Name: Cultura de células bacterianas no nível de célula única dentro de vesículas gigantes (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-30T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Aprenda a cultivar células bacterianas em nível de célula única dentro de vesículas gigantes usando o método de transferência de gotículas. Esta técnica permite observação direta do crescimento bacteriano em microbiologia.

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Este trabalho foi apoiado por uma iniciativa líder para excelentes pesquisadores jovens (líder, n º 16812285) do Ministério da educação, cultura, esportes, ciência e tecnologia (MEXT) do Japão, um subsídio de ajuda para a pesquisa de jovens cientistas (no. 18K18157, 16K21034) da sociedade de Japão para a promoção da ciência (JSPS) a m. s., e Grant-in-Aid de MEXT a K.K. (no. 17H06417, 17H06413).

1. preparação de GVs contendo células bacterianas pelo método de transferência de gotas
<ol><li>Prepare soluções em estoque lipídico de 1-Palmitoyl-2-oleoyl-SN-glicero-3-fosfocolina (POPC, 10 mM, 1 mL) e 1,2-distearoyl-SN-glicero-3-Fosfoetanolamina-N-[biotinilo (polyethyleneglycol)-2000] (biotina-PEG-DSPE, 0,1 mM, 1 mL) em clorofórmio/ solução de metanol (2/1, v/v) e armazene o estoque a-20 ° c.</li>
	<li>Preparação de uma solução de óleo contendo lipídios
	<ol>
<li>Despeje 20 μL da solução de POPC e 4 μL da solução de biotina-PEG-DSPE em um tubo de vidro (Figura 1b (i)).</li>
		<li>Evacate o solvente orgânico pelo fluxo de ar para formar um filme lipídico e colocar o filme em um dessecador por 1 h para evacorar completamente o solvente orgânico (Figura 1b (II)). Nota: É necessário evate o solvente orgânico em uma capa das emanações.</li>
		<li>Adicionar 200 μL de óleo mineral (0,84 g/mL, tabela de materiais) ao frasco para injetáveis de vidro (Figura 1b (III)).</li>
		<li>Enrole a parte de abertura do frasco de vidro com filme e a proceda num banho Ultrassônico (120 W) durante pelo menos 1 h (Figura 1b (III)). As concentrações finais de POPC e biotina-PEG-DSPE são de 1 mM e 0, 2 mM, respectivamente.</li>
	</ol></li>
	<li>Pré-cultura de células bacterianas
	<ol>
<li>Inocular e. coli em 1x lb médio (1 g de extrato de levedura, 2 g de triptona Bacto, e 2 g de cloreto de sódio em 200 ml de água deionizada) a partir de uma placa lb e incubar a 37 ° c por 12 – 14 h (durante a noite).</li>
		<li>Após a incubação, colete 20 μL da solução de cultura e transfira para 1,98 mL de meio fresco de 1x LB e cultive as células novamente por 2 h.</li>
		<li>Verifique a densidade óptica em 600 nm (OD600) valor da solução pré-cultura (preparada na etapa 1.3.2). Deve ser utilizada uma solução pré-cultura de OD600 = 1,0 – 1,5.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação das soluções aquosas exteriores e interiores de GVs
	<ol>
<li>Dissolver a glicose em 1x LB médio para preparar uma solução aquosa exterior de GVs. Prepare 20 mL de uma solução de glicose de estoque (500 mM).</li>
		<li>Diluir a solução de glicose de estoque com 1x LB médio a 200 mM (tabela 1).</li>
		<li>Dissolver a sacarose em 1x LB médio para preparar uma solução aquosa interna de GVs. Prepare 20 mL de uma solução de sacarose (500 mM).</li>
		<li>Misture a solução pré-cultura (OD600 = 1,0 – 1,5), a solução de sacarose (500 mm) e o meio 1x lb (tabela 1). O valor final do OD600 da solução da cultura deve ser 0.01 – 0,015 e a concentração final da sacarose deve ser 200 milímetros. Nota: Tome cuidado para evitar a pressão osmótica. É necessário equilibrar a concentração entre a solução aquosa interna e externa.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação de gotas de água-em-óleo (W/O) contendo células bacterianas
	<ol>
<li>Adicionar 2 μL da solução aquosa interna de GVs (preparada na etapa 1.4.4) a 50 μL da solução de óleo contendo lipídios (óleo mineral com POPC e biotina-PEG-DSPE) em um tubo de plástico lidded 0,6 mL (Figura 1b (IV)).</li>
		<li>Emulsionar os dois componentes no tubo de plástico tocando o tubo com a mão (Figura 1b (v)).</li>
	</ol></li>
	<li>Formação de GVs contendo células bacterianas
	<ol>
<li>Adicionar 50 μL da solução aquosa exterior de GVs (preparada no passo 1.4.2) num tubo de plástico com tampa de 1,5 mL (Figura 1b (vi)) e suavemente camada 150 μl da solução de óleo contendo lipídios (óleo mineral com popc e biotina-Peg-dspe) na superfície do aquoso exterior solução (Figura 1b (VII)). Incubar esta amostra à temperatura ambiente (RT, 25 ° c) durante 10 – 15 min. Verifique se a interface do óleo e das soluções aquosas está plana.</li>
		<li>Adicionar 50 μL da solução de gota W/O (preparada no passo 1.5.2) na interface do óleo e solução aquosa utilizando uma pipeta (Figura 1b (VIII)).</li>
		<li>Centrifugue o tubo plástico lidded de 1,5 mL (da etapa 1.6.2) por 10 minutos em 1.600 x g em RT em um centrifugador do desktop (Figura 1b (IX)). Após a centrifugação, aspirar o óleo (camada superior) do tubo plástico lidded 1,5-mL usando uma pipeta, e coletar os GVs que contêm pilhas bacterianas (Figura 1b (x)).</li>
	</ol></li>
</ol>2. preparação de um sistema de observação GV (sistema de cultura de células bacterianas)
<ol><li>
Preparação de pequenas vesículas (SVs) para constructi ng a membrana de BICAMADA suportada
	<ol>
<li>Despeje 20 μL da solução de POPC e 4 μL da solução de biotina-PEG-DSPE em um tubo de vidro (usando a mesma composição lipídica usada para a preparação de GV na etapa 1,1).</li>
		<li>Evacate o solvente orgânico pelo fluxo de ar para dar forma a um filme do lipido e coloc esta amostra em um exsicador para 1 h para evacorar completamente o solvente orgânico.</li>
		<li>Adicionar 200 μL de glicose de 200 mM em meio de 1x LB (a solução aquosa externa de GVs) ao frasco de vidro.</li>
		<li>Enrole a parte de abertura do frasco de vidro com filme e proceda-lo em um banho ultra-sônico (120 W) para pelo menos 1 h.</li>
		<li>Prepare SVs pelo método de extrusão21 usando uma mini-extrusora e membrana de policarbonato com 100 nm tamanho dos poros.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparação de uma câmara artesanal
	<ol>
<li>Perfure um furo de 7 mm com um perfurador oco em um selo de dupla face (10 mm x 10 mm x 1 mm).</li>
		<li>Cole o selo de dupla face com o furo em um vidro de cobertura (30 mm x 40 mm, espessura 0,25 – 0,35 mm).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparação de uma membrana de BICAMADA suportada no vidro de cobertura no orifício da câmara
	<ol>
<li>Adicionar 30 μL da solução SV ao orifício da câmara (preparado na secção 2,2) e incubar na RT durante 30 min.</li>
		<li>Lave suavemente o orifício duas vezes com 20 μL de meio de 1x LB contendo 200 mM de glicose (a solução aquosa externa de GVs) por pipetagem.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Imobilização de GVs no membrana de BICAMADA suportada no vidro da tampa no furo da câmara
	<ol>
<li>Introduzir 10 μL de neutravidina com a solução aquosa exterior de GVs (1 mg/mL) no orifício e incubar na RT durante 15 min.</li>
		<li>Lave suavemente o orifício duas vezes com 20 μL de meio de 1x LB contendo 200 mM de glicose (a solução aquosa externa de GVs) por pipetagem.</li>
		<li>Adicionar todas as soluções contendo GVs (preparadas na etapa 1.6.3) no orifício da câmara e selar com um vidro de cobertura (18 mm x 18 mm, espessura 0,13 – 0,17 mm) (Figura 2b).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Observação microscópica do crescimento de células bacterianas dentro de GVs
	<ol>
<li>Defina um sistema de estágio de aquecimento microscópico com um microscópio invertido equipado com uma lente objetiva de abertura numérica de 40x/0,6 (NA) com uma longa distância de trabalho (Figura 2b).</li>
		<li>Coloque a câmara no sistema de estágio de aquecimento microscópico (Figura 2b). Incubar os GVs contendo células bacterianas na câmara a uma condição estática de 6 h a 37 ° c.</li>
		<li>Capture e registre imagens do microscópio do crescimento bacteriano da pilha dentro de GVs cada 30 minutos usando uma câmera complementar científica do semicondutor do óxido metálico (sCMOS).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+regulation+at+the+single-cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gene regulation at the single-cell level.</a> Science. 307, 1962-1965 (2005).</li>
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<li>Hashimoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise-driven+growth+rate+gain+in+clonal+cellular+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Noise-driven growth rate gain in clonal cellular populations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3251-3256 (2016).</li>
<li>Boedicker, J. Q., Vincent, M. E., Ismagilov, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+confinement+of+single+cells+of+bacteria+in+small+volumes+initiates+high-density+behavior+of+quorum+sensing+and+growth+and+reveals+its+variability%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Microfluidic confinement of single cells of bacteria in small volumes initiates high-density behavior of quorum sensing and growth and reveals its variability.</a> Angewandte Chemie International Edition. 48, 5908-5911 (2009).</li>
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<li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+growth+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Robust growth of Escherichia coli.</a> Current Biology. 20, 1099-1103 (2010).</li>
<li>Reshes, G., Vanounou, S., Fishov, I., Feingold, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+shape+dynamics+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Cell shape dynamics in Escherichia coli.</a> Biophysical Journal. 94, 251-264 (2008).</li>
<li>Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Persistence+as+a+Phenotypic+Switch%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial Persistence as a Phenotypic Switch.</a> Science. 305, 1622-1625 (2004).</li>
<li>Brouzes, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+microfluidic+technology+for+single-cell+high-throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Droplet microfluidic technology for single-cell high-throughput screening.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (34), 14195-14200 (2009).</li>
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<li>Eun, Y., Utada, A. S., Copeland, M. F., Takeuchi, S., Weibel, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulating+bacteria+in+agarose+microparticles+using+microfluidics+for+high-throughput+cell+analysis+and+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Encapsulating bacteria in agarose microparticles using microfluidics for high-throughput cell analysis and isolation.</a> ACS Chemical Biology. 6, 260-266 (2011).</li>
<li>Allen, T. M., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposomal+drug+delivery+systems%3A+From+concept+to+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Liposomal drug delivery systems: From concept to clinical applications.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 65, 36-48 (2013).</li>
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<li>Noireaux, V., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+vesicle+bioreactor+as+a+step+toward+an+artificial+cell+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (51), 17669-17674 (2004).</li>
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<li>Chowdhuri, S., Cole, C. M., Devaraj, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulation+of+Living+Cells+within+Giant+Phospholipid+Liposomes+Formed+by+the+Inverse-Emulsion+Technique%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Encapsulation of Living Cells within Giant Phospholipid Liposomes Formed by the Inverse-Emulsion Technique.</a> ChemBioChem. 17, 886-889 (2016).</li>
<li>Morita, M., Katoh, K., Noda, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+bacterial+growth+in+giant+unilamellar+vesicles%3A+a+novel+tool+for+bacterial+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22ChemistryOpen%22%5BJournal%5D)">Direct observation of bacterial growth in giant unilamellar vesicles: a novel tool for bacterial cultures.</a> ChemistryOpen. 7, 845-849 (2018).</li>
<li>Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+Unilamellar+Vesicles+Using+an+Inverted+Emulsion%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Production of Unilamellar Vesicles Using an Inverted Emulsion.</a> Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).</li>
<li>Hope, M. J., Bally, M. B., Webb, G., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+large+unilamellar+vesicles+by+a+rapid+extrusion+procedure.+Characterization+of+size+distribution%2C+trapped+volume+and+ability+to+maintain+a+membrane+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Production of large unilamellar vesicles by a rapid extrusion procedure. Characterization of size distribution, trapped volume and ability to maintain a membrane potential.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 812, 55-65 (1985).</li>
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<li>Li, A., Pazzi, J., Xu, M., Subramaniam, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellulose+abetted+assembly+and+temporally+decoupled+loading+of+cargo+into+vesicles+synthesized+from+functionally+diverse+lamellar+phase+forming+amphiphiles%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Cellulose abetted assembly and temporally decoupled loading of cargo into vesicles synthesized from functionally diverse lamellar phase forming amphiphiles.</a> Biomacromolecules. 19, 849-859 (2018).</li>
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<li>Kurokawa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+cytoskeleton+for+stabilizing+artificial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">DNA cytoskeleton for stabilizing artificial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (28), 7228-7233 (2017).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Aqui, nós descrevemos um método para cultivar pilhas bacterianas a nível da único-pilha dentro de GVs. Este método simples envolve a formação de GVs contendo células bacterianas no nível de célula única usando o método de transferência de gotas. Comparado com outras abordagens para a obtenção de GVs contendo células bacterianas, este método tem duas vantagens: (i) é fácil de desenvolver, e (II) um pequeno volume (2 μL) da solução de amostra é necessário para preparar os GVs. O método de transferência de gotas<sup class="...

A cultura de células bacterianas no nível de célula única tem recebido atenção crescente. A cultura de células bacterianas no nível de célula única dentro de um espaço confinado pode elucidar funções bacterianas como a variabilidade fenotípica1,2,3,4, comportamento celular5, 6 anos de , 7 anos de , 8 . º , 9, e resistência aos antibióticos10,11. Por causa dos avanços recentes nas técnicas da cultura, a cultura de únicas bactérias pode ser conseguida dentro de um espaço confinado, como em um poço-microplaqueta4, 7,8, gota de gel12,13 , e água-em-óleo (W/s) gota5,11. Para promover a compreensão ou a utilização de únicas pilhas bacterianas, uns desenvolvimentos técnicos mais adicionais de técnicas do cultivation são necessários.
As vesículas que imitam a membrana celular biológica são compartimentos esféricos consistindo de moléculas anfífilas e podem conter vários materiais. As vesículas são classificadas de acordo com o tamanho e incluem pequenas vesículas (SVs, diâmetro < 100 nm), grandes vesículas (LVs, < 1 μm) e vesículas gigantes (GVs, > 1 μm). SVs ou LVs são comumente usados como portadores de drogas por causa de sua afinidade com a membrana celular biológica14. Os GVS também têm sido utilizados como um sistema de reator para a construção de protocélulas15 ou células artificiais16. O encapsulamento de células biológicas em GVS foi relatado17,18, e assim o GVS mostra potencial como um sistema de cultura celular quando combinado com o sistema de reator.
Aqui, juntamente com um vídeo de procedimentos experimentais, descrevemos como os GVs podem ser usados como novos vasos de cultura de células19. GVs contendo bactérias foram feitas pelo método de transferência de gotas20 e, em seguida, foram imobilizados em uma membrana suportada em um vidro de cobertura. Utilizamos este sistema para observar o crescimento bacteriano no nível de célula única dentro de GVs em tempo real.

<table><tbody><tr><td>Bactotriptona</td><td>BD Biosciences</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>Wako Pure Chemicals</td><td>032-21921</td><td></td></tr><tr><td>Vidro de cobertura (18 &vezes; 18 mm)</td><td>Matsunami Glass Ind.</td><td>C018181</td><td>espessura 0.13- 0,17 mm</td></tr><tr><td>Vidro de cobertura (30 &vezes; 40 mm)</td><td>Matsunami Glass Ind.</td><td>espessura de pedido personalizado</td><td>0,25: centrífuga de mesa de 0,35 mm</td></tr><tr><td></td><td>Hi-Tech Co.</td><td>ATT101</td><td>tipo rotor oscilante</td></tr><tr><td>Vedação de dupla face (10 &vezes; 10 &vezes; 1 mm)</td><td>Nitoms</td><td>T4613</td><td></td></tr><tr><td>Frasco de vidro</td><td>AS ONE</td><td>6-306-01</td><td>Tubo de fermentação Durham</td></tr><tr><td>Glicose</td><td>Wako Pure Chemicals</td><td>049-31165</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio invertido</td><td>Olympus</td><td>IX-73</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Wako Pure Chemicals</td><td>133-16771</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de estágio de aquecimento microscópico</td><td>TOKAI HIT</td><td>TP-110R-100</td><td></td></tr><tr><td>Óleo mineral</td><td>Nacalai Tesque</td><td>23334-85</td><td></td></tr><tr><td>Mini-extrusora</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610000</td><td></td></tr><tr><td>Neutravidina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31000</td><td></td></tr><tr><td>Lente objetiva</td><td>Olympus</td><td>LUCPLFLN 40&times;/0.6 NA</td><td></td></tr><tr><td>Membranas de policarbonato</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610005</td><td>tamanho dos poros 100 nm</td></tr><tr><td>câmera sCMOS</td><td>Andor</td><td>Zyla 4.2 mais</td><td></td></tr><tr><td>cloreto de sódio</td><td>Wako Pure Chemicals</td><td>191-01665</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Wako Pure Chemicals</td><td>196-00015</td><td></td></tr><tr><td>Banho ultrassônico</td><td>COMO UM</td><td>EXTRATO DE LEVEDURA ASU-3D</td><td></td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de plástico com tampa de 0,6 mL</td><td>Watson</td><td>130-806C</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de plástico com tampa de 1,5 mL</td><td>Sumitomo Bakelite Co.</td><td>MS4265-M</td><td></td></tr><tr><td>1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850457P</td><td>POPC</td></tr><tr><td>1,2-distearoil-snglicero-3-fosfoetanolamina-N-[biotinil(polietilenoglicol)-2000]</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>880129P</td><td>Biotina-PEG-DSPE</td></tr></tbody></table>

cultura de células bacterianas no nível de célula única dentro de vesículas gigantes

Bacterial Cell Culture at the Single-cell Level Inside Giant Vesicles

Nós desenvolvemos um método para cultivar pilhas bacterianas a nível da único-pilha dentro dos vesículas gigantes (GVS). A cultura bacteriana da pilha é importante para compreender a função de pilhas bacterianas no ambiente natural. Por causa dos avanços tecnológicos, as várias funções bacterianas da pilha podem ser reveladas no nível da único-pilha dentro de um espaço confinado. Os GVs são compartimentos de microdimensões esféricos compostos por moléculas de lipídios anfífilos e podem conter vários materiais, incluindo células. Neste estudo, uma única pilha bacteriana foi encapsulada em GVs de 10 – 30 μm pelo método de transferência da gota e os GVs que contêm pilhas bacterianas foram imobilizados em uma membrana suportada em um substrato de vidro. Nosso método é útil para observar o crescimento em tempo real de bactérias únicas dentro de GVs. Nós cultivou pilhas de Escherichia coli (E. coli) como um modelo dentro de GVS, mas este método pode ser adaptado a outros tipos da pilha. Nosso método pode ser usado na ciência e nos campos industriais da microbiologia, da biologia, da biotecnologia, e da biologia sintética.

Apresentamos um método simples para a geração de GVs contendo células bacterianas únicas utilizando o método de transferência de gotas (Figura 1). A Figura 1a mostra uma imagem esquemática da precipitação de GVS contendo bactérias. As gotas de W/O que contêm as bactérias são transferidas através da relação da óleo-água (monolayer do lipido) pela centrifugação para dar forma a GVs. A diferença de densidade entre a sacarose (soluçã...

Nós demonstramos a cultura da único-pilha das bactérias dentro das vesículas gigantes (GVs). GVs contendo células bacterianas foram preparados pelo método de transferência de gotas e foram imobilizados em uma membrana suportada em um substrato de vidro para observação direta do crescimento bacteriano. Essa abordagem também pode ser adaptável a outras células.

Cultura de células bacterianas no nível de célula única dentro de vesículas gigantes

We developed a method for culturing bacterial cells at the single-cell level inside giant vesicles (GVs). Bacterial cell culture is important for ...

Este protocolo fornece um meio para acultura de células bacterianas no nível de célula única dentro de vesículas gigantes. É fácil desenvolver as vesículas gigantes, e apenas um volume muito pequeno de solução amostral é necessário para preparar as vesículas. Demonstrando o procedimento estará Yuri Ota, doutorando do nosso laboratório.Comece adicionando 20 microliters de solução POPC recém-preparada e quatro microliters de solução biotina-PEG-DSPE recém-preparada a um frasco de vidro. Evaporar o solvente orgânico pelo fluxo de ar até formar uma filmagem lipídica. Coloque o filme em um desiccator por uma hora para evaporar completamente o solvente orgânico.Em seguida, adicione 200 microliters de óleo mineral ao frasco. Cubra a abertura do frasco com filme de parafina de plástico, e sonicar o conteúdo do frasco em um banho ultrassônico a 120 watts por pelo menos uma hora. Para uma pequena preparação vesícula, crie um filme lipídico, como acabou de demonstrar, e adicione 200 microliters de glicose de 200 milímetros no meio LB ao filme.Em seguida, sonicar o filme a 120 watts por pelo menos uma hora, seguido pela extrusão das vesículas gigantes resultantes em pequenas vesículas usando uma mini extrusora e uma membrana de policarbonato com um tamanho de poros de 100 nanômetros. Para pré-cultura celular bacteriana, inocular E.coli de uma placa LB em mililitros de meio LB para uma cultura noturna a 37 graus Celsius. Na manhã seguinte, transfira 20 microliters do supernascer da cultura para 1,98 mililitros de meio LB fresco para mais duas horas de cultura.No final da incubação, verifique a densidade óptica em 600 nanômetros, ou valor de 600 OD, da solução pré-cultura em um espectotômetro. Uma solução pré-cultura com um OD 600 de um a 1,5 deve ser usada. Em seguida, misture a solução pré-cultura com solução de sacarose recém-preparada e meio LB fresco, de acordo com a tabela um.Para formação de vesículas gigantes, adicione 50 microlitadores de uma solução aquosa externa recém-preparada de vesículas gigantes a um tubo de plástico de 1,5 mililitro. Camada suave 150 microliters da solução de óleo contendo lipídios sobre a solução aquosa externa de vesículas gigantes. Incubar a solução resultante por 10 a 15 minutos em temperatura ambiente, antes de verificar para garantir que a interface do óleo e soluções aquosas seja plana.Para a célula bacteriana de água e óleo contendo formação de gotículas, adicione dois microliters de uma solução aquosa interna recém-preparada de vesículas gigantes a 50 microliters da solução de óleo contendo lipídios sonicados em um tubo plástico litoleiro de 0,6 mililitro. Em seguida, toque no tubo para emulsionar os dois componentes. Em seguida, use uma pipeta para adicionar 50 microliters de água e solução de gotícula de óleo à interface do óleo e solução aquosa, e sedimentar as vesículas gigantes contendo células bacterianas por centrifugação.Em seguida, aspire a camada de óleo superior e colete as vesículas gigantes. Para preparar uma câmara artesanal, faça um buraco de sete milímetros com um soco oco em um selo de 10 por 10 por um milímetro de dupla cara, em seguida, cole a vedação de duas caras em um vidro de cobertura de 30 por 40 milímetros. Para preparar uma membrana bi-camada suportada, adicione 30 microliters da pequena solução vesícula ao orifício da câmara artesanal.Incubar as vesículas em temperatura ambiente por 30 minutos. No final da incubação, lave suavemente o orifício duas vezes com 20 microliters de meio LB, suplementado com 200 milimil. Para imobilizar vesículas gigantes na membrana bi-camada de apoiador, introduza 10 microliters de neutravidina em solução de vesícula gigante aquosa externa para o buraco para uma incubação de 15 minutos à temperatura ambiente.No final da incubação, lave suavemente o orifício duas vezes com 20 microliters de meio LB, suplementado com 200 milimil. Em seguida, sele o orifício com um vidro de cobertura de 18 por 18 milímetros. Para monitorar o crescimento bacteriano dentro das vesículas gigantes, selecione o objetivo de 40X em um microscópio invertido e coloque a câmara no sistema de estágio de aquecimento do microscópio.Em seguida, incubar as vesículas gigantes contendo células bacterianas na câmara em condições estáticas por seis horas a 37 graus Celsius, capturando e registrando imagens do crescimento celular bacteriano a cada 30 minutos, com a câmera científica complementar de óxido de metal semicondutor. Vesículas gigantes contendo células bacterianas normalmente variam em tamanho de 10 a 30 micrômetros. Para ambos os tamanhos de vesículas gigantes, as células E.coli sofrem processos de alongamento e divisão, com algumas células de E.coli crescendo para um número muito grande de células durante o período de observação de seis horas.A frequência relativa de vesículas gigantes contendo um único nível celular é aproximadamente 10% das vesículas gigantes obtidas, e as vesículas gigantes encapsuladas ao nível de célula única são aproximadamente 50% das vesículas gigantes contendo células bacterianas. A estabilidade da interface óleo-água é importante para a obtenção de vesículas gigantes contendo células bacterianas. Tome cuidado para aspirar o óleo cuidadosamente antes da correção vesícula gigante.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como cultivar células bacterianas no nível de célula única dentro de vesículas gigantes individuais. Nosso método de cultura bacteriana é uma nova ferramenta em microbiologia para cultivar bactérias ambientais desconhecidas para obter ou analisar seus produtos metabólicos.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Fonte: Watson, D. C., et.al. Isolamento e purificação escaláveis de vesículas extracelulares de Escherichia coli e outras bactérias. J. Vis. Exp. (2021)Este vídeo demonstra o isolamento e a concentração de vesículas extracelulares (EVs) derivadas da membrana externa de bactérias geneticamente modificadas. O processo envolve a cultura das bactérias para liberar EVs, seguido por etapas sequenciais de centrifugação e filtração para remover células e detritos. Finalmente, a ultrafiltração é usada...

Isolamento e Enriquecimento de Vesículas Extracelulares Derivadas da Membrana Externa de Bactérias

Fonte: Morita, M., et al. Cultura de células bacterianas no nível de célula única dentro de vesículas gigantes. J. Vis. Exp. (2019).Este vídeo demonstra um método para cultivar e observar células bacterianas individuais encapsuladas dentro de vesículas gigantes ancoradas a uma bicamada lipídica suportada. O sistema permite imagens estáveis e de longo prazo da dinâmica de crescimento de uma única célula em um microambiente confinado e fisiologicamente relevante.

Cultura de células únicas de bactérias em vesículas gigantes

Fonte: Cabeen, M. T., et al. Análise Microfluídica de célula única de Bacillus subtilis. J. Vis. Experiência (2018)O vídeo demonstra o uso de um dispositivo microfluídico para observar o crescimento bacteriano em nível de célula única. Ele mostra como células bacterianas não móveis, confinadas em trincheiras em microescala, são continuamente nutridas e visualizadas sob um microscópio de fluorescência. A configuração permite visualização em tempo real da divisão celular e do rastreamento de...

Monitorando o crescimento bacteriano em resolução de célula única em um sistema microfluídico

Neste protocolo, é introduzida a fabricação, configuração e operação básica de um biorreator picoliter microfluídico (PLBR) para análise de célula única de microrganismos procarióticos. Microrganismos industrialmente relevantes foram analisados como prova de princípio, permitindo insights sobre taxa de crescimento, morfologia e heterogeneidade fenotípica ao longo de certos períodos de tempo, dificilmente possíveis com métodos convencionais.

Biorreator Picoliter Microfluídico para Análise Microbiana de Célula Única: Fabricação, Configuração do Sistema e Operação

Vesículas gigantes contendo componentes micrométricos altamente compactados são modelos de células úteis. O método de centrifugação em emulsão água-em-óleo é uma ferramenta simples e poderosa para a preparação de vesículas gigantes com materiais encapsulados.

Preparação de gigantes Vesículas Encapsulamento microesferas por centrifugação de uma emulsão de água-em-óleo

Apresentamos um método de análise microfluidic de linhagens de células bacterianas individuais usando Bacillus subtilis como exemplo. O método supera deficiências dos métodos tradicionais de análise em microbiologia, permitindo a observação de centenas de gerações de células sob condições de crescimento firmemente controlável e uniforme.

Célula única Microfluidic análise de Bacillus subtilis

Aqui, descrevemos um método de micro-aspiração de célula única para a separação de amebae infectada. A fim separar subpopulações virais no vermiformis de Vermamoeba contaminado por Faustoviruses e por vírus gigantes desconhecidos, nós desenvolvemos o protocolo detalhado abaixo e demonstramos sua habilidade de separar dois vírus gigantes novos low-abundance.

Micro-aspiração de célula única como uma estratégia alternativa à classificação celular ativada por fluorescência para separação de mistura de vírus gigante

As bactérias secretam vesículas extracelulares (EVs) de tamanho nanométrico que transportam moléculas biológicas bioativas. A pesquisa EV se concentra na compreensão de sua biogênese, papel nas interações micróbio-micróbio e hospedeiro-micróbio e doença, bem como suas potenciais aplicações terapêuticas. Um fluxo de trabalho para isolamento escalável de EVs de várias bactérias é apresentado para facilitar a padronização da pesquisa de EV.

Isolamento escalável e purificação de vesículas extracelulares de Escherichia coli e outras bactérias

O presente protocolo fornece descrições detalhadas para isolamento, concentração e caracterização de vesículas extracelulares de culturas cianobacterianas. Abordagens para purificar vesículas de culturas em diferentes escalas, trocas entre metodologias e considerações para o trabalho com amostras de campo também são discutidas.

Isolamento e Caracterização de Vesículas Extracelulares Cianobacterianas

Este protocolo descreve o método de emulsão invertida usado para encapsular um sistema de expressão livre de células (CFE) dentro de uma vesícula unilamelar gigante (GUV) para a investigação da síntese e incorporação de uma proteína de membrana modelo na bicamada lipídica.

Reconstituição do canal receptor de glutamato bacteriano por encapsulamento de um sistema de expressão livre de células

Este artigo apresenta um método para a preparação de vesículas unilamelares gigantes compostas (cGUVs) com uma estrutura vesícula em vesícula, com condutividade elétrica personalizada nas regiões interna, anular e externa. A eletroformação sintetiza GUVs simples, que são transformados em estomatócios e cGUVs por meio de choque osmótico, fornecendo um modelo valioso para estudar a biofísica de células nucleadas.

Síntese de Vesículas Unilamelares Gigantes Compostas: Um Modelo Biomimético de Células Nucleadas

Aprenda a cultivar células bacterianas em nível de célula única dentro de vesículas gigantes usando o método de transferência de gotículas. Esta técnica permite observação direta do crescimento bacteriano em microbiologia.

Cultura de células bacterianas no nível de célula única dentro de vesículas gigantes

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