Difração de raios X do músculo esquelético murino intacto como uma ferramenta para estudar a base estrutural da doença muscular

O músculo esquelético fisiologicamente intacto do camundongo pode produzir padrões de difração de raios-X de alta qualidade contendo muitas informações estruturais que podem fornecer insights sobre processos fisiológicos. A difração de raios-X é a única técnica que permite a aquisição de informações estruturais de alta resolução do tecido muscular vivo em condições fisiológicas reais em tempo fisiológico real. Muitas doenças musculares são herdadas.

Com o aumento da disponibilidade para modificar geneticamente a maioria dos modelos de miopatias, a difração de raios-X pode fornecer insights estruturais em mecanismos de doença e indicar estratégias terapêuticas. A maioria dos músculos extensor digitorum longus e soleus são particularmente convenientes para este fim. Mas muitos outros músculos em animais pequenos podem ser dissecados intactos e manuseados de forma semelhante.

Antes de iniciar o procedimento, ligue o transdutor combinado de força motora, o controlador transdutor de força motor com um estimulador de corrente bifásica de alta potência, e um sistema de controle de aquisição de dados de controle de computador. Em seguida, pulverize a pele no membro traseiro do mouse com solução fria de Ringer e use uma tesoura de dissecção fina para cortar a pele ao redor da coxa. Usando fórceps número cinco, puxe rapidamente a pele para baixo para expor os músculos e amputar o membro traseiro.

Coloque o membro em um prato de dissecação revestido de elastômero contendo a solução de Ringer oxigenado e coloque o prato sob um microscópio de dissecação binóculo. Para colher o músculo soleus, fixe o membro traseiro com o músculo gastrocnemius voltado para cima. Use uma tesoura fina para cortar o tendão distal do grupo muscular gastrocnemius/soleus.

Corte a fáscia de ambos os lados do músculo gastrocnemius para permitir que os músculos sejam levantados suavemente e lentamente longe do osso. Em seguida, liberte o tendão proximal do músculo soleus. Fixar o grupo muscular contendo o músculo gastrocnemius e o tendão distal no prato.

Levante o músculo soleus suavemente através do tendão proximal para separá-lo do músculo gastrocnemius, deixando o máximo do tendão distal soleus intacto possível. Para colher o extensor digitorum longus ou músculo EDL, fixe o membro traseiro no prato com o músculo tíibal anterior voltado para cima e corte a fáscia ao longo do músculo tibialis anterior. Use fórceps para puxar a fáscia clara e cortar o tendão distal do músculo tibialis anterior.

Levante o músculo anterior tibialis e corte-o cuidadosamente sem puxar o músculo EDL, e corte o lado lateral do joelho para expor os dois tendões. Corte o tendão proximal, deixando-nos muito do tendão possível ainda ligado ao músculo e puxe suavemente o tendão para levantar o músculo EDL. Em seguida, corte o tendão distal uma vez que ele é exposto.

Para montar o músculo colhido, fixe o músculo através dos tendões e corte o máximo possível de gordura extra, fáscia e tendão. Insira um tendão em um nó pré-amarrado e use fórceps de amarrar sutura para amarrar a sutura firmemente. Amarre o segundo nó ao redor do gancho de metal e repita o procedimento na outra extremidade do tendão.

Em seguida, conecte o gancho curto à parte inferior da câmara experimental, e o gancho longo ao motor transdutor de força de modo duplo. Bolha a solução na câmara experimental com 100% de oxigênio. Para otimizar o protocolo de estimulação e o comprimento muscular ajuste os micro manipuladores ligados ao motor transdutor para gerar uma tensão de linha de base entre 15 a 20 milnewtons para encontrar os melhores parâmetros de estímulo para esticar o músculo.

Coloque a tensão de estimulação em 40 volts. A corrente de estimulação será sistematicamente aumentada até que não haja aumento adicional na força do contração. Para encontrar o comprimento ideal, aumente o comprimento muscular e ative o músculo com uma única contração até que a força ativa pare de aumentar.

Realize uma contração tetanica de um segundo para testar a montagem e esticar o músculo de volta para a força de base ideal, conforme necessário. Em seguida, registo o comprimento muscular em milímetros com uma pinça digital. Para determinar a posição do feixe, use um pedaço de papel sensível ao raio-X que produz uma mancha escura em resposta aos raios-X e um gerador de mira de vídeo para criar uma mira alinhada com a marca de queimadura no papel.

Usando a interface gráfica de usuário fornecida pelo BioCAT para o posicionador de amostra, centralizar o músculo na posição do feixe e mover o estágio da amostra para oscilar a câmara amostral a 10 a 20 milímetros por segundo para espalhar a dose de raios-X por todo o músculo durante a exposição. Observe a amostra enquanto se move para evitar grandes regiões de fáscia que contêm colágeno e para garantir que ela permaneça iluminada durante todo o trajeto de sua viagem. Armar o detector e esperar o gatilho do sistema de aquisição de dados.

Em seguida, acione os dados mecânicos e de raios-X ao mesmo tempo para sincronizá-los. Os padrões de raios-X serão coletados continuamente ao longo do protocolo com um tempo de exposição de 10 milissegundos e um período de exposição de 50 milissegundos. Nesta contração tetanica isométrica representativa, o músculo EDL ficou em repouso por 0,5 segundos antes de ser ativado por um segundo, seguido por um relaxamento de 1,5 segundos.

O padrão de difração de raios-X muscular pode dar informações estruturais de resolução de nanômetros de estruturas dentro do sarcomere. Linhas de camada baseadas em miosina contendo filamentos grossos são fortes e afiadas em padrões de músculo de repouso, enquanto linhas de camada baseadas em actina contendo filamentos finos são mais proeminentes em padrões de contrair músculos. Padrões de diferença obtidos subtraindo o padrão de repouso do padrão de contração podem lançar luz sobre mudanças estruturais durante o desenvolvimento da força em músculos saudáveis e doentes.

Seguindo essas mudanças estruturais na escala de tempo de milissegundos dos eventos moleculares durante a contração muscular e relaxamento, os padrões de difração de raios-X podem revelar informações estruturais substanciais. Nesta análise representativa de reflexões equatoriais utilizando a rotina do Equador no pacote MuscleX de código aberto, a razão de intensidade equatorial indica a proximidade da mosina para atuar no músculo de repouso e está intimamente correlacionada com o número de pontes cruzadas anexadas na contração do músculo esquelético murino. A distância entre os dois 1,0 reflexo está inversamente relacionada ao espaçamento do cruzamento.

Uma dissecção limpa é a chave para um experimento de raio-X muscular intacto bem sucedido, então tente evitar qualquer dano mecânico durante a preparação muscular. Qualquer protocolo fisiológico padrão com músculos inteiros pode ser implementado nesses experimentos e pode ser usado para estudar a ativação muscular, relaxamento e comportamento de ponte cruzada durante a transitoriedade mecânica rápida. A manipulação genética de ratos está se tornando cada vez mais sofisticada.

Novos modelos de camundongos transgênicos permitirão que experimentos mais específicos e perspicazes sejam projetados para indicar novas direções terapêuticas para miopatias humanas.