Name: Enriquecimento de partículas de lipoproteína nativa com microRNA e subsequente determinação de seu conteúdo de microRNA absoluto/relativo e sua taxa de transferência celular (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Aprenda a enriquecer partículas de lipoproteína nativa com microRNA e determinar seu conteúdo absoluto/relativo e taxa de transferência celular. Este protocolo de PCR em tempo real quantitativo permite estudar veículos de transporte biológicos.

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Este trabalho foi apoiado pelo projeto Austrian do fundo da ciência P29110-B21, o projeto H-3065/2011 do "Hochschuljubiläumsstiftung der Stadt Wien zur Förderung der Wissenschaft", o Fundo Europeu para o desenvolvimento regional (EFRE, IWB2020), o estado federal da parte superior Áustria, e o "Land OÖ Basisfinanzierung".

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Os autores não têm nada a divulgar.

Aqui, o isolamento das frações de partículas de lipoproteínas do sangue humano e a determinação de seu conteúdo individual de miRNA é descrito passo a passo. É crítico trabalhar em um ambiente livre de RNase ao segurar o Mirna isolado e sintetizado — o miRNA partícula-encaixado é protegido obviamente da degradação enzimática. Como a razão de miRNA/partícula de partículas de lipoproteína nativa é bastante baixa, o enriquecimento artificial com miRNA é necessário para estudar a captação de partículas de holo de células. Assim, a reconstituição das partículas de HDL como descrito anteriormente7 é modificada para incorporar os fios de Mirna. Adicionalmente, a separação da fração lipídica e protéica durante este procedimento permite que os cientistas examinem os componentes associados a lipídios e proteínas da partícula de lipoproteína19. De forma semelhante, o procedimento de rotulagem das partículas de LDL é adaptado. Curiosamente, a adição de spermine — um estabilizador natural de nucleotídeos — não influenciou a relação de miRNA/partícula. Deve-se notar que, em princípio, o método permite o indobramento de outras substâncias do que o miRNA dentro de uma partícula de lipoproteína. Naturalmente, há um limite no que diz respeito ao tamanho físico da substância com base no tamanho total de HDL (diâmetro: 5-12 nm) e partículas de LDL (diâmetro: 18-25 nm).
Em relação ao controle de qualidade das partículas de lipoproteína reconstituídas/rotuladas, o HS-AFM é um método aplicável para caracterizar as partículas de HDL/LDL no nível de partícula única. Em comparação com em, permite tempos de preparação mais curtos e condições quase fisiológicas (molhado, temperatura ambiente).
Devido à sua sensibilidade e amplificação inerentes, a qPCR é o método de escolha para detectar baixas concentrações de miRNA. Alternativamente, a microscopia sensível da fluorescência da único-molécula, que pode detectar mesmo moléculas individuais, não seria apropriada devido às baixas concentrações de, por exemplo, as costas fluorescente etiquetadas de Mirna por a partícula. Assim, a proporção de fios de miRNA por partícula de lipoproteína nativa foi encontrada para ser 10-8. O enriquecimento artificial aumenta a razão por um fator de 10.000, o que facilita a estimativa da taxa de captação da lipoproteína celular (não se detecta diferença significativa com as partículas de lipoproteína nativa 19). A alta sensibilidade da qPCR possibilita determinar essa taxa de captação medindo o número de cordões de miRNA após o tempo de incubação e a razão de miRNA/partícula. Deve-se notar que o valor calculado ignora a degradação celular e liberação de miRNA e, portanto, representa pelo menos um limite inferior para a relação de captação de partículas de lipoproteína.
No futuro, o método pode ser adaptado para transferir substâncias farmacêuticas (nomeadamente também as lipofílicas) nas células e correlacionar o seu efeito biológico à concentração intracelular (determinada através da taxa de absorção de partículas de lipoproteínas).

As partículas de lipoproteína são compostas de uma monocamada de lipídios anfifílicos e colesterol que delimitam um núcleo de ésteres de do cholesteryl e gorduras de triglicérides. A partícula inteira é estabilizada por apolipoproteínas membrana-encaixadas, que definem a funcionalidade biológica da partícula. As partículas da lipoproteína podem ser distinguidas de acordo com sua densidade crescente respectiva e, assim, diminuindo o tamanho, a saber como a lipoproteína da muito-baixo-densidade (VLDL), a lipoproteína da intermediário-densidade (IDL), o LDL, e as partículas de HDL. Apesar do transporte de componentes insolúveis em água na corrente sanguínea, tem sido demonstrado que as partículas de HDL carregam fios não codificantes de Mirna1,2. As micro-RNAs são uma classe de fios de RNA curtos (geralmente de duas dúzias de nucleotídeos), que degradam as vertentes intracellularmente complementares do mRNA e, assim, alteram o perfil de expressão de certas proteínas3,4,5, seisanos. Além disso, as alterações do perfil de miRNA foram encontradas em uma variedade de doenças e, assim, o perfil é aplicável como um biomarcador para diagnóstico e prognóstico. O transporte extracelular de miRNAs entre pilhas através das partículas da lipoproteína pode serir como um mecanismo adicional para a modulação intercelular do nível do mRNA. Para estimar quantitativamente o efeito biológico, é necessário o conhecimento sobre o teor absoluto e relativo de miRNA de partículas de lipoproteína.
O PCR quantitativo em tempo real é um método adequado e relativamente rápido para obter essa informação. Assim, o valor da quantificação relativa (RQ) pode ser calculado, e diferenças relativas entre diferentes amostras e frações de lipoproteína são estimáveis. Os cartões de matriz microfluídico multiwell são um método rápido e fácil de usar para determinar a presença relativa (equivale ao valor RQ) de miRNAs em uma amostra. Os cartões microfluídicos da disposição de multiwell consistem em 96 ou em câmaras de reação individuais do 384 para reações individuais do qPCR encaixadas em um dispositivo microfluídicos. Cada câmara contém a sonda de hidrólise necessária e primers qPCR específicos para um miRNA individual. As vantagens são um tempo de manuseio curto devido à padronização, um fluxo de trabalho simples e um número reduzido de etapas de pipetagem. Além disso, o volume de amostra exigido é minimizado. Em contraste com a quantificação relativa, o teor absoluto de miRNA requer uma comparação dos resultados da amostra de qPCR com curvas padrão de números absolutos conhecidos de fios de miRNA. Deve-se notar que, devido ao seu teor relativamente baixo de miRNA, padrão e, além disso, mesmo as técnicas de imagem sensíveis de única molécula não são viáveis — o enriquecimento artificial de partículas de lipoproteína com miRNA é inevitável para estudar interação de partículas de lipoproteína e transferência de miRNA. Em relação a isso, a delipidação da partícula de HDL seguida com subsequente relipidation7 permite a incorporação e, assim, o enriquecimento com fios de Mirna. O enriquecimento semelhante de partículas de LDL com miRNA não é viável devido à hidrofobicidade da proteína apoB-100, que é o principal constituinte da partícula LDL. No entanto, por adição do solvente polar dimetil sulfóxido (DMSO), que é capaz de penetrar as membranas lipídicas, as partículas de LDL também podem ser carregadas artificialmente com fios de miRNA.
A microscopia de força atômica de alta velocidade (HS-AFM) é uma ferramenta poderosa para a caracterização de espécimes biológicos que oferecem subnanômetro de resolução espacial e subsegundo temporal8. Assim, é uma técnica bem adequada para o controle de qualidade de partículas de lipoproteína modificada como partículas de lipoproteína nativas/reconstituídas/rotuladas podem ser imaged um ambiente quase fisiológico.
Aqui, um protocolo baseado em qPCR é apresentado passo a passo para determinar o teor absoluto/relativo de miRNA de partículas de lipoproteína e amostras de células, o que permite estimar a taxa de captação de partículas de lipoproteína celular. Além disso, um método para o enriquecimento de partículas da lipoproteína com miRNA é demonstrado. Este método pode ser adaptado para a manipulação geral do conteúdo de lipoproteínas e, portanto, demonstra a aplicabilidade das partículas de lipoproteína como alvos para a entrega de medicamentos.

<table><tbody><tr><td>Ultracentrífuga</td><td>Beckman</td><td>Optima L-100 XP</td><td>Isolamento de lipoproteínas</td></tr><tr><td>Rotor de ultracentrífuga</td><td>Beckman</td><td>TI 55.2</td><td>Isolamento de lipoproteínas</td></tr><tr><td>Vacutainer (EDTA)</td><td>Becton Dickinson</td><td>366643</td><td>Isolamento de lipoproteínas</td></tr><tr><td>Kaliumbromid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>2110</td><td>Isolamento de</td></tr><tr><td>lipoproteínas Tubos de</td> <td>ultracentrífugaIsolamento</td><td>de lipoproteína Beckman 342414</td><td></td></tr><tr><td>Selador de tubo de ultracentrífuga</td><td>Beckman</td><td>342428</td><td>Isolamento de lipoproteína</td></tr><tr><td>Clorido de sódio</td><td>Carl Roth</td><td>GmbH P029.2</td><td>Isolamento de lipoproteína</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>D/0650/50</td><td>Isolamento de lipoproteína</td></tr><tr><td>Tubos de diálise, MWCO 12 - 14k</td><td>Spectra</td><td>132700</td><td>Isolamento de lipoproteína</td></tr><tr><td>miRNA sintético</td><td>microSintetizador</td><td></td> <td>miRNA</td></tr><tr><td>TRIS tampão pH 7</td><td>Ambion</td><td>AM9850G</td><td>miRNA sintético</td></tr><tr><td>Tampão TRIS pH 8</td><td>Ambion</td><td>AM9855G</td><td></td></tr><tr><td>tubos estéreis</td> de miRNA sintético <td>Carl Roth GmbH</td><td>ENE8.1</td><td>miRNA sintético</td></tr><tr><td>Fotômetro</td><td>Eppendorf</td><td>Eppendorf Biofotômetro</td><td>Bradford</td> ensaio</tr><tr><td>Cubeta</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>XK20</td><td>Ensaio de Bradford</td></tr><tr><td>Coomassie G-250 Coloração</td><td>BioRad GmbH</td><td>161-0786</td><td>Ensaio de Bradford</td></tr><tr><td>Clorido de sódio</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>3957.1</td><td>Delipitação</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fluka Analytical</td><td>03690-100ML</td><td>Delipitação</td></tr><tr><td>Tampão TRIS pH 8,0</td><td>Ambion</td><td>AM9855G</td><td>Delipitação</td></tr><tr><td>Etanol 100%</td><td>AustrAlco</td><td>Etanol Absolut 99.9%</td><td>Delipitação</td></tr><tr><td>Éter dietílico</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>3942.1</td><td>Centrífuga de delipitação</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific</td><td>Multifuge X3R</td><td>Delipitação</td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>3313.1</td><td>Reconstituição</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>4627.1</td><td>Reconstituição</td></tr><tr><td>Fosfatidilcolina</td><td>Sigma Aldrich GmbH</td><td>P3556-25mg</td><td>Reconstituição</td></tr><tr><td>Oleato de colesterol</td><td>Sigma Aldrich GmbH</td><td>C-9253-250mg</td><td>Reconstituição</td></tr><tr><td>colesterol</td><td>Sigma Aldrich GmbH</td><td>C8667-500mg</td> Tubos de vidro <td>de reconstituição</td></tr><tr><td></td><td>Carl Roth GmbH</td><td>K226.1</td><td>Reconstituição</td></tr><tr><td>espermina</td><td>Sigma Aldrich GmbH</td><td>S3256-1G</td><td>reconstituição</td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>Thermomixer comfort</td><td>Reconstituição</td></tr><tr><td>Desoxicolato de sódio</td><td>Sigma Aldrich GmbH</td><td>3097-25G</td><td>Reconstituição</td></tr><tr><td>Barra de agitação magnética</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>0955.2</td><td>Reconstituição</td></tr><tr><td>100&micro; L micropipetas</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>A762.1</td><td>Reconstituição</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>9143.2</td><td></td></tr><tr><td>Diálise Amberlite XAD-2 grânulos</td><td>Sigma Aldrich GmbH</td><td>10357</td><td></td></tr><tr><td>de diálise Slide-A-Lyzer (corte 20 kDa)</td><td>Seringa de diálise Thermo Scientific</td><td>66003</td><td></td></tr><tr><td>Seringa</td><td>de diálise Braun</td><td>9161406V</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de diálise agulha</td><td>Braun</td><td>465 76 83</td><td>Diálise</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>3054.2</td><td>Rotulagem de partículas de LDL</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>life technologies</td><td>D12345</td><td>Marcação de partículas de LDL</td></tr><tr><td>Microscópio de Força Atômica</td><td>RIBM</td><td>SS-NEX</td><td>Controle de qualidade de partículas de lipoproteína reconstituídas/marcadas</td></tr><tr><td>Mica Muscovita (Grau V-1)</td><td>Christine Gr&ouml; pl</td><td>G250-1/V1</td><td>Controle de qualidade de partículas de lipoproteína reconstituídas/marcadas</td></tr><tr><td>AFM Cantilever</td><td>Nanoworld</td><td>USC-F1.2-k0.15</td><td>Controle de qualidade de partículas de lipoproteína reconstituídas/marcadas</td></tr><tr><td>Gwyddion 2.49</td><td>Instituto Tcheco de Metrologia</td><td>http://gwyddion.net</td><td>Controle de qualidade de partículas de lipoproteína reconstituídas/marcadas</td></tr><tr><td>Lâminas de câmara, Nunc Lab-Tek</td><td>VWR</td><td>734-2122</td><td>Cultura celular</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>9117.1</td><td>Cultura celular</td></tr><tr><td>Contador de células</td><td>Omni Life Science GmbH</td><td>Casy</td><td>Cultura de células</td></tr><tr><td>miRNeasy Mini Kit</td><td>QIAGEN</td><td>217004</td><td>extração de miRNA</td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5415R</td><td>extração de miRNA</td></tr><tr><td>Agulha 20G</td><td>Braun</td><td>Sterican 465 75 19</td><td>miRNA seringa de extração</td></tr><tr><td>de 5ml</td><td>Becton Dickinson</td><td>309050</td><td>gabinete de PCR de extração de miRNA</td></tr><tr><td></td><td>Esco</td><td>PCR-3A1</td><td>Transcrição Reversa</td></tr><tr><td>TaqMan Kit de Transcrição Reversa</td><td>Thermo Scientific</td><td>4366596</td><td>Transcrição Reversa</td></tr><tr><td>Água sem Rnase</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>T143</td><td>Transcrição Reversa</td></tr><tr><td>0,2 ml tubos Marca</td><td></td><td>Centrífuga de</td><td>transcrição reversa</td>781305</tr><tr><td></td><td>Carl Roth GmbH</td><td>Microcentrífuga AL</td><td>Termociclador de transcrição reversa</td></tr><tr><td></td><td>Sensoquest</td><td>Labcycler</td><td></td></tr><tr><td>Primer TaqMan de</td> transcrição reversa <td>Thermo</td> <td>Scientific-qPCR</td><td></td></tr> <tr><td>iTaq Sonda universal supermix</td><td>BioRad GmbH</td><td>1725131</td><td>máquina</td></tr><tr><td>de</td> <td>PCR qPCRKit</td> de Transcrição Reversa de MicroRNA TaqMan para <td>Rotor-Gene RG-6000</td><td>da</td>Corbett</tr><tr><td></td><td>Applied Biosystems</td><td>4366596</td><td>Primers TaqMan Array</td></tr><tr><td>Megaplex RT, Human Pool A v2.1</td><td>Applied Biosystems</td><td>4399966</td><td>TaqMan</td></tr><tr><td>Array TaqMan PreAmp Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4391128</td><td>TaqMan Array</td></tr><tr><td>Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1</td><td>Aplicado Biosystems</td><td>4399933</td><td>TaqMan Array</td></tr><tr><td>TaqMan Universal Master Mix II, sem UNG</td><td>Applied Biosystems</td><td>4440040</td><td>TaqMan Array TaqMan</td></tr><tr><td>Advanced miRNA Human A Cards</td><td>Applied Biosystems</td><td>A31805</td><td>TaqMan Array</td></tr><tr><td>Água livre de nuclease</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0581</td><td>TaqMan Array</td></tr><tr><td>MgCl2 (25mM)</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0971</td><td>TaqMan Array</td></tr><tr><td>TE, pH 8.0</td><td>Invitrogen</td><td>AM9849</td><td>TaqMan Array</td></tr><tr><td>7900HT Sistema de PCR em Tempo Real</td><td>Rápido Applied Biosystems</td><td>4351405</td><td>TaqMan Array TaqMan</td></tr><tr><td>Array Selador de Cartões</td><td>Applied Biosystems-TaqMan</td><td></td> <td>Array</td></tr></tbody></table>

enriquecimento de partículas de lipoproteína nativa com microrna e subsequente determinação de seu conteúdo de microrna absoluto/relativo e sua taxa de transferência celular

Enrichment of Native Lipoprotein Particles with microRNA and Subsequent Determination of Their Absolute/Relative microRNA Content and Their Cellular Transfer Rate

As partículas de lipoproteína são predominantemente transportadores de lipídios e colesterol na corrente sanguínea. Além disso, eles contêm pequenas quantidades de fios de não-codificação microRNA (miRNA). Em geral, miRNA altera o perfil de expressão protéica devido a interações com o mensageiro-RNA (mRNA). Assim, o conhecimento do conteúdo relativo e absoluto de miRNA de partículas de lipoproteína é essencial para estimar o efeito biológico da captação de partículas celulares. Aqui, uma reacção em cadeia quantitativa do polymerase em tempo real (qPCR)-o protocolo baseado é apresentado para determinar o índice absoluto de miRNA das partículas da lipoproteína-exemplificada mostrada para partículas nativas e miRNA-enriquecidas da lipoproteína. O conteúdo relativo de miRNA é quantificado usando placas de matriz microfluídico multipoços. Além disso, este protocolo permite aos cientistas estimar o miRNA celular e, assim, a taxa de captação de partículas de lipoproteínas. Um aumento significativo do nível de miRNA celular é observável ao usar partículas de lipoproteína de alta densidade (HDL) carregadas artificialmente com miRNA, enquanto a incubação com partículas nativas de HDL não produz nenhum efeito significativo devido ao seu teor de miRNA bastante baixo. Em contrapartida, a captação celular de partículas de lipoproteína de baixa densidade (LDL) — nem com miRNA nativa nem carregada artificialmente — não alterou o nível de miRNA celular.

Aqui, é apresentado um protocolo de reação em cadeia de polimerase em tempo real quantitativo para a determinação do conteúdo de microRNA nativo (absoluto/relativo) de partículas de lipoproteína. Além, um método para aumentar o nível do Micro-RNA, assim como um método para determinar a taxa de captação celular de partículas da lipoproteína, é demonstrado.

Enriquecimento de partículas de lipoproteína nativa com microRNA e subsequente determinação de seu conteúdo de microRNA absoluto/relativo e sua taxa de transferência celular

Lipoprotein particles are predominately transporters of lipids and cholesterol in the bloodstream. Furthermore, they contain small amounts of strands of ...

Partículas de lipoproteína são veículos de transporte nativos. O enriquecimento de substâncias estrangeiras facilita seu uso como transportador de trilhos. A rotulagem específica de moléculas ou partículas inteiras torna viável medir a absorção celular.Os dois métodos de enriquecimento são rápidos e fáceis de usar, e podem ser adaptados para uma ampla gama de substâncias. Demonstrando o procedimento estarão Markus Axmann e Andreas Karner, dois pós-doutores do meu laboratório. Para começar a delipidação em uma capa de fumaça, misture de um a dois mililitros de solução HDL preparada contendo cinco miligramas de partículas HDL com 50 mililitros de mistura pré-resfriada de três a dois de éter de etanol dietil em um tubo de centrifugação conical.Incubar por duas horas a 20 graus Celsius negativos. Centrifugar a 2500 vezes g por 10 minutos a 10 graus Celsius negativos. Descarte o supernaspe, resuspenque a pelota em 50 mililitros de mistura de éter de etanol pré-resfriado e vórtice brevemente.Incubar uma segunda vez por duas horas a 20 graus Celsius negativos. Centrifugar novamente a 2500 vezes g por 10 minutos a 10 graus negativos Celsius. Em seguida, insira tubos que forneçam fluxo de gás nitrogênio para secar a pelota.E resuspensá-lo em 250 microliters de buffer A.Determine a concentração de proteína usando o ensaio de proteína bradford ou outro apropriado. É fundamental remover quaisquer remanescentes da mistura de éter de diethyl de etanol, pois esses solventes inibiriam a relicência de apolipoproteínas. Em seguida, diluir para uma concentração final de um miligrama de proteína por 250 microliters de buffer A.Insira uma tubulação que forneça gás inerte na parte da solução no tubo.Se necessário, armazene a solução durante a noite a quatro graus Celsius sob a atmosfera de gás inerte. Para começar a reconstituição, em um tubo de vidro limpo, misture 100 microliters de CO, 13,5 microliters de C e 500 microliters de PC. Em seguida, gire o tubo de vidro enquanto lava o gás nitrogênio dentro do tubo para secar a mistura, a fim de produzir uma camada de superfície homogênea. Em um tubo de reação de 0,5 mililitro, prepare uma solução de espermatozoides fresca de 30 mililitros no buffer A.Em seguida, misture 100 microliters de microRNA sintético de 10 micromolar com 100 microlitres de solução de espermatozoides em um tubo de reação de dois mililitros.E incubar por 30 minutos a 30 graus Celsius. Em seguida, transfira a solução incubada de 200 microliter para o tubo de vidro para reidratar a camada de superfície mastermix pc-CO-C preparada. E então adicione 50 microliters de uma solução de desoxicolato de sódio de 30 mililitros por mililitro.Mexa a quatro graus Celsius por duas horas. Depois disso, adicione 250 microliters da solução HDL delipidada no tubo de vidro. E mexa a 4 graus Celsius durante a noite.Para começar a diálise, adicione primeiro 50 gramas de contas adsorbentes a 800 mililitros de água dupla destilada. E use um agitador magnético para mexer por um minuto. Espere 15 minutos para as contas se acalmarem, e decantar o supernatante.Repita o procedimento com PBS pré-resfriado. de diálise pré-molhados na PBS. Use uma seringa para adicionar a mistura previamente preparada nas fitas de acordo com as instruções do fabricante.Adicione as contas adsorbentes tratadas com PBS a três litros de PBS, e coloque as fitas no PBS para dialisar a quatro graus Celsius. As contas mantêm o gradiente de densidade ao longo da membrana de diálise constante. Troque o tampão e as contas após uma hora e duas horas.Após 24 horas, com uma seringa, extraia a solução do em um tubo de reação de 1,5 mililitro para recuperar a solução de partículas HDL reconstituída. Determine a concentração de proteínas usando o ensaio de Bradford. Forneça gás inerte ao tubo de reação, selá-lo e armazenar a solução de partículas HDL reconstituída sob atmosfera de gás inerte a quatro graus Celsius.Primeiro, prepare uma solução fresca de espermatozoides de 30 milimilitos em água sem RNAse. Misture 100 microlitres de 10 micromolar de microRNA sintético com 100 microliters de solução de esperma em um tubo de reação de dois mililitros. E incubar por 30 minutos a 30 graus Celsius.Em seguida, adicione 100 microliters de DMSO e 1,2 mililitros de tampão LDL 1X à solução de espermatozoides microRNA preparada. Diluir a solução de partículas LDL previamente preparada com PBS até uma concentração final de aproximadamente quatro miligramas por mililitro. Em seguida, desenhe 450 microliters da solução diluída em um tubo de reação de 1,5 mililitros e misture com 50 microliters de tampão LDL 10X.Incuba-lo por 10 minutos no gelo. Após a incubação, combine a solução de partículas LDL de 500 microliter e a solução microRNA-spermine-DMSO de 1,5 mililitro, e incuba-a por duas horas a 40 graus Celsius. Realize diálise semelhante à descrita anteriormente, e armazene a solução de partículas LDL rotulada sob atmosfera de gás inerte a quatro graus Celsius.Para começar, diluir a solução de partículas HDL ou LDL em PBS entre um a 100 e um para 1.000. Aperte mica pressionando fita adesiva contra o substrato mica e puxando a fita para remover as camadas de mica superior. Use uma pipeta para depositar dois microliters em mica recém-cortada para incubar por cinco minutos.Partículas de lipoproteína tendem a formar membranas contínuas de ligação nas superfícies. Consequentemente, é importante ajustar a concentração de partículas na superfície mica para obter as individuais. Após a incubação, enxágue a amostra com PBS.Encha a célula líquida AFM de alta velocidade com PBS e monte o scanner de transporte de mica para o estágio AFM de alta velocidade. No software de controle, inicie o processo de aproximação do cantilever para a superfície mica. Use tamanhos de varredura inferiores a um micrômetro quadrado, e mantenha as forças de imagem o mais baixas possível.Imagem da amostra no modo de toque. Carregue os dados no Gwyddion e detecte as partículas através da marca de grãos por função limiar. Ajuste o valor do limiar de altura para mascarar as partículas individuais.Normalmente, um nível em torno de 50% é um bom ponto de partida. Remova o fundo polinomial para achatar a imagem e ative a opção excluir região mascarada. Exporte os valores máximos de altura das partículas detectadas utilizando a distribuição de várias características do grão e repita estas etapas para todas as imagens gravadas.Neste experimento, a reconstituição de partículas HDL foi realizada através da delipidação de partículas HDL, seguida de relicação e diálise. Um rendimento de 50% das partículas DE HDL reconstituídas pode ser alcançado. No entanto, a mesma rotulagem com microRNA não foi viável para a rotulagem de partículas LDL, devido à hidroofobidade da proteína apolipoproteína B100.Assim, o DMSO foi utilizado para a penetração da monocameira lipídica das partículas LDL, com rendimento próximo a 100% Durante o controle de qualidade, a diluição é fundamental para análise. A imagem superior mostra uma densidade de partículas muito alta. A imagem inferior é adequada para análise.As funções de densidade de probabilidades das alturas das partículas foram calculadas para comparação das distribuições de tamanho das partículas nativas, rotuladas e rotuladas de lipoproteínas de controle. A alteração relativa antes e depois do procedimento de rotulagem é negligente. Ao manusear oligonucleotídeos de RNA, trabalhe livre de RNAse.Use materiais descartáveis frescos e use sempre luvas. Use apenas soluções sem nuclease. AfM de alta velocidade é apenas um método para determinar a forma geral das lipoproteínas.Um método alternativo seria a microscopia eletrônica. Use equipamentos de proteção pessoal adequados e trabalhe em um capô de fumaça enquanto manuseia éter dietil.

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Research

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Biochemistry

Bioquímica

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