Name: Avaliando a angiogênese terapêutica em um modelo murino de isquemia Retromembro (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Aprenda a avaliar terapias angiogênicas em modelo murino de isquemia do membro posterior usando camundongos C57BL/6. Este protocolo permite análises funcionais, histológicas e moleculares para compreender mecanismos de revascularização.

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Agradecemos a José Rino e Tânia carvalho, chefes da unidade de Bioimagem e histologia e laboratório de patologia comparativa do Instituto de medicina molecular João Lobo Antunes, respectivamente. Agradecemos também Vyacheslav Sushchyk do departamento de anatomia da nova Medical School/Faculdade de ciências médicas, Universidade Nova de Lisboa.
Referência de financiamento: projeto financiado pela UID/IC/0306/2016 Fundação para a ciência e a tecnologia. Paula de Oliveira é apoiada por uma bolsa de estudos (SFRH/BD/80483/2011) da Fundação para a ciência e tecnologia.

Todos os procedimentos em animais estão em conformidade com a diretiva 2010/63/UE e foram aprovados pelo organismo institucional de bem-estar animal e licenciados pela DGAV, a autoridade portuguesa competente para a protecção dos animais (número de licença 023861/2013)
Cuidado: diversos dos produtos químicos usados nos protocolos são tóxicos e prejudiciais. Por favor, use todas as práticas de segurança apropriadas e equipamentos de proteção individual (luvas, jaleco, calça de corpo inteiro e sapatos de dedo fechado)
1. o modelo murino de isquemia do membro posterior
Nota: todos os experimentos são realizados em ratos fêmeas de 22 semanas de idade C57BL/6.
<ol><li>Preparação de soluções
	<ol>
<li>
Preparação da solução anestésica Nota: esta combinação anestésica (medetomidina e cetamina) fornece até 30 min de imobilização e uma janela cirúrgica de 15 min. O efeito pode ser revertido pela administração de atipamezole.<ol>
<li>Com uma seringa limpa de 1cc, retire 1 mL de medetomidina (1 mg/kg de peso corporal), elimine as bolhas de ar para medições precisas e adicione-a a um tubo Falcon de 15 mL.</li>
			<li>Com uma seringa limpa de 1 cc, retire 0,75 mL de cetamina (75 mg/kg de peso corporal), elimine as bolhas de ar para medições precisas e adicione-a a um tubo Falcon de 15 mL contendo a medetomidina.</li>
			<li>Adicionar 8,25 mL de soro fisiológico estéril (0,9% NaCl), a fim de obter 10 mL de solução anestésica.</li>
			<li>Identifique o tubo com o nome dos compostos, a data misturada e a data de expiração.</li>
			<li>Conservar no escuro a 4 ° c.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Preparação da solução antisedativa
		<ol>
<li>Com uma seringa limpa de 1 cc, retire 1 mL de atipamezol (5 mg/kg de peso corporal), elimine as bolhas de ar para medições precisas e adicione-a a um tubo Falcon de 15 mL.</li>
			<li>Adicionar 9 mL de soro fisiológico estéril (0,9% NaCl), a fim de obter 10 mL de solução de reversão.</li>
			<li>Identifique o tubo com o nome dos compostos, a data misturada e a data de expiração.</li>
			<li>Conservar no escuro a 4 ° c.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Preparação da solução de analgesia pós-operatória
		<ol>
<li>Com uma seringa limpa de 1 cc, retire 0,5 mL de buprenorfina (100 μL/15-30 g de peso corporal), elimine as bolhas de ar para medições precisas e adicione-a a um tubo Falcon de 15 mL.</li>
			<li>Adicionar 9,5 mL de soro fisiológico estéril (0,9% NaCl), a fim de obter 10 mL de solução de analgesia.</li>
			<li>Identifique o tubo com o nome dos compostos, a data misturada e a data de expiração.</li>
			<li>Conservar no escuro a 4 ° c.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Indução cirúrgica da isquemia do membro posterior
	<ol>
<li>Ferramentas cirúrgicas necessárias para esta intervenção: pinça pontiaguda, tesoura de mola, suporte de agulha oftálmico, tesoura cirúrgica e suporte de agulha. Esterilizar todas as ferramentas cirúrgicas em autoclave antes de usar. Use cotonetes de algodão para a dissecção de gordura subcutânea.</li>
		<li>Carregue a seringa com a solução anestésica antes de segurar o rato.</li>
		<li>Contenha o animal aplicando a força atrás de suas orelhas contra a grade da gaiola, segurando o máximo de pele possível para manter o mouse imóvel.</li>
		<li>Mantenha o animal inclinado com a cabeça abaixada e realize uma injeção intraperitoneal da solução anestésica, mantendo a seringa em um ângulo de 45 ° com o corpo do mouse.</li>
		<li>Verifique a ausência de reflexos de retirada do pedal, para avaliar a profundidade da anestesia.</li>
		<li>Retire o cabelo do membro posterior direito usando um barbeador elétrico. Use um sabonete desinfetante de clorexidina para preparação da pele. Use uma toalha de papel limpa para remover os Suds. Aplique uma esfoliação cirúrgica de clorexidina e proteja a área da pele com um drapejar estéril antes de transportar os camundongos para a suíte cirúrgica estéril.</li>
		<li>Coloque o animal em decúbito dorsal e contenha-o com os quatro membros espalhados e fixados com fita adesiva. Cuidado: realize o procedimento em uma almofada aquecida para manter a temperatura do corpo do animal estável; o procedimento cirúrgico é realizado usando um microscópio de dissecção a uma ampliação de 10x ou 20x.</li>
		<li>Aplique uma solução antisséptica de clorexidina usando gaze estéril para finalizar a preparação da pele. Usando uma lâmina cirúrgica do bisturi do número 11 realize uma incisão da pele de 1 cm que sobrejacente a coxa do hindmembro direito.</li>
		<li>Gordura subcutaneous dissecar Blunt que expõe o pacote neurovascular. Usando o fórceps pointed, as tesouras da mola e o suporte oftálmica da agulha, abrem a bainha Ilio-femoral membranous para expor os vasos ilíaco e femoral externos longe do ponto de origem.</li>
		<li>Dissecar e separar os vasos (artéria e veia) do nervo. Usando uma sutura não-absorvível do polipropileno 7,0 ligadura a artéria ilíaca externa e a veia longe do ponto de origem e a artéria e a veia femoral longe do ponto de origem.</li>
		<li>Transect o segmento da artéria e das veias Ilio-femoral entre os nós longe do ponto de origem e os proximal com as tesouras da mola.</li>
		<li>Feche a incisão com uma sutura absorvível (por exemplo, 5,0 sutura Vicryl).</li>
		<li>Coloque a seringa com a solução antisedativa e use o mesmo método detalhado em 1.2.3 e 1.2.4 para realizar uma injeção intraperitoneal da solução antisedativa.</li>
	</ol></li>
	<li>Monitorização pós-operatória Nota: os animais são cuidadosamente observados a cada 15-20 min para garantir que todos os animais se recuperem bem do antisedativo; animais anestesiados nunca são deixados sem vigilância.<ol>
<li>Avaliar a recuperação da anestesia: 1) monitorar a taxa e a profundidade da respiração; 2) avaliar reflexos animais (pedal e posição do olho)</li>
		<li>Realize uma injeção subcutânea da analgesia pós-operatória a cada 8-12 h.</li>
		<li>Monitore os animais diariamente após a cirurgia registrando uma breve descrição do estado de saúde do animal e da aparência do local da cirurgia, assegure-se de que todas as suturas estejam fechadas.</li>
		<li>Re-sutura da incisão, se a deiscência ocorre. Se não tiver êxito, aplique uma película de barreira cutânea na incisão para proteger da urina, excreções fecais, atrito e cisalhamento da pele e para ajudar o processo de cicatrização.</li>
	</ol></li>
</ol>2. avaliação do efeito angiogênico
Nota: após a indução da isquemia, aplique o agente terapêutico no estudo e consiga os seguintes procedimentos. As etapas empreendidas em outros pontos do tempo são detalhadas a seção correspondente.
<ol><li>Imagem latente da perfusão do laser Doppler
	<ol>
<li>Retire o cabelo de ambos os membros posteriores um dia antes da análise usando um barbeador elétrico seguido de creme depilatório.</li>
		<li>Anestesie os camundongos utilizando a solução anestésica.</li>
		<li>Coloque o animal numa almofada de aquecimento de 37 ° c durante 5 min para garantir que a temperatura não mudará durante o procedimento</li>
		<li>Coloque o animal na posição supina com as pernas fixadas em uma posição estendida. Medir a distância entre as pernas direita e esquerda e os pés para cada animal, uma vez que o posicionamento do animal deve ser semelhante sempre que o procedimento deve ser repetido, a fim de acompanhar as alterações na perfusão do membro posterior ao longo do tempo.</li>
		<li>Comece adquirindo dados usando um Imager da perfusão do laser Doppler.</li>
		<li>Após a conclusão da aquisição, reverter a anestesia com a solução antisedativa.</li>
		<li>Abra o software de análise de imagem e desenhe a região de interesse (ROI) em torno do membro posterior isquêmico e um ROI comparável em torno do membro posterior não isquêmico.</li>
		<li>Observar os valores de fluxo e determinar a perfusão como uma proporção da perfusão no membro isquêmico para o membro não isquêmico. As alterações na relação de perfusão são medidas ao longo do tempo.</li>
	</ol></li>
	<li>Análise de imunohistoquímica e densidade capilar
	<ol>
<li>Após anestesia, Sacrifique os camundongos por luxação cervical.</li>
		<li>Para colher os músculos gastrocnêmio de ambas as pernas, primeiro, retire a pele de ambos os membros posteriores.</li>
		<li>Identifique o tendão de Aquiles e separe o tendão do osso usando um bisturi de 11 lâminas.</li>
		<li>Segure o tendão de Aquiles e separe o músculo da tíbia e fíbula até a articulação do joelho com tesoura de mola.</li>
		<li>Separe o bíceps femoral do músculo gastrocnêmio.</li>
		<li>Use tesouras de mola para cortar as inserções dos músculos gastrocnêmio no nível da articulação do joelho.</li>
		<li>Coloque os músculos gastrocnêmio colhidas em uma orientação transversal em um pequeno disco de cortiça com a ajuda de 10% tragacanto.</li>
		<li>Congelar os espécimes em isopentano líquido refrigerado a nitrogênio e armazená-los em-80 ° c até o corte.</li>
		<li>Corte 7 μm seções dos espécimes musculares em um criostat e montagem em lâminas de vidro. Observação: o protocolo pode ser pausado aqui.</li>
		<li>Fixar as lâminas de vidro em uma garrafa contendo acetona pura arrefecida (aproximadamente 50 mL) por 10 min, a-20 ° c.</li>
		<li>Adicionar hidrogênio peroxidase 0,3% diluído em metanol (50 mL) por 30 min à temperatura ambiente.</li>
		<li>Lave duas vezes em solução salina tampão fosfato (PBS) (50 mL) para um total de 10 min.</li>
		<li>Use uma caneta hidrofóbica ao redor das seções. Nota: o uso de uma caneta hidrofóbica permite reduzir a quantidade de soluções gastas durante o protocolo. Para todas as incubações use 100 μL de todas as soluções, por seção.</li>
		<li>Aplique uma solução de bloqueio de 5% de soro de coelho em PBS por 30 min à temperatura ambiente.</li>
		<li>Incubar os espécimes por 1 h à temperatura ambiente com anticorpo monoclonal de rato CD31 diluído em 1:500 em 1% de albumina sérica bovina (BSA) em PBS.</li>
		<li>Lave três vezes em PBS durante um total de 30 min.</li>
		<li>Adicionar um secundário biotinylated coelho anticorpo IgG anti-Rat em 1:200 em 1% BSA em PBS e 5% de soro de coelho para 30 min à temperatura ambiente.</li>
		<li>Lave em PBS como antes e adicione o complexo rotulado de peroxidase avidina-conjugado por 30 min à temperatura ambiente.</li>
		<li>Enxague 3 vezes em PBS durante 5 min e adicione o kit de substrato de peroxidase de diaminobenzidina (DAB) por mais 5 min.</li>
		<li>Contratura as secções com hematoxilina por 10 s antes da montagem.</li>
		<li>Meça as densidades capilares usando um microscópio de brightfield ereto (isto é, número de capilares por o número de myocytes) em 2 seções diferentes de 4 áreas anatômicas distintas em cada espécime.</li>
	</ol></li>
	<li>Perfusão do agente de contraste
	<ol>
<li>Anestesie os camundongos utilizando a solução anestésica.</li>
		<li>Realize uma laparotomia mediana usando uma lâmina de bisturi número 15.</li>
		<li>Expor a aorta abdominal e a veia cava caudal, após retrar lateralmente o intestino delgado e usar tesouras de mola.</li>
		<li>Insira o cateter 1 26-Gauge cranialmente na aorta abdominal e outro na veia cava caudal na mesma direção.</li>
		<li>Fixe cateteres no lugar usando uma sutura de seda 5/0 para executar uma sutura da estada.</li>
		<li>Lave o sistema vascular com uma solução salina de 37 ° c contendo heparina (500 unidades/100 mL) empurrada para a aorta abdominal usando uma seringa de 10 mL. Continue a perfusão suave até que uma solução clara seja vista saindo do cateter colocado dentro da veia cava caudal. Nota: geralmente 30 a 40 mL de uma solução salina heparinizada são necessários para enxaguar o sistema vascular de um rato adulto.</li>
		<li>Administrar uma mistura de adenosina (1 mg/L) e papaverina (4 mg/L) durante 2 min.</li>
		<li>Injete no cateter aórtico 10 mL de uma mistura de 50% de sulfato de bário e 5% de gelatina. Nota: a solução deve ser mantida a 60 ° c para evitar espessamento.</li>
		<li>Deixe os camundongos a-4 ° c por pelo menos 4 h, a fim de permitir que o elenco vascular solidifique.</li>
		<li>Retire a pele do corpo inferior de cada rato.</li>
	</ol></li>
	<li>Diaphonization - técnica de Spalteholz
	<ol>
<li>Fixar os camundongos por imersão em uma solução de formaldeído a 10% por pelo menos 72 h.</li>
		<li>Bleach os camundongos por imersão em uma solução de peróxido de hidrogênio a 30% para 24 h.</li>
		<li>Deshidratar os camundongos usando a técnica de substituição de congelamento. Esta metodologia consiste em submeter os camundongos a passagens sucessivas (em média quatro) de acetona pura a-20 ° c por 24 h cada.</li>
		<li>Esclarecer os camundongos por imersão em uma solução contendo uma mistura de 100% benzoato de benzilo e 100% salicilato de metilo em uma proporção de 3:5 (esta mistura também é conhecida como solução de Spalteholz) 13.</li>
		<li>Deixe os ratos imersos na solução de Spalteholz dentro de uma câmara de vácuo até que se torne Diaphanous, que toma geralmente 5 a 7 dias.</li>
		<li>Substitua a solução, se escurecer antes que o espécime se torne desobstruído.</li>
	</ol></li>
	<li>Quantificação dos vasos colaterais
	<ol>
<li>Observe os camundongos suspensos na solução de Spalteholz transiluminação usando um microscópio estereotódico. Use fórceps de microcirurgia para agarrar e movê-lo suavemente.</li>
		<li>Fotografe os membros inteiros usando uma câmera digital conectada ao microscópio.</li>
		<li>Obtenha fotografias inteiras do membro usando o software apropriado.</li>
		<li>Realize uma segmentação manual dos vasos colaterais, destacando-os usando o software apropriado. Nota: os vasos colaterais são definidos de acordo com a definição de Longland, uma haste definida, zona média e reentrante, com diâmetro entre 20 e 300 μm, excluindo as artérias femoral, safena e poplítea e todas as estruturas venosas.</li>
		<li>Definir ROIs em cada rato na mesma região anatômica no adutor, circunvizinho e abaixo da oclusão cirúrgica.</li>
		<li>Quantificar a densidade do vaso colateral (DCV) em ROIs equivalentes correspondendo a 20% da área total do membro. A DCV é calculada como a razão entre a área vascular e as áreas de ROIs. Todas as medições de densidade são executadas usando o software ImageJ. Nota: presume-se que o valor CVD do membro não isquêmico para cada camundongo corresponda a 100% para excluir variações nos procedimentos de anatomia, perfusão ou diaphonização. A porcentagem de DCV no membro isquêmico foi, portanto, calculada em relação à não isquêmica.</li>
		<li>Determinar a porcentagem de aumento da DCV como a diferença entre o percentual de DCV entre os membros isquêmicos e não isquêmicos.</li>
	</ol></li>
	<li>Microdissecção da captação do laser dos capilares
	<ol>
<li>Após anestesia, Sacrifique os camundongos por luxação cervical.</li>
		<li>Para colher os músculos gastrocnêmio de ambas as pernas, retire a pele dos camundongos ambos os membros posteriores.</li>
		<li>Identifique o tendão de Aquiles e separe o tendão do osso usando um bisturi de 11 lâminas.</li>
		<li>Segure o tendão de Aquiles e separe o músculo da tíbia e fíbula até a articulação do joelho com tesoura de mola.</li>
		<li>Separe o bíceps femoral do músculo gastrocnêmio.</li>
		<li>Use tesouras de mola para cortar as inserções dos músculos gastrocnêmio no nível da articulação do joelho.</li>
		<li>Coloque os músculos gastrocnêmio colhidas em uma orientação transversal em um pequeno disco de cortiça com a ajuda de 10% tragacanto.</li>
		<li>Congelar os espécimes em isopentano líquido refrigerado a nitrogênio e armazená-los em-80 ° c até o corte.</li>
		<li>Corte em um criostat 12 μm seções dos espécimes musculares e montagem em lâminas de vidro. Nota: para a proteção do RNA tome um slide pré-arrefecido e toque no verso do slide com o dedo (luvas) para aquecer apenas a região para colocar a seção. Seção de transferência da faca do criostat tocando com a área aquecida e seque a-20 ° c no criostat para 2-3 min. O protocolo pode ser pausado aqui.<ol>
<li>Fixe as lâminas de vidro numa garrafa contendo acetona pura arrefecida (aproximadamente 50 mL) durante 5 min a-20 ° c e seque-as com ar.</li>
			<li>Use uma caneta hidrofóbica ao redor das seções. Nota: o uso da caneta hidrofóbica ajuda na redução da quantidade de soluções gastas durante o protocolo. Para todas as incubações use 100 μL de todas as soluções, por seção.</li>
			<li>Hidratar com 2 M de NaCl/PBS a 4 ° c e incubar os espécimes durante a noite a 4 ° c com anticorpo monoclonal de rato CD31 a 1:500 em 2M NaCl/PBS.</li>
			<li>Lave duas vezes em 2M NaCl/PBS para um total de 6 min.</li>
			<li>Adicione um anticorpo de IgG anti-rato biotinylated secundário do coelho em 1:200 em 2M NaCl/PBS e no soro do coelho de 5% por 30 minutos em 4 ° c.</li>
			<li>Lave em 2 M NaCl/PBS como antes e adicione o complexo rotulado de peroxidase avidina-conjugado por 30 min a 4 ° c.</li>
			<li>Enxágüe e adicione o kit de substrato de peroxidase DAB por 5 min.</li>
			<li>Desidratar as secções no gelo-frio 90% etanol seguido por 100% etanol e deixá-los a secar.</li>
			<li>Dissect 10 000 capilares por camundongos usando um sistema de microdissecção a laser equipado com um laser de estado sólido pulsado 355 NM e catapulta os capilares dissecados em um tubo de microcentrífuga adesivo-tampão.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Extração de RNA, síntese de cDNA, pré-amplificação e RT-PCR
	<ol>
<li>Isole o RNA total dos capilares microdissecados usando um kit apropriado, o RNA total obtido é entre 1,5-3 ng/μL.</li>
		<li>Use um kit de síntese de cDNA para síntese e duas rodadas de pré-amplificação, utilizando os primers descritos na tabela 1.</li>
		<li>Execute RT-PCR para os mesmos alvos descritos na etapa anterior. Use um programa que consiste em uma etapa inicial da desnaturação em 95 ° c por 10 minutos, seguida por 50 ciclos em 95 ° c para 15 s e em 60 ° c por 1 minuto.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Becker, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+I%3A+Definitions%2C+epidemiology%2C+clinical+presentation+and+prognosis%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Vascular+and+Endovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Chapter I: Definitions, epidemiology, clinical presentation and prognosis.</a> European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 42 Suppl 2, S4-S12 (2011).</li>
<li>Fowkes, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+artery+disease%3A+epidemiology+and+global+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Peripheral artery disease: epidemiology and global perspectives.</a> Nature Reviews Cardiology. 14 (3), 156-170 (2017).</li>
<li>Abu Dabrh, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+natural+history+of+untreated+severe+or+critical+limb+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Vascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">The natural history of untreated severe or critical limb ischemia.</a> Journal of Vascular Surgery. 62 (6), 1642-1651 (2015).</li>
<li>Lejay, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+murine+model+of+sustainable+and+durable+chronic+critical+limb+ischemia+fairly+mimicking+human+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Vascular+and+Endovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">A new murine model of sustainable and durable chronic critical limb ischemia fairly mimicking human pathology.</a> European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 49 (2), 205-212 (2015).</li>
<li>Sprengers, R. W., Lips, D. J., Moll, F. L., Verhaar, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progenitor+cell+therapy+in+patients+with+critical+limb+ischemia+without+surgical+options%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Progenitor cell therapy in patients with critical limb ischemia without surgical options.</a> Annals of Surgery. 247 (3), 411-420 (2008).</li>
<li>Lotfi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+more+relevant+hind+limb+model+of+muscle+ischaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">Towards a more relevant hind limb model of muscle ischaemia.</a> Atherosclerosis. 227 (1), 1-8 (2013).</li>
<li>Masaki, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenic+gene+therapy+for+experimental+critical+limb+ischemia%3A+acceleration+of+limb+loss+by+overexpression+of+vascular+endothelial+growth+factor+165+but+not+of+fibroblast+growth+factor-2%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Angiogenic gene therapy for experimental critical limb ischemia: acceleration of limb loss by overexpression of vascular endothelial growth factor 165 but not of fibroblast growth factor-2.</a> Circulation Research. 90 (9), 966-973 (2002).</li>
<li>Limbourg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+postnatal+arteriogenesis+and+angiogenesis+in+a+mouse+model+of+hind-limb+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Evaluation of postnatal arteriogenesis and angiogenesis in a mouse model of hind-limb ischemia.</a> Nature Protocols. 4 (12), 1737-1746 (2009).</li>
<li>Hellingman, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variations+in+surgical+procedures+for+hind+limb+ischaemia+mouse+models+result+in+differences+in+collateral+formation%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Vascular+and+Endovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Variations in surgical procedures for hind limb ischaemia mouse models result in differences in collateral formation.</a> European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 40 (6), 796-803 (2010).</li>
<li>Brevetti, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exercise-induced+hyperemia+unmasks+regional+blood+flow+deficit+in+experimental+hindlimb+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Surgical+Research%22%5BJournal%5D)">Exercise-induced hyperemia unmasks regional blood flow deficit in experimental hindlimb ischemia.</a> Journal of Surgical Research. 98 (1), 21-26 (2001).</li>
<li>Ministro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-dose+ionizing+radiation+induces+therapeutic+neovascularization+in+a+pre-clinical+model+of+hindlimb+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Low-dose ionizing radiation induces therapeutic neovascularization in a pre-clinical model of hindlimb ischemia.</a> Cardiovascular Research. 113 (7), 783-794 (2017).</li>
<li>Pereira, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+angiogenesis+induced+by+human+umbilical+cord+tissue-derived+mesenchymal+stromal+cells+in+a+murine+model+of+hindlimb+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+Therapy%22%5BJournal%5D)">Therapeutic angiogenesis induced by human umbilical cord tissue-derived mesenchymal stromal cells in a murine model of hindlimb ischemia.</a> Stem Cell Research Therapy. 7 (1), 145(2016).</li>
<li>Azaripour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+survey+of+clearing+techniques+for+3D+imaging+of+tissues+with+special+reference+to+connective+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue.</a> Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Os modelos de Murine de CLI consistiram na maior parte na ligadura da artéria femoral apenas distal à origem do femoral do profunda 4,5,6,7,8,9. Isto demonstrou deixar intacta a maior parte da circulação colateral, o que restaura o fluxo sanguíneo para o membro no prazo de 7 dias 9. A remoção da cama c...

A doença arterial periférica (PAD) acomete predominantemente os membros inferiores. A PAD é causada pela aterosclerose, uma obstrução da artéria que pode causar severa restrição ao fluxo sanguíneo nos membros inferiores1. A claudicação intermitente é a primeira manifestação da PAD e refere-se à dor muscular ao caminhar. A CLI é o estágio mais grave da PAD, sendo diagnosticada em pacientes que apresentam dor de repouso isquêmica, úlceras ou gangrena2. Pacientes com CLI apresentam alto risco de amputação, especialmente se não forem tratados3. A revascularização do membro inferior (seja por cirurgia aberta ou por procedimento endovascular) é atualmente a única maneira de conseguir o resgate dos membros. No entanto, cerca de 30% dos pacientes com CLI não são adequados para esses procedimentos, por razões que incluem a localização das lesões, o padrão de oclusão arterial e extensa comorbidade4,5. Portanto, novas terapias são necessárias para estes pacientes de outra forma intratáveis, com a promoção da angiogênese sendo a estratégia investigação mais intensa.
Antes de testar em seres humanos, a eficácia e segurança de novas terapias in vivo deve ser considerada em modelos animais. Vários modelos foram desenvolvidos para o estudo da CLI, principalmente por indução de isquemia do membro posterior (HLI) em camundongos6,7,8,9,10. No entanto, esses modelos diferem em vários aspectos, incluindo a natureza das artérias que são ligadas e/ou extirpada e se as veias e os nervos que cercam são dissecados também6,7,8, 9,10. Tomados em conjunto, esses aspectos afetarão a severidade da lesão de isquemia-reperfusão em cada animal, dificultando a comparação dos resultados. Portanto, é fundamental desenvolver um protocolo efetivo no qual o procedimento para induzir a isquemia e a avaliação de diferentes alvos deva ser padronizado para avaliar se uma determinada terapia angiogênica será efetiva. Um protocolo experimental destinado a abranger todos esses aspectos proporcionaria uma compreensão abrangente dos mecanismos pelos quais as terapias angiogênicas exercem seus efeitos e uma medida de sua eficácia em cada um de seus desfechos. Duas obras distintas recentemente publicadas por nossa equipe são um bom exemplo11,12, em que diferentes abordagens para induzir a angiogênese terapêutica foram avaliadas usando o mesmo protocolo que será descrito com mais detalhes neste Protocolo.
O objetivo geral deste protocolo é descrever um modelo experimental reprodutível que pode imitar os efeitos da CLI e estabelecer a base experimental para uma avaliação abrangente dos efeitos funcionais, histológicos e moleculares do putativo angiogênico Agentes.

<table><tbody><tr><td>7500 PCR rápido em tempo real</td><td>aplicado</td><td></td><td></td></tr> instrumento <tr><td>Acetona</td><td>Merk</td><td>1000141000</td><td>reagente; Cuidado - altamente inflamável</td></tr><tr><td>Reagente</td>de<td>adenosina</td><td>Valdepharm</td><td></td></tr><tr><td>Atipamezole</td><td>OrionPharma</td><td></td><td>Reagente</td></tr><tr><td>Sulfato de bário (Micropaque)</td><td>Guebert</td><td>8671404 (ref. Infarmed)</td><td>Reagente</td></tr><tr><td>Buprenorfina</td><td>RichterPharma</td><td></td><td>Reagente</td></tr><tr><td>Carl Zeiss Opmi-1 FC</td><td>Microscopia Carl Zeiss, Alemanha</td><td></td><td>Instrumento</td></tr><tr><td>cDNA RT2 PreAMP kit de síntese de cDNA</td><td>Qiagen</td><td>7335730</td><td>Reagente</td></tr><tr><td>Cryostat Leica CM</td><td>Leica Microsystems</td><td>3050S</td><td></td></tr><tr><td>Instrumento DAB kit de substrato de peroxidase</td><td>DAKO; Reagente Vector Laboratories</td><td>K3468</td><td></td></tr><tr><td>peroxidase de hidrogênio</td><td>Merk</td><td>1072090250</td><td>Reagente; Cuidado -</td></tr><tr><td>caneta hidrofóbica</td> nocif <td>Dako</td><td>411121</td><td>Reagent; Cuidado - tóxico</td></tr><tr><td>Ketamidor</td><td>Richterpharma</td><td>CN: 580393,7 630/01/12 Dfvf</td><td>Reagente</td></tr><tr><td>Laser Doppler perfusão imager moorLDI2-HIR</td><td>MoorLDI-V6.0, Moor Instruments Ltd, Axminster, Reino Unido</td><td>5710</td><td></td></tr><tr><td>Instrumento Leica DM2500 microscópio de campo claro vertical</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>Instrumento</td></tr><tr><td>Medetor</td><td>Virbac</td><td>037/01/07RFVPT</td><td>Reagente</td></tr><tr><td>metanol</td><td>VWR</td><td>UN1230</td><td>Reagente; Cuidado - reagente</td></tr><tr><td>Papaverine</td><td>Labesfal</td><td></td><td></td></tr> tóxico e altamente inflamável <tr><td>Pentano Isso</td><td>Merk</td><td>1060561000</td><td>Reagent; Cuidado - altamente inflamável</td></tr><tr><td>Power SYBR&reg; Green</td><td>Applied Biosystems</td><td>4309155</td><td></td></tr><tr><td>Reagente Purificado rato anti-rato CD31</td><td>Pharmingen</td><td>550274</td><td></td></tr><tr><td>Reagente RNeasy Micro kit</td><td>Qiagen</td><td>74004</td><td>Reagente</td></tr><tr><td>Surgic-Pro 6.0</td><td>Medtronic (Coviden)</td><td>VP733X</td><td>Sutura</td></tr><tr><td>VECTASTAIN ABC HRP Kit (Peroxidase, IgG de Rato)</td><td>Kit Vectastain ABC; Vector Laboratories</td><td>PK-4004</td><td>Reagente</td></tr><tr><td>Vicryl5.0 / Vicryl 6.0</td><td>Medtronic (Covidien)</td> <td>UL202 / UL101</td><td>Sutura</td></tr><tr><td>Zeiss PALM MicroBeam Sistema de Microdissecção a Laser</td><td>Carl Zeiss, Alemanha</td><td>1023290916</td><td>Instrumento</td></tr><tr><td>Microscópio estereotáxico</td><td>Carl Zeiss Microscopy, Alemanha</td><td></td><td>Instrumento</td></tr><tr><td>Câmera digital</td><td>Linux</td><td></td><td>instrumento</td></tr></tbody></table>

avaliando a angiogênese terapêutica em um modelo murino de isquemia retromembro

Assessing Therapeutic Angiogenesis in a Murine Model of Hindlimb Ischemia

A isquemia crítica do membro (CLI) é uma condição séria que implique um risco elevado de uma amputação mais baixa do membro. Apesar da revascularização ser a terapia padrão-ouro, um número considerável de pacientes com CLI não é adequado para revascularização cirúrgica ou endovascular. As terapias angiogénicas estão emergindo como uma opção para estes pacientes mas estão atualmente ainda a investigação. Antes da aplicação em seres humanos, essas terapias devem ser testadas em modelos animais e seus mecanismos devem ser claramente compreendidos. Um modelo animal da isquemia do hindmembro (HLI) foi desenvolvido pela ligadura e pela excisão das artérias ilíacas e femoral externas longe do ponto de origem e das veias nos ratos. Um painel detalhado dos testes foi montado para avaliar os efeitos da isquemia e de terapias angiogênico putativo em níveis funcionais, histologic e moleculars. O laser Doppler foi utilizado para a mensuração do fluxo e avaliação funcional da perfusão. A resposta tecidual foi avaliada pela análise da densidade capilar após coloração com o anticorpo CD31 em cortes histológicos do músculo gastrocnêmio e pela mensuração da densidade de vasos colaterais após a diaphonização. A expressão de genes angiogênicos foi quantificada por RT-PCR visando fatores angiogênicos selecionados exclusivamente em células endoteliais (ECS) após microdissecção de captura a laser de músculos gastrocnêmio de camundongos. Esses métodos foram sensíveis na identificação de diferenças entre os membros isquêmicos e não isquêmicos e entre os membros tratados e não tratados. Este protocolo fornece um modelo reprodutível de CLI e uma estrutura para testar terapias angiogênico.

Usando o protocolo descrito, as pilhas de haste mesenquimais do cabo de cordão umbilical e a radiação ionizante da baixo-dose (ldir) foram testadas como terapias angiogénicas putativo 11,12. As leituras da perfusão do laser Doppler foram obtidas antes da indução da isquemia e em temporais pré-especificados que variam de imediatamente após a indução da isquemia a 45 dias após a isquemia. As leituras de perfusão tecidual por Doppler laser foram registradas como ima...

Aqui, é apresentado um modelo experimental de isquemia do membro posterior crítico, seguido de uma bateria de testes funcionais, histológicos e moleculares para avaliar a efetividade das terapias angiogênicas.

Avaliando a angiogênese terapêutica em um modelo murino de isquemia Retromembro

Critical limb ischemia (CLI) is a serious condition that entails a high risk of lower limb amputation. Despite revascularization being the gold-standard ...

O objetivo geral deste experimento, nosso modelo de isquemia hindlimb é iluminar o experimento como base para uma avaliação abrangente dos efeitos funcionais, histológicos e moleculares dos agentes angiogênicos putativos. Este protocolo é um padrão para o teste de possíveis terapias angiogênicas em um pequeno modelo animal com potencial para aplicações futuras no contexto clínico. Como a revascularização não é adequada em vinte a trinta por cento dos pacientes críticos de isquemia A angiogênese terapêutica surgiu como uma nova estratégia para melhorar a profusão sanguínea no sítio isquêmico.Este protocolo experimental poderia fornecer uma compreensão abrangente dos mecanismos pelos quais as terapias angiogênicas exercem seus efeitos na medida de sua eficácia em cada um de seus desfechos. Depois de confirmar a falta de resposta ao aperto do dedo do pé em um rato preto C57 de 22 semanas, raspe o cabelo da plataforma traseira direita e fixe o animal na posição dorsal para cubitus em uma almofada aquecida. Coloque o animal sob um microscópio dissecando.E use uma lâmina de bisturi cirúrgica número onze para fazer uma incisão de pele de um centímetro sobre a coxa da parte traseira direita. Dissecar a gordura subcutânea para expor o feixe neurovascular. E use fórceps pontiagudas, tesouras de mola e um suporte de agulha oftálmica para abrir a bainha ileofemoral membrana para expor os vasos ilímicos externos distal e femorais.Após dissecar e separar a artéria e a veia do nervo, use sete suturas de polipropileno nãoabsorbáveis O para ligar a artéria femoral distal e a veia e a artéria ilíaca externa distal. A identificação da artéria ilíaca externa distal e a ligadura e excisão da artéria e veias distal externas ilíacas e femorais são fundamentais para o sucesso do procedimento. Use a tesoura de mola para transectar o segmento da artéria iliofemoral e veias entre os nós distal e proximal.E feche a incisão com uma sutura absorvível. Em seguida, inter-peritoneally entregar solução antisedativa no animal e devolver o rato para sua gaiola de origem com monitoramento até a recuperação completa. Para colher os músculos gastrocnemius, remova a pele de ambos os barras.E use o cotonete para separar a pele dos músculos. Segurando o tendão de aquiles, use a tesoura de mola para separar o músculo da tíbia e da fíbula até a articulação do joelho. E separar o bíceps femoris do músculo gastrocnemius.Use a tesoura de mola para cortar as inserções do músculo gastrocnemius no nível articular do joelho. E use 10% de trigasanto para posicionar os músculos colhidos em uma orientação transversal em um pequeno disco de cortiça. Em seguida, congele as amostras em isóperia resfriada de nitrogênio líquido por menos 80 graus Celsius de armazenamento.Para captura de laser de microdisseção capilar, depois de obter 12 seções de micrômetros das amostras musculares, fixar os tecidos nas lâminas em 50 mililitros de acetona pura resfriado por cinco minutos a menos vinte graus Celsius. Após a secagem do ar e circule cada espécime com uma caneta hidrofóbica. E reidratar as amostras com dois cloreto de sódio molar em PBS a quatro graus Celsius.Ao final da re-hidratação, rotule as amostras com o anticorpo primário apropriado de interesse a quatro graus Celsius durante a noite. Seguido por duas lavagens de três minutos em dois cloretos de sódio molar fresco em PBS por lavagem. Após a segunda lavagem, rotule as seções com um anticorpo secundário apropriado por trinta minutos a quatro graus celsius seguido de duas lavagens em cloreto de sódio em PBS, como demonstrado.Em seguida, rotule as amostras com complexo de peroxidase conjugado avidin por trinta minutos a quatro graus celsius. Seguido de uma lavagem e cinco minutos de rotulagem com substrato de peroxidase DAB. Ao final da incubação, desidratar os tecidos em gelo sequencial frio 90% etanol e emersions 100% etanol.Em seguida, use um sistema de microdissecção posterior, equipado com um pulso para sólido laser de 355 nanômetros para dissecar 10.000 capilares por rato e catapultar os capilares dissecados em uma tampa adesiva do tubo de microfuge. Como ilustrado, uma perda completa de perfusão de grão-de-perna traseira é observada imediatamente após a indução da isquemia hindlimb. A avaliação quantitativa do fluxo sanguíneo, expressa como uma razão do MEMBRO ISC para o NISC, demonstrou uma perfusão de sangue de membro significativamente melhorada em camundongos expostos ao estímulo pró-angiogênico nos dias 15 e 45 pós-HLI.A quantificação de capilares positivos CD31 em seções histológicas de seções de tecido muscular gastrocnemius mostra que a densidade capilar é maior no membro isquêmico versus não isquêmico. Como esperado. Mas esse efeito é ainda mais amplificado após o tratamento com o agente pró-angiogênico.A densidade do vaso colateral também aumenta consistentemente no membro isquêmico e esse aumento é significativamente maior após a exposição com o estímulo pró-angiogênico. A análise de reação em cadeia de transcriptase reversa da expressão genética pró-angiogênica nas células endoteliais positivas do CD31 demonstra uma clara variação na expressão genética entre camundongos expostos ou não ao agente pró-angiogênico. É importante usar uma agulha oftálmica mais antiga para abrir a bainha iliofemoral membrana para evitar o rompimento da artéria e da veia durante a dissecção do vaso.O vaso responde à isquemia de subida traseira no prontamente avaliado por medições de perfusão baseadas em doppler laser e a quantificação histológica da densidade do vaso capilar nos permite avaliar a angiogênese.

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Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

O procedimento cirúrgico para a indução de isquemia hindlimb unilateral é demonstrada, com a confirmação de isquemia por laser Doppler imagens de perfusão.

Modelo murino de isquemia dos membros posteriores

Adulto normal tecido vascularizado mamíferos que carece de angiogênese fisiológica e que não tenha sido exposto a uma intervenção cirúrgica é usado para estudar: (i) o início e desenvolvimento da angiogênese após a administração intraperitoneal de agentes de teste, e (ii) a modificação da angiogênese após a administração sistêmica de selecionados agentes de teste.

Rat Assay Angiogenesis Mesentery

Comece com um rato submetido à oclusão da artéria cerebral média, um procedimento cirúrgico que bloqueia temporariamente o fluxo sanguíneo para o tecido cerebral.Isso induz um acidente vascular cerebral isquêmico, levando a danos no tecido cerebral.Em seguida, remova o bloqueio para restaurar o fluxo sanguíneo.Selecione ratos que apresentem déficits neurológicos para garantir a relevância do estudo.Em seguida, administre a droga de teste ao grupo experimental enquanto injeta solução salina no...

Avaliando os efeitos da angiogênese de um medicamento de teste em um modelo de rato de AVC isquêmico

Nós demonstramos um modelo de ligadura arterial novel no músculo spinotrapezius murino, incluindo um procedimento passo-a-passo e uma descrição da instrumentação necessária. Descrevemos a cirurgia e avaliação dos resultados relevantes referentes à remodelação da rede vascular e vasodilatação funcional usando microscopia intravital e confocal.

Modelo Spinotrapezius murino para avaliar o impacto da ligadura arteriolar em função microvascular e Remodelação

Osmótica Drug Delivery para hindlimbs isquêmicos e perfusão da vasculatura com Microfil para Micro-tomografia computadorizada

Descreve-se o método de células-tronco de programação para superexpressão fatores terapêuticos para angiogênese utilizando nanopartículas poliméricas biodegradáveis. Processos descritos incluem a síntese do polímero, a transfecção de células estaminais derivadas de tecido adiposo, in vitro, e para validar a eficácia das células estaminais programadas para promover a angiogénese num modelo de isquemia dos membros posteriores de murino.

Células-tronco de programação para Therapeutic angiogênese Usando nanopartículas poliméricas biodegradáveis

A indução cirúrgica de isquemia de membros posteriores no camundongo é útil para examinar a angiogênese, no entanto, isso está comprometido em certas linhagens de camundongos que exibem necrose tecidual induzida por isquemia acentuada. São descritos métodos para induzir isquemia subaguda de membros usando constritores ameróides para contornar esse problema por meio da indução de oclusão arterial gradual.

Métodos para aguda e subaguda Murino dos membros posteriores Isquemia

Os monócitos são importantes mediadores de arteriogenesis no contexto da doença arterial periférica. Usando uma membrana basal, como matriz e microscopia intravital, este protocolo investiga monócito homing e relacionados ao tumor angiogênese após injeção de monócitos no modelo murino de ligadura de artéria femoral.

Microscopia intravital de monócitos Homing e angiogênese relacionados ao Tumor em um modelo murino de Doença Arterial periférica

Nós descrevemos um procedimento cirúrgico usado para induzir a isquemia periférica nos coelhos com hiperlipidemia e diabetes. Esta cirurgia actua como um modelo pré-clínico para as circunstâncias experimentadas na doença de artéria periférica nos pacientes. A angiografia também é descrita como um meio de medir a extensão da isquemia introduzida e a recuperação da perfusão.

Modelo pré-clínico de isquemia de membros posteriores em coelhos diabéticos

Este artigo demonstra uma abordagem cirúrgica eficiente para estabelecer isquemia aguda em camundongos com uma pequena incisão. Essa abordagem pode ser aplicada pela maioria dos grupos de pesquisa sem quaisquer atualizações laboratoriais.

Um modelo cirúrgico modificado de isquemia de membros traseiros em ApoE-/- Ratos usando uma incisão em miniatura

O presente protocolo descreve um modelo único e clinicamente relevante de doença arterial periférica que combina artéria femoral e eletrocoagulação venosa com a administração de um inibidor de sinthase de óxido nítrico para induzir gangrena de copulxina em camundongos FVB. A perfusão II intracardiac é então usada para imagens tridimensionais de alta resolução da vasculatura do footpad.

Imagem tridimensional de alta resolução da Vasculatura do Footpad em um Modelo de Gangrena Hindlimb Murine

Aprenda a avaliar terapias angiogênicas em modelo murino de isquemia do membro posterior usando camundongos C57BL/6. Este protocolo permite análises funcionais, histológicas e moleculares para compreender mecanismos de revascularização.

Avaliando a angiogênese terapêutica em um modelo murino de isquemia Retromembro

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