Name: Um sistema de entrega e recuperação de patógenos precisos para modelos murinos de pneumonia bacteriana secundária (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 s
Description: Aprenda um método não invasivo de inoculação bacteriana no trato respiratório inferior de camundongos para estudar pneumonia bacteriana secundária. Esta técnica permite a recuperação de unidades formadoras de colônias e RNA para análise de transcritos.

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Os autores agradecem a Nicole Meissner, M.D./Ph.D., Universidade Estadual de Montana, por sua ajuda no estabelecimento do método de instilação intratraqueal. Este trabalho foi apoiado pelos institutos nacionais de saúde dos EUA (subvenções NIH-1R56AI135039-01A1, GM110732, R21AI128295, U54GM115371), bem como fundos da iniciativa de pesquisa de sistemas da Universidade de Montana (51040-MUSRI2015-03) e da Universidade Estadual de Montana Estação experimental da agricultura.

Todos os métodos estão em conformidade com as diretrizes dos institutos nacionais de saúde e foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais (IACUC) na Universidade Estadual de Montana.
1. instilação intratraqueal
<ol><li>Prepare um espaço de trabalho contendo os seguintes suprimentos: uma plataforma de intubação, uma seringa estéril de 1 mL, pinça estéril com ponta sem corte, agulha estéril de 21 gauge e dois tubos cônicos para armazenar a seringa e o fórceps. Nota: as plataformas de intubação podem ser adquiridas comercialmente ou construídas em casa. A plataforma da intubação usada aqui foi construída usando o plexiglass de 0,25 polegadas. Momentaneamente, o calor foi aplicado ao plexiglass e a placa é dobrada a um ângulo interior aproximado de 65 °. No lado exterior da plataforma da intubação, dois parafusos da máquina foram semeados 3 polegadas distante e uma borracha-faixa foi suspendida entre os dois parafusos.</li>
	<li>Prepare o iníbulo do patógeno por serialmente diluindo a amostra para que a concentração final desejada seja obtida em um volume total de 50 μL. Guarde o iníbulo no gelo.</li>
	<li>Vestindo luvas estéreis, dobre uma agulha de 21 G Blunt-derrubado a aproximadamente 35 °. Nota: é necessária uma agulha separada para cada rato.</li>
	<li>Fixe a agulha com ponta romba de 21 G dobrada a uma seringa de 1 mL. Desenhe uma almofada de ar de 100 μL na seringa seguida de 50 μL do agente infeccioso. Coloque a agulha e a seringa carregadas numa localização facilmente acessível pela mão dominante.</li>
	<li>Anestesie profundamente um rato usando uma mistura de isoflurano/oxigênio a 4% ou um método de anestesia similar aprovado pelo IACUC. A profundidade apropriada da anestesia é obtida tipicamente quando as taxas da respiração retardam a aproximadamente 1 inalação por 5 – 8 s e podem ser confirmadas apertando um apêndice e não observando nenhuma reação do rato. Nota: Este método de anestesia proporcionou uma duração de anestesização suficiente de aproximadamente 1,5 min. Isto foi suficiente para que os membros do nosso laboratório aprendessem e realizem este procedimento de instilação; Entretanto, outrosmétodos de anestesiainstitucionalmente aprovados podem ser empregados11,12,13.</li>
	<li>Retire o rato anestesiado da câmara de anestesia e suspenda o rato na plataforma de intubação dos incisivos superiores.</li>
	<li>Para abrir uma passagem desobstruída na traquéia, use o fórceps Blunt-derrubado para agarrar delicadamente e estender a lingüeta fora da boca. Transfira a língua da pinça para o polegar e o dedo indicador da mão não dominante.</li>
	<li>Permaneça segurando a língua na mão não dominante e pegue a seringa pré-carregada. Aponte a extremidade dobrada da agulha para longe do corpo e insira a agulha na cavidade oral na base da língua.</li>
	<li>Com a agulha na base da língua, suavemente o ângulo do pulso para causar um ligeiro impulso da agulha longe do corpo. Este passo assegura que a agulha será inserida na traquéia e não no esôfago.</li>
	<li>Lentamente guiar a agulha para baixo na traquéia; muitas vezes um ligeiro carrapato é sentida como a agulha passa através da prega vocal. Passe a agulha pela traquéia até que a resistência leve seja sentida à medida que a agulha encontra a Carina.</li>
	<li>Levante ligeiramente a agulha na direção proximal para suspender a agulha acima da Carina. Isto permite a entrega nos dois brônquios primários. Pressione totalmente o êmbolo da seringa para entregar a carga infecciosa. Retire a agulha da traquéia levantando para cima e descarte.</li>
	<li>Retire o mouse da plataforma de intubação pressionando a faixa de borracha, mas mantenha segurando o mouse em uma posição vertical. Obstrua as vias respiratórias nasais colocando um dedo diretamente sobre as Nares. Segure esta posição por aproximadamente 1 min ou até que várias respires profundas sejam observadas. Nota: esta última etapa assegura-se de que o volume total do inônio esteja entregado no intervalo respiratório mais baixo.</li>
	<li>Retorne o rato a sua gaiola e observe uma recuperação completa da anestesia.</li>
</ol>2. excisão de pulmões infectados
<ol><li>Trabalhando dentro de um exaustor do fluxo laminar para manter a esterilidade, prepare um espaço de trabalho com os seguintes artigos: uma escala e um barco estéril do pesar, uma plataforma da dissecção, um jogo da dissecção que contem tesouras e fórceps, PBS RNAse-livre estéril, e gaze estéril.</li>
	<li>Eutanizar um rato infectado com CO2 ou similar IACUC método aprovado de eutanásia.</li>
	<li>Coloque um mouse infectado em uma plataforma de dissecção e fixe o mouse usando pinos no final de cada apêndice. Pulverize o rato com etanol para ajudar a manter a esterilidade das superfícies de trabalho.</li>
	<li>Começando no umbigo, use um par de fórceps para levantar a pele e fazer uma incisão até a base da traquéia. Agarrando a pele em ambos os lados da incisão inicial, puxe a pele para longe do corpo e corte através das conexões do tecido. Nota: pode ser útil fazer diversos cortes laterais através da pele para revelar mais da região torácica.</li>
	<li>A partir da base do processo xifóide, faça uma pequena incisão com a intenção de perfurar o diafragma. Isso resulta em um aumento na pressão na cavidade torácica que faz com que os pulmões para retrair. Com os pulmões retraído continuar a incisão para libertar o diafragma.</li>
	<li>Retire as costelas fazendo uma incisão ao longo de ambos os lados da caixa torácica. Isto irá expor totalmente a cavidade torácica e os pulmões.</li>
	<li>Para extirpar os pulmões, segure a base do coração com o fórceps e levante para cima. Coloc a tesoura atrás dos pulmões e comece a fazer incisões pequenas através das conexões do tecido ao continuar ao elevador o coração para cima.</li>
	<li>Uma vez que os pulmões foram extirpado, coloque-os sobre a gaze estéril e retire o coração. O coração pode facilmente ser removido levantando o afastado dos pulmões com o fórceps e cortando as conexões restantes do tecido.</li>
	<li>Transfira os pulmões para um barco de pesagem pré-encerado e registre o peso.</li>
	<li>Após os pulmões terem sido pesados, transfira-os para solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS) e armazene-os temporariamente no gelo até avançar para as etapas de recuperação e análise do patógeno.</li>
</ol>3. análise e recuperação de patógenos
<ol><li>Continuando a trabalhar dentro de uma capa de fluxo laminar, prepare um espaço de trabalho com as seguintes fontes: um moedor do tecido, PBS RNAse-livre estéril, tampão RLT suplementado com o ß-mercaptoethanol (1:100), e os tubos RNAse-livres do microcentrifugador de 1,5 mL. PRECAUÇÃO: o ß-Mercaptoetanol pode ser perigoso no caso de contacto com a pele, ingestão, contacto com os olhos ou inalação. A diluição do ß-Mercaptoetanol no tampão RLT deve ser feita em uma capa das emanações.</li>
	<li>Comece adicionando primeiramente 1 mL de PBS RNAse-livre estéril ao moedor do tecido. Uma vez preenchido, guarde o moedor de tecido no gelo.</li>
	<li>Prepare uma série de tubos de diluição de série RNAse-livres estéreis que serão usados para quantificar a carga bacteriana recuperada dos pulmões contaminados. Isto é conseguido mais facilmente alicitando 900 μL da água estéril em cada tubo do microcentrifugador seguido pela diluição de série do iníbulo do micróbio patogénico. Nota: o número de tubos de diluição necessários para a enumeração precisa do patógeno variará na entrada do patógeno inicial e na duração da infecção. Isto deve ser empiricamente determinado.</li>
	<li>Usando o fórceps estéril, transfira os pulmões no moedor preparado do tecido e Homogeneize completamente o tecido pressionando para baixo no suporte ao girar.</li>
	<li>Abra o moedor de tecido e a alíquota 100 μL da amostra homogeneizada no primeiro dos tubos de diluição série preparados. Serialmente diluir as amostras e enumerar CFUs por chapeamento no ágar nutriente. O CFUs pode ser registrado como CFUs/mL ou CFUs/mL/mg de tecido pulmonar. Nota: nesta etapa um adicional 200 μL da amostra homogeneizada pode ser removido para a purificação do RNA viral (veja a tabela de materiais) ou armazenado em-80 ° c para a análise futura.</li>
	<li>Depois que as alíquotas foram removidas para a determinação de CFU e/ou o isolamento viral do RNA, substitua o suporte de moedura e pellet o tecido homogeneizado pela centrifugação em 4.000 rpm (3724 x g) por 10 minutos em 4 ° c.</li>
	<li>Usando uma pipeta, retire o sobrenadante da amostra peletizada e coloque-o em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Nota: o sobrenadante está livre de bactérias e pode ser armazenado em-80 ° c para análise de hospedeiro solúvel e fatores de patógenos secretados.</li>
	<li>Ressuscitar o pellet tecido homogeneizado por pipetagem ou vortexing em 700 μL de tampão RLT-ß-Mercaptoetanol e transferir a amostra para um tubo de microcentrífuga estéril 1,5 mL RNAse-livre. Nota: neste ponto, as amostras podem ser armazenadas em-80 ° c durante vários meses.</li>
	<li>Purify o RNA usando modificações ligeiras ao protocolo do fabricante de um jogo da purificação (veja a tabela de materiais); Ver Voyich et al. 200814.<ol>
<li>Transfira a pasta pulmonar homogeneizada para um tubo de microcentrífuga de 2 mL contendo grânulos de sílica de 0,1 mm e processados através de um batedor de esferas por 20 s a 6 m/s.</li>
		<li>Centrifugue a amostra em 1.500 RPM por 3 minutos. Após a centrifugação, pipeta o sobrenadante em novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.</li>
		<li>Adicione 350 μL de 96% – 100% de etanol à amostra e misture completamente com pipetagem ou inversão.</li>
		<li>Transferir 700 μL da amostra para uma coluna de purificação colocada num tubo de recolha de 2 mL. Centrifugue a amostra a ≥ 8.000 x g por 15 s e descarte o fluxo. Execute qualquer amostra em excesso pela mesma coluna descrita acima.</li>
		<li>Lave a coluna com 700 μL de tampão RW1 e Centrifugue a amostra a ≥ 8.000 x g durante 15 s. elimine o fluxo e transfira a coluna de membrana de sílica para um novo tubo de recolha de 2 ml.</li>
		<li>Aplique 500 μL do buffer RPE à coluna. Lave a coluna por centrifugação a ≥ 8.000 x g durante 15 s. descarte o fluxo.</li>
		<li>Aplique um adicional de 500 μL de tampão RPE na coluna RNeasy e Centrifugue a 8.000 x g durante 2 min. descarte o fluxo e Centrifugue a coluna a ≥ 10.000 x g durante 1 min.</li>
		<li>Para Eluir o RNA purified, comece transferindo a coluna a um tubo novo do microcentrifugador de 1,5 ml RNase-livre. Pipetar 50 μL de água RNase-Free directamente sobre a membrana de sílica-gel da coluna e centrifugar a ≥ 8000 x g durante 1 min. Nota: o RNA eluída pode ser funcionado sobre a mesma coluna outra vez para aumentar o rendimento do RNA.</li>
		<li>Adicionar 50 μL de água livre de RNase ao RNA purificado para trazer o volume total para 100 μL. alíquota 350 μL de RLT-ß-Mercaptoetanol seguido de 250 μL de 96% – 100% de etanol para a amostra e misture cuidadosamente por pipetagem ou inversão.</li>
		<li>Aplique a amostra numa coluna de purificação colocada num tubo de recolha e Centrifugue a ≥ 8000 x g durante 15 s. elimine o fluxo e substitua o tubo de recolha.</li>
		<li>Lave a coluna adicionando 350 μL de tampão RW1 seguido de centrifugação a ≥ 8000 x g por 15 s.</li>
		<li>Prepare uma solução de DNase contendo aproximadamente 27 unidades Kunitz adicionando 10 μL de estoque de DNase (750 unidades Kunitz/mL) a 70 μL de RDD de buffer. Adicionar 80 μL de solução de DNase directamente sobre a membrana de sílica-gel e incubar a amostra durante 15 min à temperatura ambiente.</li>
		<li>Lave a coluna com 350 μL de tampão RW1 e Centrifugue a ≥ 8000 x g durante 15 s e elimine o fluxo.</li>
		<li>Repita os passos 3.9.6 – 3.9.8 para purificar o RNA. Nota: recomenda-se repetir o procedimento de limpeza do RNA seguindo os passos 3.9.9 – 3.9.10 e 3.9.6 – 3.9.8 (saltar DNase Steps 3.9.11 – 3.9.13). Esta limpeza adicional resulta em RNA de alta qualidade.</li>
	</ol></li>
	<li>O rendimento de RNA pode ser quantificado usando um espectrofotômetro com leituras a 260 nM para determinar a concentração e 260:280 nM para a pureza. Após a obtenção do rendimento de RNA, padronize a concentração de cada amostra de RNA para 50 ng/μL. Nota: recomenda-se fazer alíquotas múltiplas em uma concentração de 50 ng/μL para evitar ciclos de congelamento/descongelação que podem levar à degradação do RNA.</li>
	<li>Armazene o RNA purificado em-80 ° c ou use-o imediatamente para a análise do transcrito. Nota: em publicações anteriores, o RNA de 3 a 5 camundongos foi agrupada para análise de transcrição. Através da otimização da técnica acima, o RNA de 1 rato foi empiricamente determinado como suficiente para a análise de transcrição (80 – 120 ng/μL).</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O uso deste modelo fornece um método altamente eficiente e reprodutível para estudar infecções bacterianas secundárias. A habilidade de controlar firmemente a entrega do inóculos do micróbio patogénico permite umas observações mais precisas dos efeitos individuais e combinatória de cada micróbio patogénico. As ineficiências na via de instilação intranasal mais comum provavelmente contribuíram para as discrepâncias nos volumes de dose e nas concentrações presentes na literatura. É razoável que a falta de um sistema murino preciso para estudar pneumonia bacteriana secundária tenha atrasado os achados identificando respostas bacterianas específicas que contribuem para a severidade das coinfecções pulmonares. Desenvolver um modelo reprodutível para estudar a expressão da virulência durante infecções bacterianas secundárias poderia conduzir à identificação de alvos da vacina ou da droga para amenizar estas infecções.
A etapa intratraqueal da instilação é crítica para estabelecer com sucesso uma infecção mais baixa do intervalo respiratório e toda a análise do baixo-córrego dos micróbios patogénicos. Ao aprender esta técnica, pode ser útil praticar usando um corante (como descrito nos métodos) antes de administrar o material infeccioso. Usar um corante permite a visualização direta do inuso no trato respiratório. Um erro comum que possa ocorrer é a inserção da Blunt-agulha no esófago um pouco do que a traqueia. Isso resultará na entrega do inóculo no estômago, em vez dos pulmões. Para corrigir este erro, o ângulo da agulha mais longe do corpo e passá-lo para baixo na traquéia. Uma vez dominado, este procedimento é muito eficiente e pode ser usado para realizar experimentos com um grande número de ratos. Trabalhando em lotes para anestesiar camundongos, a instilação intratraqueal pode ser concluída em aproximadamente 30 segundos por mouse. Além disso, a excisão dos pulmões pode ser concluída em 2 a 3 minutos por mouse.
A recuperação do RNA bacteriano viável e puro dos tecidos contaminados é crítica para a análise do transcrito. Os RNases são onipresentes e podem arruinar rapidamente um experimento15. Alguns métodos incluem o uso de inibidores de RNase; no entanto, descobrimos que o congelamento da amostra em-80 ° c em RLT-ß-Mercaptoetanol ou imediatamente o processamento da amostra para isolamento de RNA usando todos os tubos livres RNase e reagentes são eficazes na redução da contaminação por RNase. Adicionalmente, nós recomendamos que um máximo de seis amostras seja purificada ao mesmo tempo. Incluir mais de seis amostras pode resultar em latências prolongadas entre as etapas do protocolo que podem culminar na degradação do RNA. Uma vez purificada, o cuidado também deve ser tomado para evitar quaisquer ciclos de congelamento-Thaw desnecessários. Assim, se as análises múltiplas serão feitas em uma amostra, alicitando o RNA purified para o armazenamento em-80 ° c é recomendado.
Além das técnicas aqui revisadas, este método pode ser complementado pela realização de lavagem alveolar brônquica antes da excisão e homogeneização dos pulmões16. Isto pode ser conseguido pelo lavagem do intervalo respiratório mais baixo inteiro ou usando a linha da sutura para restringir um braço ramificando da árvore brônquica seguida pelo lavagem através da filial restante. Frequentemente isto conduz a uma redução na recuperação da carga do micróbio patogénico mas fornece uma amostra whereupon a informação tal como a atividade do desidrogenase do lactato, a identidade celular da população, e os perfis do citocinas podem ser obtidos16. Juntos, esses dados podem formar uma compreensão mais completa das interações do patógeno hospedeiro ocorridas durante a pneumonia bacteriana secundária.
Quando os métodos discutidos estiveram dentro do contexto da pneumonia bacteriana secundária, são apropriados ser estendidos a todo o modelo murino de uma mais baixa infecção respiratória; especificamente, aqueles que se beneficiariam da entrega e da recuperação firmemente controladas do inóculos instalado. Além disso, como muitas outras vias de infecção, a instilação intratraqueal pode ser utilizada em aplicações não infecciosas, como a administração de terapêutica e compostos ambientais12.

A pneumonia bacteriana secundária após a infecção por influenza é uma das principais causas de morte nos Estados Unidos e uma área ativa de pesquisa1,2. Apesar de inúmeros estudos utilizando modelos murinos de pneumonia bacteriana secundária, as inconsistências quanto à instilação e interrogação do patógeno permanecem3,4,5. Além disso, embora muitos esforços anteriores tenham se concentrado nos efeitos imunomoduladores da gripe que levam a um aumento da infecção bacteriana de forma susceptivelmente secundária, dados mais recentes sugerem que a regulação da virulência do patógeno bacteriano é igual contribuinte para o estabelecimento da doença6,7,8,9. Esses novos dados necessitam de um método mais preciso para explorar a pneumonia bacteriana secundária em modelos murinos de co-infecção que facilitam a investigação sobre a resposta do patógeno.
Original aos modelos da co-infecção da gripe, os organismos do anfitrião são imunocomprometidos intencionalmente por uma infecção preliminar da gripe antes da administração do agente bacteriano secundário. A fim replicar melhor a patogénese da doença observada em anfitriões humanos, é imperativo que a carga do micróbio patogénico de ambos os agentes preliminares e secundários esteja controlada para observar os efeitos individuais e combinatória de cada agente infeccioso. Mais comumente, as infecções respiratórias em camundongos foram estabelecidas através de uma administração intranasal3,4,5,6,10. Na medida em que esta rota é notável por ser tecnicamente simples e pode ser adequada em algumas aplicações de infecção de agente único, é inadequado para modelos de coinfecção, como procedimentos de instilação, volumes de dose e eficácia são altamente variáveis dentro literatura publicada3,4,5,6.
Para obter uma compreensão mais completa da patogénese bacteriana secundária da pneumonia, as contribuições do anfitrião e do micróbio patogénico devem ser consideradas. Para esse fim, nós desenvolvemos uma aproximação direta e reprodutível para a recuperação de bactérias viáveis e do RNA do micróbio patogénico dos pulmões contaminados. Este método usa um procedimento de instilação intratraqueal simplificado, não invasor seguido pelo isolamento subseqüente do RNA bacteriano. O procedimento de instilação intratraqueal aqui descrito é semelhante aos métodos previamente descritos e não se limita à entrega do patógeno11,12,13. O uso deste procedimento particular beneficia-se de ser de baixo custo e não exige o uso de equipamento especializado tal como cânulas, fios de guia, ou cabo da fibra óptica; Além disso, porque este procedimento é não-invasor assegura o esforço mínimo em assuntos murino, minimiza uma resposta inflamatório da mecânica da inoculação, e fornece uma rota eficiente da entrega para a infecção de assuntos múltiplos. Brevemente, os camundongos anestesiados com isoflurano são suspensos dos incisivos. Os fórceps são usados para agarrar delicadamente a lingüeta seguida pela inserção de um dobrado pre-loaded, Blunt-derrubado, agulha do calibre 21 na traquéia e na entrega da carga do micróbio patogénico. A validação deste procedimento é demonstrada pela confirmação visual da tintura distribuída ingualmente no compartimento pulmonar e pela recuperação da carga bacteriana. Nós demonstramos então como recuperar o Staphylococcus aureus viável (S. aureus) dos pulmões contaminados e descrever um método reprodutível para isolar o RNA do micróbio patogénico da alta qualidade.

<table><tbody><tr><td>Matriz de lise B</td><td>MP Biomedicals</td><td>6911100</td><td>Referido no texto como "contas de sílica de 0,1 mm",</td></tr> <tr><td>agulha romba de calibre 21</td><td>SAI</td><td>B21-150</td><td>1,5" é recomendado.</td></tr><tr><td>Conjunto de DNase livre de RNase</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td>DNase usado no texto que acompanha.</td></tr><tr><td>FastPrep-24 Classic Instrument</td><td>MP Biomedicals</td><td>116004500</td><td>FastPrep FP120 não está mais disponível. Referido no texto como "Bead Beater"</td></tr><tr><td>TaqMan AIV-Matrix Reagents</td><td>Applied Biosystems</td><td>4405543</td><td>Influenza A M-segment qRT-PCR kit.</td></tr><tr><td>Suporte de intubação</td><td>Kent Scientific</td><td>ETI-MES-01</td><td>Referido no texto como "plataforma de intubação". A plataforma de intubação usada no vídeo que acompanha foi feita internamente.</td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td>Kit de purificação de RNA; contém colunas RNeasy, Buffer RLT, Buffer RW1, e Buffer RPE</td></tr><tr><td>QIAamp Viral RNA Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>52904</td><td>Kit de purificação de RNA viral.</td></tr><tr><td>Moedores de Tecidos</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>02-542-08</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanol (&beta;-Mercaptoetanol)</td><td>Calbiochem</td><td>UN2966</td><td></td></tr></tbody></table>

um sistema de entrega e recuperação de patógenos precisos para modelos murinos de pneumonia bacteriana secundária

A Precise Pathogen Delivery and Recovery System for Murine Models of Secondary Bacterial Pneumonia

As Pneumonias bacterianas secundárias que seguem infecções da gripe espesso consistentemente dentro das dez causas principais principais da morte nos Estados Unidos. Até o momento, os modelos murinos de coinfecção têm sido a principal ferramenta desenvolvida para explorar as patologias das infecções primárias e secundárias. Apesar da prevalência desse modelo, discrepâncias consideráveis em relação aos procedimentos de instilação, volumes de dose e eficácia são prevalentes entre os estudos. Além disso, esses esforços têm sido largamente incompletos em abordar como o patógeno pode influenciar diretamente a progressão da doença após a infecção. Nisto nós fornecemos um método preciso da entrega, da recuperação, e da análise do micróbio para ser usado em modelos murino da pneumonia bacteriana secundária. Nós demonstramos que a instilação intratraqueal permite uma entrega eficiente e exata de volumes controlados diretamente e uniformente no intervalo respiratório mais baixo. Os pulmões podem ser extirpado para recuperar e quantificar a carga do patógeno. Depois da excisão dos pulmões contaminados, nós descrevemos um método para extrair o RNA do micróbio patogénico da alta qualidade para a análise transcricional subseqüente. Este procedimento beneficia-se de ser um método não-cirúrgico da entrega sem o uso de equipamento de laboratório especializado e fornece uma estratégia reprodutível para investigar contribuições do micróbio patogénico à pneumonia bacteriana secundária.

A Figura 1 utiliza uma solução azul brilhante de 0,1% de peso/volume Coomassie para demonstrar que uma instilação intratraqueal entrega o inoculante diretamente e uniformemente dentro do trato respiratório inferior. A Figura 2 mostra que as bactérias (S. aureus) cfus recuperaram diretamente do tecido pulmonar homogeneizado. A Figura 3 demonstra o uso desse sistema para a entrega precisa e recuperação do intrato respiratório inferior, traçando o cfus de entrada e recuperação de camundongos individuais. A Figura 4 mostra a curva de amplificação qRT-PCR do gene de limpeza bacteriana gyrb para demonstrar que o RNA bacteriano pode ser extraído diretamente do tecido pulmonar infectado com a contaminação mínima do DNA. A Figura 5 mostra a construção de uma curva padrão usando a amplificação de qRT-PCR do vírus da influenza a-segmento M para demonstrar que o RNA viral pode ser extraído diretamente do tecido pulmonar infectado.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59566/59566fig01.jpg"> Figura 1: a instilação intratraqueal permite a distribuição uniforme no trato respiratório inferior. (A, B) Os pulmões não infectados foram extirpado de um rato saudável após instilação intratraqueal de PBS estéril e fotografado a partir de (a) dorsal e (B) perspectivas ventrais. (C, D) 50 μL de a 0,1% Coomassie a solução azul brilhante foi administrada a um rato anestesiado através da administração intratraqueal. (C) dorsal. (D) ventral. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59566/59566fig01large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59566/59566fig02.jpg"> Figura 2: recuperação representativa de CFUs bacterianos de homogeneatos pulmonares infectados. Os pulmões foram extirpado um dia após o desafio com S. aureus. Após a homogeneização, 100 μL da pasta pulmonar foram diluídos serialmente através de 10-6. Para enumerar os CFUs recuperados, 10 μL de gotas foram chapeadas das diluições 10-5 e 10-6 no agar tripótico de soja (TSA) e incubadas a 37 ° c com 5% C02 durante a noite. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59566/59566fig02large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59566/59566fig03.jpg"> Figura 3: fornecimento e recuperação precisos do inoculador do patógeno após administração intratraqueal. Os camundongos foram divididos em dois grupos contendo três camundongos por grupo. Camundongos foram submetidos à instilação intratraqueal de S. aureus em 1 x 108 (baixo) e 2 x 108 (alto) CFU/ml. Uma hora após a infecção, camundongos foram eutanasiados e os pulmões foram extirpado para demonstrar a precisão da instilação e recuperação. O iníbulo bacteriano e as bactérias recuperados do homogeneizado do pulmão foram chapeados em TSA (Agar triptic da soja). Não foram relatadas diferenças significativas entre a entrada e a recuperação bacteriana. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59566/59566fig03large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59566/59566fig04.jpg"> Figura 4: recuperação e pureza representativas do RNA bacteriano. Seis horas após a instilação intratraqueal com 1 x 108 UFC/50 ΜL de S. aureus, camundongos foram eutanasiados. Os pulmões foram extirpados e homogeneizados seguidos de ressuspensão da pasta pulmonar em tampão RLT-ß-Mercaptoetanol. O RNA foi purificado conforme descrito na etapa 3,914. o qRT-PCR foi usado para detectar transcritos do gene de limpeza bacteriano Gyrb. Um controle que não contenha transcriptase reversa (nRT) foi incluído para demonstrar a pureza do RNA recuperado. Em um limiar de 0,1, os transcritos de Gyrb foram detectados em um ciclo médio de 21,1, de 20,3, e de 20,5. os controles nRT não foram detectados até as médias do ciclo 35,9, 35,5 e 35,0. n = 3 repetições biológicas, contendo 3 repetições técnicas/replicações biológicas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59566/59566fig04large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59566/59566fig05.jpg"> Figura 5: recuperação do RNA viral representativo. Seis dias após A instilação intratraqueal com 100 PFU/50 μL de influenza A/PR/8/1934 (H1N1), camundongos foram eutanasiados. Os pulmões foram excisados e homogeneizados, e 200 μL da pasta homogeneizada foram coletados e passados através de um filtro de células de 70 μm antes da purificação do RNA viral. O RNA purificado foi diluído em série (10-1-10-4) seguido de amplificação do segmento de influenza A M. (A) parcela de amplificação do RNA influenza a recuperada de um pulmão infectado e diluída 10-1– 10-4. (B) curva padrão do segmento de influenza A M. Limiar = 0,2, R2 = 0,994, inclinação =-3,46. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59566/59566fig05large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Aqui, nós apresentamos métodos para melhorar estudos secundários da pneumonia bacteriana fornecendo uma rota não invasora da instilação no intervalo respiratório mais baixo seguido pela recuperação do micróbio patogénico e pela análise do transcrito. Estes procedimentos são reprodutíveis e podem ser executados sem equipamento especializado tal como cânulas, fios de guia, ou cabos da fibra óptica.

Um sistema de entrega e recuperação de patógenos precisos para modelos murinos de pneumonia bacteriana secundária

Secondary bacterial pneumonias following influenza infections consistently rank within the top ten leading causes of death in the United States. To date, ...

O objetivo geral deste procedimento é aprimorar os estudos secundários de pneumonia bacteriana, fornecendo uma rota simples e não invasiva de inoculação bacteriana para o trato respiratório inferior seguido de recuperação bacteriana e purificação do RNA para análise de transcrição. Isso será feito primeiro anestesiando um rato e inserindo uma agulha dobrada pré-carregada na traqueia de um rato que foi suspenso verticalmente dos incisivos maxilares. Em segundo lugar, após a infecção bem sucedida, as unidades formadoras de colônias bacterianas são recuperadas por excisão e homogeneização dos pulmões.O homogenate pulmonar resultante é diluído em série e banhado em ágar nutriente para enumerar unidades formadoras de colônias. Por último, o RNA é purificado do homogeneizado pulmonar. A vantagem deste procedimento é que permite uma entrega controlada diretamente no trato respiratório inferior.Isso nos permite olhar tanto para as contribuições combinatórias quanto individuais do patógeno para o desfecho da doença. Avanços recentes neste campo demonstraram que a regulação genética bacteriana pode ter um grande papel na determinação do resultado da infecção. Esta técnica se beneficia da capacidade de recuperar tanto cfus bacterianos quanto rna.Uma vez que o RNA é isolado, podemos então avaliar as contribuições de genes específicos de virulência para a infecção. Além disso, essa técnica se beneficia de ser não-cirúrgico. Isso permite que o estresse mínimo seja colocado em todos os animais utilizados neste procedimento e permite que eles tenham uma recuperação imediata.Este procedimento beneficia-se do uso de equipamentos de laboratório comuns sem o uso de qualquer tipo de cânulas, fios-guia ou cabos de fibra óptica. Indivíduos novos nessa técnica podem lutar no início com a instalação real através da traqueia. Uma vez que essa técnica é conceituada, torna-se um procedimento simples e eficaz para interrogar pneumonia bacteriana secundária dentro de um hospedeiro murino.Antes de iniciar o procedimento, prepare o espaço de trabalho com os seguintes suprimentos: uma plataforma de intubação, uma seringa estéril de um mL, fórceps estéreis de ponta cega, agulha estéril de ponta bruta de 21 calibres e dois tubos cônicos para armazenar a seringa e fórceps. Inicie o procedimento preparando os inóculos patógenos para que a concentração final desejada seja obtida em um volume de 50 microliter. Em seguida, usando luvas estéreis prepare uma agulha de ponta cega de 1 a 1,5 polegadas, dobrando-a a um ângulo aproximado de 35 graus.Depois de fixar a agulha na seringa, desenhe uma almofada de ar de 100 microlitres, seguida por 50 microliters do agente infeccioso. A almofada de ar de 100 microliter garante a entrega total da carga de patógenos uma vez que a seringa esteja deprimida. Coloque a agulha carregada e a seringa em um local facilmente acessível pela mão dominante.Remova e anestesia o mouse da câmara de anestesia e suspenda o mouse na plataforma de intubação dos incisivos maxilares. Usando as fórceps de ponta cã, segure suavemente e estenda a língua. Transfira a língua dos fórceps para o polegar e o dedo indicador da mão nondominante.Mantenha-se segurando a língua na mão nondominante e pegue a seringa pré-carregada. Aponte a ponta dobrada da agulha para longe do corpo. Insira a agulha na cavidade oral.Na base da língua, o ângulo suavemente do pulso para causar um leve empurrão da agulha para longe do corpo. Esta ação garante que a agulha será inserida na traqueia e não no esôfago. Guie lentamente a agulha até a traqueia.Muitas vezes um leve carrapato é sentido à medida que a agulha passa pela dobra vocal. Passe a agulha através da traqueia até que uma leve resistência seja sentida à medida que a agulha encontra a carina. Levante ligeiramente a agulha na direção ascendente para suspender a agulha acima da carina.Isso permite a entrega nos brônquios primários. Deprimir totalmente o êmbolo da seringa para entregar a carga infecciosa. Retire a agulha da traqueia e descarte.Remova o mouse da plataforma de intubação deprimindo o elástico, mas mantenha segurando o mouse na posição vertical. Obstrua as vias aéreas nasais colocando um dedo diretamente sobre as nares. Mantenha esta posição por aproximadamente um minuto ou até que várias respirações profundas sejam observadas.Esta última etapa garante que o volume total do inóculo seja entregue no trato respiratório inferior. Devolva o animal para sua gaiola e garanta que haja uma pronta recuperação da anestesia. Em momentos selecionados, os pulmões infectados podem ser extirpados para quantificar e avaliar as contribuições bacterianas para as morbidades aumentadas associadas à pneumonia bacteriana secundária.Prepare um espaço de trabalho com os seguintes itens: um barco de pesagem de escala e estéril, plataforma de dissecção, um kit de dissecção contendo tesouras e fórceps e gaze estéril. Para efeitos desta demonstração, a excisão dos pulmões será realizada em um banco superior. No entanto, a fim de manter a esterilidade durante este procedimento é recomendável que a excisão pulmonar seja realizada dentro de uma coifa de fluxo laminar.Eutanásia um rato infectado com CO2 ou método similar aprovado pela IACUC de eutanásia. Coloque e proteja o mouse infectado na plataforma de dissecção. Pulverize o mouse com etanol para manter a esterilidade nas superfícies de trabalho.Começando pelo umbigo, use um par de fórceps para levantar a pele e fazer uma incisão em direção à laringe. Agarrando a pele em ambos os lados da incisão inicial, puxe a pele para longe do corpo e corte as conexões teciduais. Pode ser útil fazer cortes laterais na pele para revelar mais da região torácica.Começando na base do processo xifoide, faça uma pequena incisão com a intenção de perfurar o diafragma. Isso resulta em um aumento da pressão na cavidade torácica fazendo com que os pulmões se retraem. Com os pulmões retraídos, continue a incisão para liberar o diafragma.Remova as costelas fazendo uma incisão em ambos os lados. Isso vai expor a cavidade torácica e os pulmões. Para extirfar os pulmões agarre a base do coração com os fórceps e levante para cima.Coloque a tesoura atrás dos pulmões e comece a fazer pequenas incisões através das conexões teciduais enquanto continua a levantar o coração para cima. Uma vez que os pulmões tenham sido excisados, coloque-os sobre uma gaze estéril e remova o coração, levantando-o para longe dos pulmões e cortando as conexões de tecido restantes. Transfira os pulmões para o barco de pesagem pré-piche e registe a massa.Depois que os pulmões tiverem sido pesados, transfira os pulmões para um soro fisiológico estéril tamponado e guarde-os temporariamente no gelo. Agora que os pulmões foram extirpados e pesados, as bactérias podem ser recuperadas para determinar seu papel na patogênese. Em preparação para a recuperação bacteriana, serão necessários os seguintes suprimentos: um moedor de tecido, PBS livre de RNase estéril, RLT tampão complementado com beta-mercaptoetanol e tubos de microcentrifuge sem RNase de 1,5 mL.Comece adicionando primeiro um mL de PBS livre de RNase estéril ao moedor de tecido. Uma vez preenchido, guarde o moedor de tecido no gelo. Em seguida, prepare uma série de tubos de diluição serial estéreis sem RNase para quantificar a carga bacteriana recuperada dos pulmões infectados.Transfira os pulmões para o moedor de tecido preparado e homogeneize completamente o tecido pressionando o pedestal durante a rotação. Abra o moedor de tecido e alíquota de 100 microliters da amostra homogeneizada no primeiro dos tubos de diluição serial preparados. Diluir em série as amostras e a placa em ágar de nutrientes para enumerar as unidades formadoras da colônia.As UFC podem ser registradas como UFC por mL ou UFC por mL, por miligrama de tecido pulmonar. Após a retirada da alíquota de 100 microliter, substitua o pedestal de moagem e centrífuga a amostra a 4.000 rpm por 10 minutos a quatro graus Celsius. Quando a centrifugação estiver completa, remova o sobrenatante da amostra pelleted.O supernante pode ser salvo e armazenado a menos 80 graus Celsius para análise posterior. Suspenda a pelota de tecido homogeneizado em 700 microliters de beta-mercaptoetanol RLT e transfira a amostra para um tubo de centrífuga de 1,5 mL livre de RNase estéril. Neste ponto, a amostra pode ser armazenada a menos 80 graus.O RNA pode ser purificado a partir do chorume homogeneizado pulmonar RLT carregando a amostra em um tubo de microcentrifuge de dois mL contendo contas de sílica de 1 milímetro e processado através de um batedor de contas por 20 segundos a seis metros por segundo. O RNA é então imediatamente purificado usando uma adaptação do método RNeasy, como relatado em Voyich, et al. Métodos em Biologia Molecular"2008, e descrito no manuscrito que acompanha este vídeo.Após a purificação, o rendimento do RNA pode ser quantificado usando um espectrômetro. Uma vez quantificado, é benéfico diluir o RNA resultante em várias alíquotas de 50 nanogramas por microliter. Isso permite que o RNA da amostra seja usado para múltiplas análises sem estar sujeito a múltiplos ciclos de congelamento.O uso desta técnica permite a instalação de uma carga de patógeno controlada diretamente no trato respiratório inferior. A eficiência deste sistema de entrega pode ser demonstrada através da instalação de uma solução azul brilhante de 1%Coomassie. A linha superior exibe um par de pulmões não infectados para servir como controle, enquanto a linha inferior exibe um par de pulmões que receberam 50 microliters do corante azul brilhante 1%Coomassie através de uma instalação intratracheal.O uso deste corante demonstra como a instalação intratracheal fornece uma distribuição uniforme da carga de patógenos dentro e em todos os pulmões esquerdo e direito. Uma vez infectada, a carga do patógeno pode ser recuperada e analisada em vários pontos de tempo pós-instalação intratraqueal por excisão e homogeneização do tecido pulmonar. Para demonstrar a eficiência desta técnica de recuperação, dois grupos contendo três camundongos cada foram infectados com uma dose baixa e alta de Staphylococcus aureus.A entrada bacteriana foi banhada em ágar nutriente para enumerar CFUs. Uma hora após a instalação intratraqueal, os camundongos foram eutanizados, pulmões extirpados e homogeneizados em um moedor de tecido. O tecido homogeneizado foi diluído em série e banhado em ágar nutriente para enumerar CFUs.O RNA isolado do tecido pulmonar homogeneizado pode ser examinado por transcriptase reversa PCR e usado para quantificar a abundância de transcrição relativa dos genes alvo. Para garantir uma contaminação mínima do DNA de fundo, recomenda-se que uma reação pcr, sem a adição de transcriptase reversa, seja executada juntamente com quaisquer reações qRT-PCR. Além das cargas bacterianas, essa técnica pode ser estendida à instalação e isolamento de cargas virais.Após a homogeneização do tecido pulmonar, o RNA viral pode ser isolado e usado para medir a abundância de transcrição de genes virais ou construir uma curva padrão para quantificação viral. O uso deste sistema fornece um sistema altamente eficiente e reprodutível para estudar pneumonia bacteriana secundária. Uma vez dominado, este procedimento pode ser usado em experimentos em larga escala.Trabalhando em lotes para eutanásia de camundongos, a instalação intratracheal pode ocorrer dentro de 30 segundos por mouse. Depois que isso for concluído, passando para a excisão dos pulmões, isso pode ser concluído em aproximadamente dois a três minutos por mouse. Embora os métodos aqui discutidos tenham sido no contexto de uma infecção bacteriana secundária, eles podem ser estendidos para qualquer procedimento onde uma entrega controlada e recuperação de um inóculo é necessário.Além dos métodos aqui descritos, este procedimento pode ser complementado pela adição de uma lavagem broncoalveolar antes da excisão dos pulmões. Embora isso muitas vezes resulte em uma diminuição da carga de patógenos, beneficia-se da obtenção de dados, como análise de citocinas, atividade de desidrogenase lactato e identificação de diferentes populações celulares. Para obter uma compreensão mais completa da patogênese da doença, torna-se importante interrogar tanto as contribuições do hospedeiro quanto do patógeno para a doença.O objetivo deste vídeo foi fornecer um método simples e eficiente para explorar pneumonia bacteriana secundária dentro de um hospedeiro murino.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Fonte: Lenhard, A. et al. Um modelo camundongo para a transição de Streptococcus pneumoniae de colonizador para patógeno após coinfecção viral recapitula a doença agravada pela idade. J. Vis. Exp. (2022)Este vídeo demonstra um modelo de co-infecção em camundongos no qual o vírus da gripe desencadeia a transição de Streptococcus pneumoniae de colonizador para patógeno. Ele descreve as etapas envolvidas na colonização bacteriana, infecção viral e progressão da doença.

Um modelo de camundongo para estudar a transição patogênica de Streptococcus pneumoniae após coinfecção viral

Neste vídeo, descrevemos um protocolo para testar a eficácia de uma vacina acelular contra coqueluche acelular contra a infecção por Bordetella pertussis em camundongos. Após a vacinação, os camundongos foram submetidos à infecção e seu homogeneizado tecidual foi cultivado para analisar as colônias bacterianas como uma leitura da imunidade protetora induzida pela vacina.

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A seguir em tempo real o impacto de fatores de virulência do pneumococo em um mouse Pneumonia aguda Modelo Usando bactérias bioluminescentes

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Um Modelo Pneumonia robusta em imunocompetentes Roedores para avaliar antibacteriano Eficácia contra<i&gt; S. pneumoniae</i&gt;,<i&gt; H. influenzae</i&gt;,<i&gt; K. pneumoniae</i&gt;,<em&gt; P. aeruginosa</em&gt; ou<em&gt; A. baumannii</em

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Projeto de ligadura cecal e punção e infecção intranasal modelo duplo de imunossupressão induzida por sepse

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Aqui, apresentamos um protocolo para estabelecer um modelo de imunossupressão de sepse em camundongos por meio da instilação intranasal de Klebsiella pneumoniae e validamos o modelo por meio de vários indicadores.

Estabelecimento de um modelo de imunossupressão induzida por sepse em camundongos por instilação intranasal de bactérias

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