Segmentação de agregados Alpha synuclein em fibras nervosas periféricas cutâneas por ensaio de imunofluorescência livre-flutuante

O diagnóstico da doença de Parkinson ainda se baseia em sinais clínicos de envolvimento motor que aparecem mais tarde no curso da doença, quando a maioria dos neurônios da substantia nigra já estão perdidos. Este protocolo permite que a análise dos nervos dérmicos por biópsia da pele, que representa um potencial novo biomarcador da doença, seja usada em ensaios clínicos. A biópsia da pele é um procedimento facilmente avaliável, não invasivo que permite a análise do tecido nervoso periférico que é propenso à patologia.

A synucleína alfa agrega a detecção por biópsia da pele pode ser usada para fins diagnósticos, possivelmente em fases iniciais, quando a cura potencial é mais eficaz. Biópsias de pele de acompanhamento no mesmo paciente permitem uma análise temporal e especial do curso de synucleína alfa se espalhando no sistema nervoso cutâneo humano. Estes podem lançar luz sobre a patogênese da doença.

Para iniciar este procedimento, prepare uma nova solução fixativa PLP conforme descrito na Tabela Um do protocolo de texto. Imediatamente após a coleta da biópsia da pele, submerse-a em um tubo contendo 10 mililitros da solução fixa. Incubar durante a noite a quatro graus Celsius.

No dia seguinte, em um capô de fumaça, remova o PLP fixativo suavemente. No mesmo tubo, lave a biópsia três vezes por cinco minutos cada, usando cinco mililitros da solução de 0,1 molar Sorensen para cada lavagem. Descarte a solução do Sorensen e adicione cinco mililitros de solução crioprotetor.

Incubar durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, armazene a biópsia a quatro graus Celsius se o corte com um criotome for realizado dentro de uma semana. Primeiro, coloque o criotome para menos 20 graus Celsius.

Pegue uma criomold e encha-a com meio crio-incorporando. Usando pinças, mergulhe a biópsia no meio de incorporação crio-inscrita, com o eixo longitudinal paralelo ao fundo do criomold. Es clique congelar a amostra com nitrogênio líquido, para obter um cubo sólido de meio de incorporação crio-incorporador contendo a biópsia na orientação correta.

Coloque a amostra no criostat, e espere 30 minutos para permitir que a biópsia se aclimata. Em seguida, fixar a amostra no criostat e cortar em seções de 50 micrômetros. Usando uma pequena escova, transfira as crio-seções para uma placa de 96 poços contendo 200 microliters de solução anticongelante em cada poço.

Depois disso, armazene a placa a menos 20 graus Celsius. Para começar, encha alguns dos poços de uma placa fresca de 96 poços com 100 microliters de solução de lavagem. Transfira as seções a serem analisadas da placa de armazenamento para aquela que contém a solução de lavagem.

Deixe as seções na solução de lavagem por 10 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, transfira cada seção para um poço vazio contendo a mesma solução de lavagem e repita a lavagem. Em seguida, adicione a solução de lavagem às seções e transfira-as para novos poços contendo 100 microliters de solução de bloqueio.

Incubar em temperatura ambiente por pelo menos 90 minutos, e no máximo quatro horas. Diluir os anticorpos primários, anti-PGP9.5 e anti-5G4, na solução de trabalho. Transfira as seções para novos poços contendo 100 microlitadores da solução de trabalho dos anticorpos primários e incubar durante a noite à temperatura ambiente.

No dia seguinte, lave as seções em poços contendo solução de lavagem como descrito anteriormente. Diluir os anticorpos secundários, anti-coelho de cabra para detectar PGP9.5 e anti-rato de cabra para detectar 5G4, na solução de trabalho. Transfira as seções lavadas para novos poços contendo 100 microliters da solução de trabalho dos anticorpos secundários.

Cubra a placa com papel alumínio para evitar o branqueamento do fluorohore conjugado com anticorpos secundários e incubar à temperatura ambiente por 90 minutos. Depois disso, lave as seções duas vezes na solução de lavagem como descrito anteriormente. Transfira as seções lavadas para novos poços contendo 100 microliters de DAPI por cinco minutos em temperatura ambiente.

Lave as seções duas vezes na solução de lavagem como descrito anteriormente. Em seguida, monte as seções em um slide na posição correta, evitando dobras erradas. Adicione algumas gotas de meio de montagem ao slide e cubra a seção com um deslizamento de cobertura.

Deixe os slides secarem durante a noite. No dia seguinte, armazene os slides em uma caixa apropriada a quatro graus Celsius, certificando-se de evitar a exposição à luz. Usando um microscópio de fluorescência invertida ou um microscópio confocal, visualize as seções.

Adquira as imagens por uma câmera conectada ao microscópio. Em seguida, use um microscópio de fluorescência ou um microscópio confocal para analisar sinais positivos em seções em termos de distribuição espacial e intensidade do sinal, conforme descrito no protocolo de texto. Seguindo o método descrito, os agregados de sinucleína alfa rotulados com anticorpo 5G4 são detectados em fascicles nervosos dérmicos inervando estruturas autônomas de pacientes com DP.

A morfologia dos depósitos de sinucleína alfa aparece como um sinal pontilhado ao longo dos axônios dos nervos dérmicos. O uso representativo deste protocolo em 19 pacientes com DP e 17 controles em biópsias de pele em três locais anatômicos mostra que o 5G4 tem sensibilidade de 81% e uma especificidade de 86% quando comparado a controles saudáveis. A sinucleína alfa fosforilada tem uma sensibilidade de 56% e uma especificidade de 100%5G4 e depósitos alfa fosfoilados alfa sinucleína positivo são encontrados principalmente em torno de glândulas sudoríparas, mas também são encontrados em pili musculares, pequenos vasos e plexo subepidérmico e dérmico, mas nunca em fibras nervosas intraepidérmicas.

Geralmente, dentro das glândulas sudoríparas lúmen, é possível observar um sinal inespecífico que poderia ser mal interpretado como 5G4 ou positividade alfa sinucleína fosforilada. Este tipo de sinal é pontilhado, esférico, e é provavelmente devido ao material autofluorescente intraluminal, como demonstrado em controles técnicos sem anticorpos primários e secundários. A colocalização com PGP9.5 que marca as fibras nervosas, que são morfologicamente filamentosas e alongadas, ajuda a identificar o sinal correto.

Portanto, a especificidade do sinal 5G4 é altamente aumentada por um imunostaining duplo com um marcador axonal. Uma fixação precisa da biópsia é necessária para produzir uma coloração imunofluorescente de boa qualidade e para a interpretação confiável dos sinais fluorescentes. Se o fixador não estiver preparado corretamente, ou se ocorreu uma super-fixação, o resultado será uma alta autofluorescência que irá mascarar o sinal de fibras nervosas cruzando a junção dérmico-epidérmico, ou inerterar as principais estruturas dérmicas.

A etapa mais crítica deste procedimento é a fixação tecidual. Preste atenção ao pH da solução fixativa PLP, e ao tempo de incubação, para evitar autofluorescência e um sinal específico.