Localização de proteínas SUMO-modificadas usando proteínas de captura de sumo fluorescentes
27 de abril de 2019
SUMO é um essencial e altamente conservado, pequena ubiquitina-like modificador de proteína. Neste protocolo nós estamos descrevendo o uso de uma proteína de SUMO-aprisionamento recombinante stress-tolerante (kmUTAG) para visualizar os conjugados nativos, Untagged de SUMO e sua localização em uma variedade de tipos da pilha.
O significado deste protocolo é o uso de uma nova proteína UTAG fluorescente de captura de SUM PARA a detecção do modificador de proteína SUM em várias células eucarióticas. A principal vantagem desta técnica é um protocolo simples para a detecção sem anticorpos de SUM em uma variedade de células, incluindo cultura de tecido mamífero e gônnadas nematoides. O SUM SUM desempenha papéis importantes em câncer e distúrbios neurodegenerativos, e isso reforça a necessidade de ferramentas robustas e confiáveis para a detecção e análise funcional de proteínas modificadas por SUM.
Como o SUM é altamente conservado, a proteína UTAG fluorescente de captura de SUMh pode ser usada para rotular o SUM conjugado em muitos organismos diferentes. Este vídeo demonstra seu uso em células de mamíferos. Além disso, o texto completo descreve seu uso em oócitos nematode.
A demonstração visual desta técnica fornece dicas críticas para o tratamento das células antes da coloração e detecção de SUMÔ. Para começar, cresça células de cultura tecidual escolhidas em deslizamentos de cobertura redonda de 22 milímetros em placas TC de seis poços até 70 a 80% de confluentes. Lave as células brevemente com um mililitro de DPBS.
Para corrigir as células, adicione dois mililitros de PFA fresco de 4%e DPBS a cada poço. Incubar as células por 20 minutos em temperatura ambiente. Lave as células fixas três vezes durante cinco minutos em um mililitro de DPBS enquanto emcrusta a placa.
Para permeabiliizar as células, incubar por 15 minutos com 1%Triton X-100 em DPBS. Lave as células de novo, como antes. Incubar as células com 500 microliters de 1 molar glycine HCL pH 2 por 10 segundos.
Em seguida, neutralize o pH imediatamente com 500 microliters de 10X SUMO Protease buffer, ou SPB. Depois de lavar as células como antes, remova os deslizamentos de cobertura do poço e coloque-as em uma câmara de umidade. Apenas para a coloração UTAG-FL, misture um micrograma de UTAG-FL com 100 microliters de 1X SPB contendo cinco mililitros de TCEP em um tubo.
Em seguida, pipete a mistura sobre as células no deslizamento de cobertura e incubar à temperatura ambiente por uma hora na câmara de umidade. Para lavar os deslizamentos de cobertura, pipeta 200 microliters de DPBS em cada deslizamento de cobertura e deixar no lugar por 10 minutos. Repita a lavagem mais duas vezes.
Remova os deslizamentos de cobertura da última lavagem e inverta em um slide de microscopia pré-limpo com uma gota de meio de montagem. Armazene as amostras durante a noite em um congelador de 20 graus Celsius antes de visualizar sob o microscópio. Visualize as células usando os conjuntos de filtros apropriados para DAPI e Texas Red.
Consulte o texto completo para um protocolo sobre como rotular SUM e gôndeas nematoides fixas. Embora rotular células de mamíferos seja bastante simples, rotular oócitos nematode requer treinamento prévio em dissecções de gônada. KmUTAG-FL incubado com células PMT2 fixas mostrou uma mancha nuclear distinta.
Tanto a coloração nuclear difusa quanto os focos nucleares distintos eram visíveis. A localização nuclear foi confirmada por meio de co-coloração com DAPI. Consistente com a atividade de captura de SUMÔ da KmUTAG-FL, o padrão de localização nuclear era uma reminiscência da coloração SUMO23.
A co-coloração com anticorpo anti-SUMO23 8A2 confirmou a co-localização do KmUTAG-FL com o sinal SUMO23. Isso valida a eficácia do KmUTAG-FL para detectar SUMO23 em células de mamíferos. Gônnadas isoladas da hermafrodita adulta produtora de oócito c.
nematoides elegans foram rotulados com anticorpo anti-SUM. Consistente com relatórios anteriores, anticorpo anti-SUM inicialmente localizado ao plasmo nuclear de oócitos de prophase mioticos tardios. Ele então redistribuiu para o complexo de anel central dos homólogos emparelhados como o envelope nuclear quebrou e os cromossomos congressos em direção à placa de metafásico.
Em preparações paralelas, gônadas rotuladas com KmUTAG-FL revelaram padrões semelhantes. KmUTAG-FL passou de rotular o nucleoplasma para concentrar-se no complexo do anel quando os oócitos começaram e concluíram o processo de quebra do envelope nuclear. Esses resultados validam o KmUTAG-FL como uma ferramenta útil para a análise de processos relacionados à mísia e sumô em c.
elegans e possivelmente outros nematoides. Ao realizar a fixação, é fundamental usar paraformaldeído fresco e um curto tempo de fixação para manter o SUMO dobrado nativamente para que possa ser reconhecido pelo KmUTAG. Uma vez que a estrutura terciária do SUMO é altamente conservada, é muito provável que as variantes SUMO de modelos adicionais e sistemas não-modelo possam ser analisadas com o reagente KmUTAG-FL.
Atualmente, estamos usando esta nova proteína UTAG fluorescente para estudar a função de SUM durante o estresse celular. Por fim, observe que todas as etapas que utilizam o paraformaldeído fixante devem ser realizadas em uma capa de segurança de laboratório e este reagente deve ser descartado corretamente.
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Visão Geral
Este protocolo descreve o uso de uma nova proteína fluorescente aprisionadora de SUMO (kmUTAG) para a detecção de conjugados de SUMO em diversas células eucarióticas. A técnica permite a visualização livre de anticorpos do SUMO, o que é crucial para compreender seu papel em câncer e distúrbios neurodegenerativos.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Modificação de Proteínas
Antecedentes
- SUMO é uma proteína modificadora semelhante à ubiquitina que é altamente conservada entre espécies.
- Desempenha papéis significativos em diversos processos celulares, incluindo resposta ao estresse e localização proteica.
- Métodos confiáveis de detecção de proteínas modificadas por SUMO são essenciais para análise funcional.
- Este protocolo utiliza uma proteína recombinante capturadora de SUMO para visualizar SUMO em diferentes tipos celulares.
Objetivo do Estudo
- Fornecer um método simples para detectar conjugados de SUMO sem o uso de anticorpos.
- Demonstrar a aplicação do kmUTAG em células de mamíferos e em ócitos de nematódeos.
- Aprimorar a compreensão do papel do SUMO na saúde e na doença.
Métodos Utilizados
- Marcação fluorescente de SUMO utilizando a proteína kmUTAG.
- Visualização de conjugados de SUMO em cultura de tecidos de mamíferos.
- Aplicação da técnica em gônadas de nematoides.
- Análise da localização de SUMO em várias células eucarióticas.
Resultados Principais
- Visualização bem-sucedida de conjugados de SUMO em diferentes tipos celulares.
- Demonstração da eficácia do kmUTAG para detecção livre de anticorpos.
- Informações sobre a localização e função de proteínas modificadas por SUMO.
- Aplicações potenciais no estudo do papel do SUMO em câncer e distúrbios neurodegenerativos.
Conclusões
- A proteína kmUTAG é uma ferramenta valiosa para a detecção de SUMO em diversos organismos.
- Este método simplifica o estudo das funções biológicas da SUMO.
- Pesquisas futuras podem aproveitar esta técnica para explorar vias relacionadas à SUMO na saúde e na doença.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A detecção livre de anticorpos de modificações SUMO permite uma validação robusta de alvos em sistemas relevantes para doenças, especialmente em programas de oncologia e neurodegeneração onde a SUMOilação afeta a estabilidade e função proteica. O reagente kmUTAG fornece uma ferramenta recombinante, transespécies, que reduz a variabilidade do ensaio e apoia a desvinculação mecanicista ao visualizar diretamente conjugados endógenos de SUMO em células vivas ou fixadas. Essa abordagem melhora a confiança preditiva na fase inicial de descoberta, eliminando artefatos dependentes de anticorpos e permitindo a investigação padronizada da via SUMO em diferentes sistemas modelo.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação direta da regulação proteica dependente de SUMO sem interferência de anticorpos, apoiando testes de hipóteses em modelos de câncer e doenças neurodegenerativas.
- Valor Operacional: A produção recombinante garante consistência entre lotes e escalabilidade para campanhas de triagem em alta produtividade que exigem leituras de atividade de SUMO.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera leituras quantitativas de fluorescência do estado de conjugação de SUMO, permitindo a padronização de ensaios para alterações na SUMOilação induzidas por compostos.
- Valor Operacional: Compatível com microscopia padrão e protocolos de fixação, possibilitando a integração em plataformas de ensaios celulares existentes sem necessidade de equipamentos especializados.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Facilita estudos de localização de SUMO entre espécies, desde células de mamíferos até oócitos de nematódeos, apoiando o alinhamento translacional de biomarcadores em vias conservadas de resposta ao estresse.
- Valor Operacional: Funciona em preparações de tecidos fixados, permitindo análise retrospectiva da dinâmica de SUMO em modelos pré-clínicos de doenças.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere em fluxos de trabalho de descoberta inicial nos quais a modulação da via SUMO é um mecanismo de ação, fornecendo validação ortogonal para estudos bioquímicos ou genéticos de perturbação SUMO antes da otimização de compostos líderes.
- Biologia da Descoberta: Apoia triagens baseadas em hipóteses ao confirmar a conjugação direcionada de SUMO em resposta a moduladores de vias ou derrubadas genéticas.
- Triagem: Permite a detecção reprodutível da formação de focos de SUMO como leitura fenotípica em ensaios de triagem de alto conteúdo.
- Análises: Fornece dados quantitativos sobre a localização subcelular (nuclear versus citoplasmática, difusa versus focal) que podem ser correlacionados com tratamento por compostos ou fundo genético.
- Pesquisa Translacional: Demonstra a conservação dos padrões de tráfego de SUMO entre espécies, apoiando a extrapolação de modelos de nematódeos para sistemas mamíferos.
- Reutilização Corporativa: O kmUTAG-FL recombinante pode ser armazenado e compartilhado entre departamentos como um reagente padronizado para monitoramento da via de SUMO.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz falsos positivos na detecção de SUMO ao minimizar a ligação ao SUMO livre, aumentando a confiança em sinais específicos de conjugados.
- Valor Operacional: Elimina a necessidade de aquisição, validação e titulação de anticorpos, reduzindo os prazos e custos de desenvolvimento de ensaios.
- Valor Estratégico: Permite decisões de prosseguimento ou interrupção com base na visualização direta do engajamento do alvo com a maquinaria de SUMOilação, reduzindo a ambiguidade mecanicista em projetos iniciais.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de compostos que modulam a SUMOilação, fornecendo evidências funcionais, baseadas na localização, de atividade da via.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em cultura celular, fixação e microscopia de fluorescência para o preparo adequado e visualização das amostras.
- Depende do acesso a microscopia de fluorescência com conjuntos de filtros apropriados para os canais DAPI e Texas Red.
- A marcação de ovócitos de nematódeos exige treinamento prévio em dissecação de gônadas, limitando a escalabilidade imediata em laboratórios não especializados.
- A fixação com paraformaldeído fresco é essencial para preservar a estrutura terciária da SUMO, exigindo manipulação padronizada de reagentes entre diferentes locais.
- Embora eficaz em células de mamíferos e em C. elegans, pode ser necessária validação empírica em novos sistemas modelo para confirmar a compatibilidade com kmUTAG-FL.
