às condições descritas de temperatura é necessária. Existem algumas limitações para a técnica. ...

Cholangiopathies são incuráveis crônicos progressivos distúrbios que afetam as células biliares localizadas no intrae canais biliares extra-hepáticas (EHBDs)1. Alguns cholangiopathies, como Colangiocarcinoma, colangite esclerosante primária, atresia biliar e cistos coledocianos, afetam predominantemente EHBDs. Desenvolvimento de terapias para cholangiopathies é restringido pela disponibilidade limitada de modelos pré-clínicos. Além disso, estudos anteriores focada em cholangiopathies agrupados: fígado, intrae EHBDs. No entanto, intrae EHBDs têm uma origem embrionária distinta e, portanto, devem ser consideradas distintas patologias moleculares. Biliares intra-hepáticos se desenvolvem a partir das placas intra Ductais e a parte cranial do divertículo hepático, EHBDs todo desenvolvem da parte caudal do divertículo hepático2. Eles também contam com compartimentos de células progenitoras diferentes para homeostase adulto, incluindo canais de Hering em glândulas de peribiliary em EHBDs2,3e biliares intra-hepáticos. Utilização de modelos animais para estudos pré-clínicos é limitada pela despesa e deve ser minimizada por razões éticas. Portanto, reducionista, reprodutível, tempo e custo-eficiente modelos in vitro são altamente desejáveis.
A maioria dos estudos prévios de cholangiopathies utilizaram rato normal ou modelos de câncer do rato ou linhas de células humanas Colangiocarcinoma derivadas intrae EHBDs4,5,6,7. No entanto, estes são modelos de células transformadas e não recapitular biologia cholangiocyte normal em homeostase ou em um estado saudável. Recentes progressos no desenvolvimento de modelos de cultura organotypic permitiu o desenvolvimento de estruturas 3-dimensional de tipos de tecido diferentes, incluindo tecidos de vilosidades, embora não normal do rato EHBDs8,9, 10. Estes "órgãos" estruturas destinadas a imitando tecido primário e são cultivadas em um nicho artificial apoiando auto-renovação de células tronco/progenitoras de órgão específico11.
"Organoides" é um amplo termo que mais comumente descreve modelos de tecido 3-dimensional derivados de células-tronco. Organoids podem ser gerados de pluripotentes reprogramadas, células-tronco representado por células-tronco embrionárias e induzido por células-tronco pluripotentes. Eles também podem ser gerados a partir de células-tronco adultas órgão específico12. Alguns modelos de organoides cholangiocyte têm sido propostos em estudos anteriores. Assim, organoids, derivados de células-tronco pluripotentes humanas têm sido relatados7,9,13 e fornecer um tempo valioso, eficiente ferramenta que permite a geração simultânea de diferentes tipos de células. No entanto, essas organoids de células-tronco derivadas de pluripotentes não refletem totalmente a estrutura e a funcionalidade do adulto primário EHBD cholangiocytes.
Organoids derivados de células-tronco adultas do humano9 e felino10 fígado também foram propostos. Modelos de felinos não estão amplamente disponíveis e limitaram o arsenal de ferramentas para fins de estudo. Além disso, estes organoids células-tronco derivadas adultos derivado de fígado não modelo cholangiocytes extra-hepática mas prefiro intra-hepática cholangiocytes.
Geração de organoides EHBD foi relatada de humano normal EHBDs14 e mouse EHBD Colangiocarcinoma15. No entanto, acesso ao tecido EHBD humano é extremamente limitado, e organoids derivados de um modelo murino genético de colangiocarcinoma15 não representam saudável cholangiocyte biologia na homeostase e são derivadas de células geneticamente modificadas.
Para lidar com as limitações dos modelos organoides cholangiocyte de células-tronco e fígado-derivadas de pluripotentes e o acesso limitado aos tecidos humanos necessários em modelos pré-clínicos, desenvolvemos um modelo murino de organoides EHBD (figura 1A). Este manuscrito descreve o desenvolvimento de uma técnica para mouse organoids EHBD-derivado de tecido adulto. Estes organoids EHBD chamados EHBDOs será uma importante ferramenta in vitro para o estudo dos mecanismos subjacentes EHBDs cholangiocyte homeostase e doença de processos, tais como cholangiopathies.

<table><tbody><tr><td><forte>meio de cultura de células L-WRN</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td></td><td>Life Technologies</td><td>12634-010</td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino (FBS)</td><td>1%</td><td>Life Technologies</td><td>10437-028</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>100 U/mL</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td></tr><tr><td><forte>Tampão de lavagem</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td> <td>50 mL</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>125 U/mL</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td></tr><tr><td>Anfotericina B&nbsp;</td><td>6,25 &micro; g/mL</td><td>Life Technologies</td><td>15290-018</td></tr><tr><td><forte>Meio de cultura organoide</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-WRN Meio condicionado&nbsp;</td><td>1:1</td><td>ATCC</td><td>CRL-3276</td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>1:1</td><td>Life Technologies</td><td>12634-010</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>100 U/mL</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td></tr><tr><td>N-Glutamina</td><td>10 &micro; l/mL</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td></tr><tr><td>N-2-hidroxietilpiperazina-N-2-etano sulfônico ácido, HEPES</td><td>10 mM</td><td>Life Technologies</td><td>15630-080</td></tr><tr><td>B27</td><td>10 &micro; l/mL</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td></tr><tr><td>N2</td><td>10 &micro; l/mL</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td></tr><tr><td><forte>Meio de semeadura organoide</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Meio de cultura organoide&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fator de crescimento epidérmico (EGF)</td><td>50 ng/mL</td><td>Invitrogen</td><td>PMG8041</td></tr><tr><td>Fator de crescimento de fibroblastos-10 (FGF10)</td><td>100 ng/mL</td><td>PeproTech</td><td>100-26</td></tr><tr><td>Anticorpos primários</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-Cytokeratin 19 (CK19) anticorpo, Coelho</td><td>1:250</td><td>Abcam</td><td>ab53119</td></tr><tr><td>Região determinante do sexo Y-Box 9 (SOX9) anticorpo, Coelho</td><td>1:200</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-20095</td></tr><tr><td>Pancreatic Duodenal Homeobox 1 (PDX1) anticorpo, Coelho</td><td>1:2000</td><td>DSRB</td><td>F109-D12</td></tr><tr><td>Anticorpo E-caderina, Cabra</td><td>1:500</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-31020</td></tr><tr><td>Anticorpo acetilado de &alfa;-tubulina, Camundongo</td><td>1:500</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6793</td></tr><tr><td>Anticorpos</td><td></td><td></td> secundários<td></td></tr><tr><td>488 rotulado como anti-coelho, Donkey IgG</td><td>1:1000</td><td>Invitrogen</td><td>A-21206</td></tr><tr><td>594 rotulado como anti-cabra, Donkey IgG</td><td>1:1000</td><td>Invitrogen</td><td>A-11058</td></tr><tr><td>568 rotulado como anti-mouse, Goat IgG2b</td><td>1:500</td><td>Invitrogen</td><td>A-21144</td></tr><tr><td>TopFlash Wnt reporter assay</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TopFlash HEK293 linha celular</td><td></td><td>Kit</td><td></td></tr><tr><td></td> de<td>Ensaio de Luciferase</td> ATCC CRL-1573 <td>Biotium</td><td>30003-2</td></tr><tr><td>0,05% Tripsina-EDTA</td><td></td><td>Life Technologies</td><td>25300054</td></tr><tr><td>0,4% Solução</td><td></td> Azul de Tripano <td>Life Technologies</td><td>15250061</td></tr><tr><td>Materiais e reagentes adicionais</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Basement matrix, Matrigel</td><td></td> livre de fenol<td>CORNING</td><td>356237</td></tr><tr><td>Tampão de dissociação, Accutase</td><td></td><td>Gibco</td><td>A1110501</td></tr><tr><td>Meio de congelamento de cultura de células, Recovery</td><td></td><td>Life Technologies</td><td>12648010</td></tr><tr><td>Filtro de células (70 &micro; m, esterilizado)</td><td></td> <td>Fisherbrand</td><td>22363548</td></tr><tr><td>extração de RNA de tiocianato de guanidínio-fenol, TRIzol</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td></tr><tr><td>Gel de processamento de amostras, HistoGel</td><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>HG-4000-012</td></tr><tr><td>Kit</td><td></td> universal de detecção de micoplasma <td>ATCC</td><td>30-1012K</td></tr><tr>Tubo <td></td> de<td>microcentrífuga de 1,5 mL</td><td>Fisherbrand</td><td>05-408-129</td></tr><tr>Placa <td></td> de<td>24 poços</td><td>USA Scientific</td><td>CC7682-7524</td></tr><tr>Tubo <td></td> de<td>centrífuga cônico de 50 mL</td><td>Microscópio</td><td></td>de fluorescência Fisher scientific 14-432-22</tr><tr><td></td><td>Nikon</td><td>Eclipse E800</td>Microscópio invertido Biotium 30003-2 Bandeja de necropsia Fisherbrand 13-814-61 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

geração de organoids de vias biliares extra-hepáticas mouse

Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts

Cholangiopathies, que afectam os ductos biliares extra-hepáticas (EHBDs), incluem atresia biliar, colangite esclerosante primária e colangiocarcinoma. Eles não têm nenhuma opção terapêutica eficaz. Ferramentas para estudar EHBD são muito limitadas. Nosso objetivo foi desenvolver um modelo de órgão específico, versátil, adulto pré-clínicos, células-tronco derivadas de cholangiocyte que pode ser facilmente gerado de tipo selvagem e camundongos geneticamente modificados. Assim, relatamos a nova técnica de desenvolvimento de um sistema de cultura de organoides (EHBDO) EHBD de EHBDs de rato adulto. O modelo é custo-eficiente, capaz de ser prontamente analisadas, e tem múltiplas aplicações a jusante. Especificamente, descrevemos a metodologia de isolamento de EHBD de rato e dissociação de célula única, iniciação de cultura organoides, propagação e manutenção a longo prazo e armazenamento. Este manuscrito também descreve EHBDO processamento de imuno-histoquímica, microscopia fluorescente e quantificação de abundância de mRNA pela reação em cadeia da polimerase em tempo real quantitativa transcrição reversa (qRT-PCR). Este protocolo tem vantagens significativas, além de produzir organoids EHBD específicos. O uso de um meio condicionado de células L-WRN reduz significativamente o custo deste modelo. O uso do mouse EHBDs fornece tecido quase ilimitado para geração de cultura, ao contrário de tecido humano. EHBDOs rato gerado contêm uma população pura de células epiteliais com marcadores de endodermal progenitor e biliares células diferenciadas. Organoids cultivadas manter homogénea morfologia através de múltiplas passagens e podem ser recuperados após um período de armazenamento a longo prazo em nitrogênio líquido. O modelo permite o estudo da proliferação das células progenitoras biliar, pode ser manipulado farmacologicamente e pode ser gerado a partir de camundongos geneticamente modificados. Futuros estudos são necessários para otimizar as condições de cultura a fim de aumentar a eficiência do chapeamento, avaliar a maturidade funcional celular e diferenciação celular direto. Desenvolvimento de modelos de co-cultura e uma matriz extracelular mais biologicamente neutro também são desejáveis.

Nosso protocolo descreve a geração de organoids EHBD de rato que são específicos para tecidos e células-tronco derivadas de adulto. Depois que os organoids são cultivadas, uma formação de estrutura cística pode ser observada logo em 1 dia após o isolamento do EHBD. Contaminação com fibroblastos não é tipicamente observada durante a geração de cultura. EHBDO, chapeamento de eficiência é de aproximadamente 2% quando isolado de neonatal ou adultos (mais de 2 meses) ratos (<strong class="xfig...

Este protocolo descreve a produção de um sistema de 3-dimensional organoides biliar extra-hepática do mouse. Estes organoids biliares podem ser mantidas em cultura para estudar Biologia cholangiocyte. Organoids biliares expressar marcadores do progenitor e células biliares e são compostos de células epiteliais polarizadas.

Geração de Organoids de vias biliares extra-hepáticas Mouse

Cholangiopathies, which affect extrahepatic bile ducts (EHBDs), include biliary atresia, primary sclerosing cholangitis, and cholangiocarcinoma. They have ...

Este sistema organoide do ducto biliar biliar de murina extraheptica pode abordar o acesso limitado a modelos de cholangiopatias pré-clínicos e as limitações de células-tronco pluripotentes e modelos organoides de colangiocito derivados do fígado. Nosso modelo é específico de tecido adulto, reducionista, reprodutível, tempo e custo-benefício. Será de benefício especial para laboratórios que não têm acesso a tecidos humanos.Nossa técnica permite a colheita de um número quase ilimitado de colangiocitos extraháticos do ducto biliar para estudar a regeneração tecidual e as interações célula-célula. Demonstrando o procedimento será Junya Shiota, uma pós-doutora do meu laboratório. Para o isolamento do ducto biliar intraháptico, coloque o camundongo adulto em uma posição supina e abra a cavidade abdominal ao longo da linha média.Retraia o fígado para descansar no diafragma e use um hemostato para puxar suavemente o duodeno proximal para revelar o ducto biliar comum imediatamente abaixo do hilum do fígado. Use um bisturi para separar o ducto biliar extrahático dos tecidos circundantes. Segurando a extremidade proximal do ducto biliar comum com fórceps, disseque o duto distally logo acima de sua conjuntura com o duodeno antes de dissecar a extremidade proximal do duto do fígado.Coloque imediatamente o ducto biliar extraháptico isolado em uma placa de vidro contendo tampão de lavagem frio no gelo, depois limpe o ducto biliar do tecido circundante e pica-se em seções de 0,5 milímetros. Quando todo o tecido tiver sido picado, transfira as seções para um tubo contendo 500 microliters de tampão de dissociação para uma incubação de 20 minutos a 37 graus Celsius. No final da dissociação, neutralize o tampão com 500 microliters de cultura de células geladas média e tritura a suspensão do tecido 20 vezes através de uma agulha de calibre 18 e, em seguida, 20 vezes através de uma agulha de calibre 20.Em seguida, filtrar a suspensão celular resultante através de um filtro de célula de 70 micrômetros em um tubo de 50 milímetros. Para estabelecer uma cultura organoide biliar, coletar as células por centrifugação e remover cuidadosamente o supernatante. Resuspenque a pelota em um mililitro de PBS gelado e estéril e transfira as células para um tubo de 1,5 mililitro para uma segunda centrifugação.Resuspenja a pelota lavada em 120 microliters de matriz de porão liquefeito e gelada e placa de 40 microliters de células no centro de cada um dos três poços de uma placa de 37 graus Celsius aquecida, 24-well, em seguida, coloque a placa em uma incubadora de cultura tecidual de 37 graus Celsius por cerca de 15 minutos. Quando a matriz do porão se solidificar, adicione 600 microlitadores de 37 graus Celsius semeando meio a cada poço antes de devolver a placa à incubadora. Após três dias e a cada três dias depois, substitua o meio de semeadura por 600 microlitros de meio de cultura organoide fresco, monitorando o crescimento organoide regularmente por um microscópio invertido.Para passar as culturas extrahepépticas do ducto biliar, pipeta os organoides em cada poço com 400 microliters de PBS gelado 10 vezes por poço antes de transferir o conteúdo do poço para tubos individuais de 1,5 mililitro. Passe cada mistura através de uma agulha de calibre 25 quatro vezes para dissociar os organoides e coletar as células por centrifugação. Em seguida, resuspende as células na matriz do porão na proporção apropriada para re-chapeamento.Para armazenamento organoide de ducto biliar extrahepático de longo prazo, lave cada poço de organoides com PBS de temperatura ambiente sem perturbar as gotas da matriz do porão e adicione 500 microliters de meio de congelamento gelado a cada poço. Levemente resuspenque os organoides e transfira a mistura em frascos criogênicos individuais, em seguida, coloque os frascos a menos 80 graus Celsius por 48 horas antes de transferir os organoides para um tanque de nitrogênio para armazenamento a longo prazo em uma fase de vapor. Para preparar os organoides para incorporação de parafina, substitua o meio por 500 microlitres de quatro graus Celsius PBS e transfira a suspensão de cada poço para tubos individuais de 1,5 mililitro contendo matriz de porão liquefeito.Colete os organoides por centrifugação e use uma ponta de pipeta P1000 modificada para remover cuidadosamente os supernantes sem perturbar as pelotas. Em seguida, adicione um mililitro de gelo frio, 4% paraformaldeído aos organoides para uma incubação durante a noite a quatro graus Celsius. Na manhã seguinte, substitua o fixador por um mililitro de PBS de temperatura ambiente para uma incubação de cinco minutos à temperatura ambiente e lave os organoides por centrifugação três vezes.Após a última lavagem, resuspenja os organoides em um mililitro de 30% de etanol para uma incubação de cinco minutos à temperatura ambiente, seguido por uma incubação de cinco minutos em um mililitro de 70% de etanol à temperatura ambiente. Ao final da incubação de 70% de etanol, recolham os organoides por centrifugação e resuspensem os organoides em um mililitro de 100% etanol por cinco minutos à temperatura ambiente. No final da incubação de 100% de etanol, o gel de processamento de amostras de calor em um micro-ondas por 20 segundos ou até liquefeito, e adiciona 50 microliters do gel liquefeito a cada tubo de organoides.Coloque os tubos no gelo até que o gel de processamento da amostra seja solidificado e transfira a gota de organoides de cada tubo para entre as almofadas azuis de esponja em uma fita para processamento adicional no embedrador de parafina. Coloque o em um processador de tecido programado por 15 minutos por etapa e, em seguida, se sectionia os organoides incorporados à parafina em gel de processamento de amostras a quatro micrômetros por seção para coloração e análise imunohistoquímica de acordo com os protocolos padrão. A eficiência do revestimento organoide do ducto biliar extrahático é de aproximadamente 2% quando isolada de camundongos neonatais ou adultos.Após a segunda passagem, a eficiência de revestimento de organoides extrahêgicos do ducto biliar derivados de camundongos adultos aumenta para 11% e permanece estável. A maioria dos organoides demonstra uma morfologia cística em todas as passagens com organoides irregulares raros. Os organoides atingem um pico de crescimento de cinco a sete dias, após os quais começam a acumular detritos intraluminais e se deterioram.Portanto, para a manutenção da cultura organoide, os organoides devem ser divididos a cada sete a dez dias. Quando analisados com imunofluorescência, organoides extrahepáticos do ducto biliar consistem em uma população pura de células epiteliais marcadas por E-cadherina. As células organoides também demonstram marcadores de células progenitoras biliares, bem como marcadores de diferenciação biliar.É importante ressaltar que uma alta porcentagem de células organoides possuem um cílio primário marcado por tubulina alfa acetilada, que é uma característica de cholangiocitos normais e sugere uma polarização celular organoide apropriada. É necessária uma adesão próxima à condição de temperatura descrita. Dissecção meticulosa do ducto biliar evita contaminação celular do pâncreas.A perda de material celular pode ser evitada por manipulação cuidadosa após centrifugação. Esses organoides podem ser usados como modelos pré-clínicos, geneticamente e farmacologicamente manipulados, ou usados para testar drogas e os efeitos de agentes infecciosos. Este método pode ser usado por laboratórios que querem aproveitar modelos de camundongos geneticamente modificados para estudar melhor os mecanismos da biologia do cholangiocito.

generation-of-organoids-from-mouse-extrahepatic-bile-ducts

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Uma técnica para isolar cholangiocytes das vias biliares extra-hepáticos de ratos neonatais é descrito. As condutas são meticulosamente dissecados, e, em seguida, as células são isoladas por crescimento em géis de colagénio espessas. Este método fornece uma ferramenta útil para estudar o desenvolvimento do ducto biliar extra-hepática e patologia.

Isolamento de Neonatal extra-hepáticas cholangiocytes

O método de cultura tridimensional descrito neste protocolo recapitula o desenvolvimento do pâncreas dispersos progenitores rato pâncreas embrionárias, incluindo a sua expansão substancial, a diferenciação ea morfogênese em um órgão ramificada. Este método é passível de imagiologia, interferência funcional e a manipulação do nicho.

In Vitro Pâncreas Organogenesis de dispersos rato embrionárias Progenitores

Nós apresentamos um método rather simples e sensível para a quantificação exata da densidade do colagogo no fígado do rato. Este método pode ajudar a determinar os efeitos dos modificadores genéticos e ambientais e a eficácia de terapias potenciais em modelos de camundongo de doenças biliares.

Determinando a densidade do ducto biliar no fígado do rato

Nós mostramos um método para a necropsia e a dissecção de modelos do cancro da próstata do rato, focalizando na dissecção do tumor da próstata. Um protocolo passo a passo para a geração de organóides do tumor da próstata do rato é apresentado igualmente.

Geração de organóides tumorais de modelos de camundongo geneticamente modificados de câncer de próstata

Sistemas celulares tridimensionais (3D) são modelos relevantes para investigar organogênese. Propõe-se um método à base de hidrogel para a produção de cistos biliares e sua caracterização. Este protocolo desvenda as barreiras da caracterização 3D, com um método simples e confiável para avaliar a eficiência, tamanhos e testar sua funcionalidade.

Geração e Caracterização Quantitativa de Cistos Epiteliais Biliar funcionais e polarizados

Um sistema de cultura organoide 3D ex vitro de longo prazo foi estabelecido a partir de hepatócitos de camundongos. Esses organoides podem ser passagemdos e geneticamente manipulados por infecção por lentivírus de construção shRNA/ectópica, transfecção de siRNA e engenharia CRISPR-Cas9.

Estabelecimento e Manipulação Genética de Organoides Hepatocitos De Murine

Para a observação de distúrbios do ducto biliar neonatal murino, um ducto biliar intacto e uma preparação eficiente são necessários. Portanto, uma nova abordagem para isolar todo o sistema do ducto biliar extra-hepático em neonatos murinos foi desenvolvida com sucesso, mantendo a integridade do ducto biliar.

Dissecção do ducto biliar extra-hepático e da vesícula biliar em neonatos de camundongos com nove dias de idade

Este protocolo descreve a geração de organoides hepáticos endodérmicos rápidos e reprodutíveis (eHEPOs). Com este protocolo, os eHEPOs podem ser produzidos em 2 semanas e expandir a longo prazo (mais de 1 ano) sem perder sua diferenciação e funcionalidade.

Geração de Organoides Hepáticos Endodérmicos Funcionais

Organoides gerados a partir de tumores de pacientes são injetados ortotopicamente no fígado de camundongos. A ressecção do tecido hepático não tumoral leva a um ambiente regenerativo no tecido hepático onde o tumor está localizado.

Um modelo de xenoenxerto organoide derivado de paciente com câncer hepatocelular para investigar o impacto da regeneração hepática no crescimento do tumor

Este protocolo apresenta uma técnica otimizada de perfusão hepática de colagenase em duas etapas em um modelo de rato e mostra o uso de hepatócitos isolados para cultura in vitro de longo prazo de organoides 3D.

Perfusão hepática de ratos e isolamento primário de hepatócitos: um procedimento antigo crucial para a cultura de organoides 3D de ponta

Aprenda a gerar organoides de vias biliares extra-hepáticas de camundongos para estudar biologia de colangiócitos e regeneração tecidual. Este método reprodutível e econômico permite cultivar número ilimitado de células.

Geração de Organoids de vias biliares extra-hepáticas Mouse

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