Difração de raios X do músculo esquelético murino intacto como uma ferramenta para estudar a base estrutural da doença muscular
18 de julho de 2019
Nós apresentamos protocolos detalhados para executar experimentos do difraction do raio X do pequeno-ângulo usando os músculos esqueletais do rato intact. Com a ampla disponibilidade de modelos de camundongo transgênicos para doenças humanas, esta plataforma experimental pode formar um leito de teste útil para elucidar a base estrutural de doenças musculares genéticas
O músculo esquelético fisiologicamente intacto do camundongo pode produzir padrões de difração de raios-X de alta qualidade contendo muitas informações estruturais que podem fornecer insights sobre processos fisiológicos. A difração de raios-X é a única técnica que permite a aquisição de informações estruturais de alta resolução do tecido muscular vivo em condições fisiológicas reais em tempo fisiológico real. Muitas doenças musculares são herdadas.
Com o aumento da disponibilidade para modificar geneticamente a maioria dos modelos de miopatias, a difração de raios-X pode fornecer insights estruturais em mecanismos de doença e indicar estratégias terapêuticas. A maioria dos músculos extensor digitorum longus e soleus são particularmente convenientes para este fim. Mas muitos outros músculos em animais pequenos podem ser dissecados intactos e manuseados de forma semelhante.
Antes de iniciar o procedimento, ligue o transdutor combinado de força motora, o controlador transdutor de força motor com um estimulador de corrente bifásica de alta potência, e um sistema de controle de aquisição de dados de controle de computador. Em seguida, pulverize a pele no membro traseiro do mouse com solução fria de Ringer e use uma tesoura de dissecção fina para cortar a pele ao redor da coxa. Usando fórceps número cinco, puxe rapidamente a pele para baixo para expor os músculos e amputar o membro traseiro.
Coloque o membro em um prato de dissecação revestido de elastômero contendo a solução de Ringer oxigenado e coloque o prato sob um microscópio de dissecação binóculo. Para colher o músculo soleus, fixe o membro traseiro com o músculo gastrocnemius voltado para cima. Use uma tesoura fina para cortar o tendão distal do grupo muscular gastrocnemius/soleus.
Corte a fáscia de ambos os lados do músculo gastrocnemius para permitir que os músculos sejam levantados suavemente e lentamente longe do osso. Em seguida, liberte o tendão proximal do músculo soleus. Fixar o grupo muscular contendo o músculo gastrocnemius e o tendão distal no prato.
Levante o músculo soleus suavemente através do tendão proximal para separá-lo do músculo gastrocnemius, deixando o máximo do tendão distal soleus intacto possível. Para colher o extensor digitorum longus ou músculo EDL, fixe o membro traseiro no prato com o músculo tíibal anterior voltado para cima e corte a fáscia ao longo do músculo tibialis anterior. Use fórceps para puxar a fáscia clara e cortar o tendão distal do músculo tibialis anterior.
Levante o músculo anterior tibialis e corte-o cuidadosamente sem puxar o músculo EDL, e corte o lado lateral do joelho para expor os dois tendões. Corte o tendão proximal, deixando-nos muito do tendão possível ainda ligado ao músculo e puxe suavemente o tendão para levantar o músculo EDL. Em seguida, corte o tendão distal uma vez que ele é exposto.
Para montar o músculo colhido, fixe o músculo através dos tendões e corte o máximo possível de gordura extra, fáscia e tendão. Insira um tendão em um nó pré-amarrado e use fórceps de amarrar sutura para amarrar a sutura firmemente. Amarre o segundo nó ao redor do gancho de metal e repita o procedimento na outra extremidade do tendão.
Em seguida, conecte o gancho curto à parte inferior da câmara experimental, e o gancho longo ao motor transdutor de força de modo duplo. Bolha a solução na câmara experimental com 100% de oxigênio. Para otimizar o protocolo de estimulação e o comprimento muscular ajuste os micro manipuladores ligados ao motor transdutor para gerar uma tensão de linha de base entre 15 a 20 milnewtons para encontrar os melhores parâmetros de estímulo para esticar o músculo.
Coloque a tensão de estimulação em 40 volts. A corrente de estimulação será sistematicamente aumentada até que não haja aumento adicional na força do contração. Para encontrar o comprimento ideal, aumente o comprimento muscular e ative o músculo com uma única contração até que a força ativa pare de aumentar.
Realize uma contração tetanica de um segundo para testar a montagem e esticar o músculo de volta para a força de base ideal, conforme necessário. Em seguida, registo o comprimento muscular em milímetros com uma pinça digital. Para determinar a posição do feixe, use um pedaço de papel sensível ao raio-X que produz uma mancha escura em resposta aos raios-X e um gerador de mira de vídeo para criar uma mira alinhada com a marca de queimadura no papel.
Usando a interface gráfica de usuário fornecida pelo BioCAT para o posicionador de amostra, centralizar o músculo na posição do feixe e mover o estágio da amostra para oscilar a câmara amostral a 10 a 20 milímetros por segundo para espalhar a dose de raios-X por todo o músculo durante a exposição. Observe a amostra enquanto se move para evitar grandes regiões de fáscia que contêm colágeno e para garantir que ela permaneça iluminada durante todo o trajeto de sua viagem. Armar o detector e esperar o gatilho do sistema de aquisição de dados.
Em seguida, acione os dados mecânicos e de raios-X ao mesmo tempo para sincronizá-los. Os padrões de raios-X serão coletados continuamente ao longo do protocolo com um tempo de exposição de 10 milissegundos e um período de exposição de 50 milissegundos. Nesta contração tetanica isométrica representativa, o músculo EDL ficou em repouso por 0,5 segundos antes de ser ativado por um segundo, seguido por um relaxamento de 1,5 segundos.
O padrão de difração de raios-X muscular pode dar informações estruturais de resolução de nanômetros de estruturas dentro do sarcomere. Linhas de camada baseadas em miosina contendo filamentos grossos são fortes e afiadas em padrões de músculo de repouso, enquanto linhas de camada baseadas em actina contendo filamentos finos são mais proeminentes em padrões de contrair músculos. Padrões de diferença obtidos subtraindo o padrão de repouso do padrão de contração podem lançar luz sobre mudanças estruturais durante o desenvolvimento da força em músculos saudáveis e doentes.
Seguindo essas mudanças estruturais na escala de tempo de milissegundos dos eventos moleculares durante a contração muscular e relaxamento, os padrões de difração de raios-X podem revelar informações estruturais substanciais. Nesta análise representativa de reflexões equatoriais utilizando a rotina do Equador no pacote MuscleX de código aberto, a razão de intensidade equatorial indica a proximidade da mosina para atuar no músculo de repouso e está intimamente correlacionada com o número de pontes cruzadas anexadas na contração do músculo esquelético murino. A distância entre os dois 1,0 reflexo está inversamente relacionada ao espaçamento do cruzamento.
Uma dissecção limpa é a chave para um experimento de raio-X muscular intacto bem sucedido, então tente evitar qualquer dano mecânico durante a preparação muscular. Qualquer protocolo fisiológico padrão com músculos inteiros pode ser implementado nesses experimentos e pode ser usado para estudar a ativação muscular, relaxamento e comportamento de ponte cruzada durante a transitoriedade mecânica rápida. A manipulação genética de ratos está se tornando cada vez mais sofisticada.
Novos modelos de camundongos transgênicos permitirão que experimentos mais específicos e perspicazes sejam projetados para indicar novas direções terapêuticas para miopatias humanas.
Visão Geral
Este artigo apresenta protocolos para a realização de experimentos de difração de raios X em ângulo pequeno em músculos esqueléticos intactos de camundongos. O método fornece informações sobre a base estrutural das doenças musculares genéticas, aproveitando a disponibilidade de modelos transgênicos de camundongos.
Principais Componentes do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biofísica
- Fisiologia Muscular
Antecedentes
- A difração de raios X oferece informações estruturais de alta resolução a partir de tecido muscular vivo.
- O entendimento das doenças musculares pode se beneficiar dos conhecimentos obtidos por meio da análise estrutural.
- Modelos de camundongos transgênicos estão cada vez mais disponíveis para o estudo de miopatias.
- Músculos específicos, como o extensor longo dos dedos e o sóleo, são adequados para esses experimentos.
Objetivo do Estudo
- Elucidar as alterações estruturais no músculo durante a contração e o relaxamento.
- Fornecer uma plataforma para estudar os mecanismos das doenças musculares herdadas.
- Indicar estratégias terapêuticas potenciais com base em informações estruturais.
Métodos Utilizados
- Coleta de músculos esqueléticos intactos de camundongos.
- Preparação de experimentos de difração de raios X em condições fisiológicas.
- Uso de um transdutor de força bimodal para estimulação muscular.
- Coleta de padrões de raios X para analisar alterações estruturais na escala de nanômetros.
Resultados Principais
- Os padrões de difração de raios X revelam informações estruturais sobre os sarcômeros.
- As diferenças nos padrões entre músculos em repouso e em contração fornecem insights sobre o desenvolvimento da força.
- As alterações estruturais podem ser monitoradas em escalas de tempo de milissegundos durante a atividade muscular.
- Os achados contribuem para a compreensão da função muscular e dos mecanismos de doenças.
Conclusões
- O estudo demonstra a utilidade da difração de raios X na pesquisa muscular.
- Os conhecimentos obtidos podem orientar abordagens terapêuticas para doenças musculares.
- Este método aprimora nossa compreensão da fisiologia e da patologia musculares.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A difração de raios X de músculo esquelético murino intacto permite a análise estrutural em escala nanométrica sob condições fisiológicas, estabelecendo uma ligação direta entre genótipo e fenótipo funcional em modelos de doenças musculares. Esta abordagem apoia a validação de alvos ao revelar alterações estruturais sarcoméricas durante o desenvolvimento da força, oferecendo desvio mecanicista para estratégias terapêuticas em miopatias herdadas. O método aumenta a confiança preditiva em modelos pré-clínicos ao quantificar o espaçamento interfilamentos e a dinâmica das pontes cruzadas em escalas de tempo milissegundo.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Investiga hipóteses terapêuticas ao relacionar modificações genéticas com alterações estruturais sarcoméricas em músculo intacto.
- Valor Operacional: Permite a validação funcional de alvos por meio de leituras estruturais em tempo real das interações miosina-actina durante a contração.
- Valor Científico: Reforça a confiança preditiva ao quantificar as correlações estruturais da ligação das pontes cruzadas e do espaçamento entre filamentos.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Prepara sistemas biológicos validados para fluxos de trabalho posteriores, preservando a arquitetura e a fisiologia musculares nativas.
- Valor Operacional: Aborda a padronização e reprodutibilidade de ensaios por meio de protocolos de estimulação controlados e coleta sincronizada de dados de raios X.
- Valor Científico: Destaca a prontidão para triagem por meio de saídas estruturais quantitativas, como as razões de intensidade equatorial e análises de linhas em camadas.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Discute a relevância para doenças ao associar alterações estruturais em modelos transgênicos aos mecanismos de miopatia humana.
- Valor Operacional: Descreve a continuidade do descobrimento até a validação pré-clínica, permitindo o monitoramento estrutural longitudinal.
- Valor Científico: Aborda decisões de avanço ajustadas ao risco mediante a identificação de biomarcadores estruturais da progressão da doença.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra ao continuum de descoberta, desde a validação do alvo até a validação pré-clínica, fornecendo fenotipagem estrutural da função muscular em condições fisiológicas.
- Biologia da Descoberta: Explica como o método apoia o teste de hipóteses, a clarificação de vias e a redução de riscos biológicos por meio da análise estrutural da dinâmica do sarcômero.
- Triagem: Descreve a prontidão do ensaio, a reprodutibilidade e as saídas quantitativas por meio da aquisição sincronizada de dados mecânicos e de raios X.
- Análises: Destaca as medições, leituras ou saídas estatísticas que ajudam as equipes a comparar condições, incluindo as razões de intensidade equatorial e o espaçamento das reflexões.
- Pesquisa Translacional: Relaciona o método com a continuidade pré-clínica ou o alinhamento de biomarcadores por meio do acompanhamento de alterações estruturais em modelos de doenças.
- Reutilização Corporativa: Apresenta o método como uma capacidade reutilizável, e não como uma técnica de uso único, por meio de protocolos padronizados de montagem e estimulação.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva, validação de alvos e redução da ambiguidade mecanicista.
- Valor Operacional: Padronização, reprodutibilidade e escalabilidade.
- Valor Estratégico: Decisões de avanço ou interrupção mais precisas, eficiência do capital e redução de riscos biológicos em estágios avançados.
- Impacto no Portfólio: Priorização e decisões de avanço ajustadas ao risco.
Considerações sobre a Implementação
- Expertise científica necessária em fisiologia muscular, difração de raios X e manipulação de modelos transgênicos.
- Necessidades de instrumentação e infraestrutura analítica, incluindo linhas de luz de sincrotrons, transdutores de força em modo dual e sistemas sincronizados de aquisição de dados.
- Requisitos de padronização entre equipes para protocolos de dissecação, montagem e estimulação muscular em diferentes laboratórios.
- Considerações de adaptação entre sistemas modelo, particularmente para diferentes músculos murinos e modelos de doenças.
- Limitações práticas apoiadas pelo material de origem, incluindo a necessidade de dissecação cuidadosa para evitar contaminação por fáscia e manter a integridade da amostra durante a exposição.
