Name: Avaliação da estabilidade do armazenamento de vesículas extracelulares (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-22T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Aprenda a avaliar a estabilidade de vesículas extracelulares usando glucuronidase como marcador exógeno e AF4 para purificação suave. Este protocolo permite comparar a capacidade de armazenamento de vesículas de diferentes células.

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O programa de pesquisa Júnior NanoMatFutur do Ministério Federal da educação e pesquisa, Alemanha (Grant Number 13XP5029A) apoiou este trabalho. Maximilian Richter foi apoiado por Studienstiftung des Deutschen Volkes (Fundação alemã de bolsas acadêmicas) através de uma bolsa de doutorado.

1. cultura celular e produção de meio celular-condicionado
<ol><li>Geralmente, cultivar as células as condições individuais necessárias para a respectiva linha celular.</li>
	<li>Cultivar as células para 24-72 h em condições livres de soro ou em meio contendo soro bovino fetal empobrecido EV (FBS). Nota: se for utilizado FBS empobrecido EV, empregar um método comprovado para esgotar eficientemente o soro, para evitar a contaminação com soro-derivado de bovinos EVs26.</li>
	<li>Colete o meio dos frascos. Centrifugador em 300 x g por 10 min para pellet as células. Colete com cuidado o meio celular-condicionado (CCM), sem perturbar as células peletizadas. De preferência, use o CCM diretamente, ou armazene-o durante a noite a 4 ° c. Nota: é sempre preferível usar o CCM recentemente produzido. Se o armazenamento por períodos de tempo mais longos não puder ser contornado, todos os parâmetros relevantes devem ser gravados de acordo com as diretrizes do MISEV201826, e os potenciais vieses dos resultados adquiridos precisam ser levados em consideração.</li>
	<li>Exemplo de protocolo para HUVECs<ol>
<li>Cultivar células HUVEC para 120 h em meio EGM-2 contendo FBS e outros suplementos.</li>
		<li>Cultivar células HUVEC para 48 h no meio basal EBM-2 livre de quaisquer suplementos adicionais.</li>
		<li>Recolher o meio dos frascos e executar a etapa de centrifugação como indicado acima (passo 1,3). Normalmente, use 100 mL de meio para um isolamento de EV.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. ultracentlee de CCM
<ol><li>Imediatamente antes de ultracentlee (UC), centrifugue o CCM por 15 min a 3.000 x g e 4 ° c para remover detritos celulares e grandes aglomerados.</li>
	<li>Transfira cuidadosamente o sobrenadante para os tubos UC. Se estiver usando um rotor de ângulo fixo, marque a orientação dos tubos na centrífuga para facilitar a recuperação do pellet EV após a UC. Centrifugador para 2 h em 120.000 x g, com um k-factor de 259,4.</li>
	<li>Após UC, elimine com cuidado o sobrenadante usando um Pipet sorológicos, para evitar o distúrbio dos EVS peletizada. Nota: o pellet pode ser invisível.</li>
	<li>Adicionar 200 μL de soro fisiológico tamponado com fosfato de 0,2 μm (PBS) ao primeiro tubo e utilizar PBS e o sobrenadante residual para ressuscitar o pellet através de pipetagem para cima e para baixo. Transfira a suspensão EV resultante para o tubo seguinte da respectiva amostra e utilize-a para a repensão. Proceda desta forma para suspender todos os EVs da amostra num volume final de aproximadamente 300-350 μL.</li>
	<li>Após a ressuspensão, confirme a presença de partículas por análise de rastreamento de nanopartículas (NTA). Use as configurações otimizadas para o tipo de EV determinado, como as configurações abaixo (etapa 2.5.1). Nota: os artigos de Gardiner et al.27 e vestad et al.28 contêm informações valiosas sobre como otimizar os parâmetros de medição de EVS.<ol>
<li>Para reproduzir os resultados descritos abaixo, utilize instrumentos (por exemplo, NanoSight LM14) equipados com um laser verde. Gravar três vídeos de 30 s com um ganho de tela de 1,0 e um nível de câmera de 13. Para análise, use um ganho de tela de 1,0 e um limiar de detecção de 5.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Use o pellet imediatamente, se possível; caso contrário, guarde-o a 4 ° c durante a noite.</li>
</ol>3. encapsulamento de glucuronidase em EVs
<ol><li>Ao pellet ressoado, adicionar beta-glucuronidase (10 mg/mL em PBS) a uma concentração final de 1,5 mg/mL e saponina (10 mg/mL em H2o) a uma concentração final de 0,1 mg/ml. Misture bem por vortexing para 3 s.</li>
	<li>Incubar durante 10 min à temperatura ambiente com a mistura intermitida, sacudendo suavemente o tubo. Após a incubação, purificar diretamente por cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) (ver secção 5). Nota: não recongelar amostras de glucuronidase uma vez descongeladas, para evitar a degradação da enzima devido ao congelamento.</li>
</ol>4. liposome produção
<ol><li>Para preparar os lipossomas para comparação com EVs, dissolva 1,2-dimyristoyl-SN-glycero-3-fosfocolina (dmpc) e 1,2-dipalmitoyl-SN-glicero-3-FOSFOCOLINA (DPPC) em uma ração molar 2:3 em clorofórmio a uma concentração final de 5 mm. Prepare alíquotas de 1 mL em frascos de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) e deixe-os secar durante a noite para formar um filme lipídico. Cuidado: o clorofórmio é tóxico e suspeita de ser cancerogênico. Tome as devidas precauções ao manusear.</li>
	<li>Rehidrate o filme lipídico com 1 mL de PBS contendo 1,5 mg/mL de glucuronidase. Aqueça-o a 42 ° c e Vortex por 1 min. Aqueça o conjunto da extrusora a 42 ° c e extrusão a suspensão lipídica 11X através de uma membrana de policarbonato de 200 nm. Purificar diretamente pela SEC (ver secção 5).</li>
</ol>5. purificação por SEC
<ol><li>Prepare a coluna SEC usando o seguinte protocolo.<ol>
<li>Use apenas água purificada fresca e tampões preparados na hora. Filtrar todos os buffers através de um filtro de membrana de 0,2 μm e Degas-los para evitar a formação de bolhas de ar na coluna.</li>
		<li>Para a preparação de uma coluna SEC, use a matriz baseada em filtração em gel de agarose (por exemplo, Sepharose CL-2B) ou outro meio SEC adequado para separar EVs e lipossomas de impurezas proteicas e excesso de enzima. Primeiro, retire a solução de 20% EtOH que o meio é armazenado, para evitar a formação de bolhas de ar na coluna. Para este fim, centrifugue o meio SEC em 3.000 x g por 10 min, retire o EtOH e substitua-o por água desgaseificada.</li>
		<li>Encha uma coluna de vidro (com um diâmetro interno de 10 mm) com o meio SEC para a marca de 15 mL. Observação: os volumes serão diferentes para colunas com dimensões diferentes. Certifique-se de deixar o gel resolver completamente.</li>
		<li>Antes de uma corrida, equilibram a coluna com pelo menos dois volumes de coluna de PBS. Para armazenar a coluna, primeiro lave-a com um volume de coluna de água, seguido de pelo menos dois volumes de coluna de 20% de EtOH. Após o armazenamento, lave a coluna primeiro com um volume de coluna de água antes de equilibrar com PBS.</li>
		<li>Use até 400 μL de EV ou suspensão lipossomas em uma separação. Colete frações de 1 mL. Após a SEC, armazene os EVs purificados (ver secção 7) ou sujei-os a um ensaio de glucuronidase (ver secção 6).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Confirme a separação de EVs e lipossomas de proteínas contaminantes e glucuronidase livre. Para tanto, correlacionar as concentrações de partículas das frações coletadas com a concentração proteica e a atividade da glucuronidase.<ol>
<li>Avaliar a concentração de partículas por NTA (ver 2,5)</li>
		<li>Avaliar o teor de proteínas por ensaio de ácido bicinchonínico (BCA) ou outro ensaio adequado de quantificação de proteínas. Realize o ensaio de acordo com o protocolo do fabricante.</li>
		<li>Avaliar a atividade da glucuronidase pelo ensaio de glucuronidase (ver secção 6).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Opcionalmente, avalie a morfologia do EV por microscopia eletrônica de transmissão (TEM) e microscopia eletrônica de varredura (MEV).<ol>
<li>Para a preparação de amostras de TEM, adicione 10 μL de suspensão EV a uma grelha TEM, incubar durante 10 min e, em seguida, limpe qualquer excesso de líquido utilizando um papel de filtro. Realize a fixação por 10 min com 10 μL de paraformaldeído a 4% e afaste qualquer excesso. Lave 3x com água. Manchar as vesículas em 20 s de incubação com 30 μL de 1% de ácido fosfórico-tungstic hidrato. Depois de blotting afastado o excesso, seque as vesículas durante a noite. Visualize por TEM. Cuidado: o ácido fosfórico é altamente cáustico; assim, proteger a pele e os olhos.</li>
		<li>Para o SEM, fixe as amostras previamente preparadas do TEM em discos de carbono e Sputter-as com uma camada grossa do ouro de 50 nanômetro. Visualize por SEM.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. ensaio de glucuronidase
<ol><li>Para permitir uma comparação entre diferentes amostras e condições de armazenamento, correlacionando o número de partículas e a atividade enzimática, primeiro meça a concentração de partículas da amostra por NTA (ver etapa 2,5).</li>
	<li>Prepare uma solução de trabalho de fluoresceina di-β-D-glucuronida adicionando 1 μL do composto (10 mg/mL em H2o) a 199 ΜL de PBS. Adicionar 25 μL desta solução a 125 μL de EVs purificados para obter uma concentração final de 8,3 μg/mL. Pipet a amostra em uma placa 96-well preta. Medir o ponto de tempo 0 h com um leitor de chapa, usando 480 nm como excitação e 516 nm como comprimento de onda de emissão.</li>
	<li>Cubra a placa firmemente (por exemplo, com a folha plástica transparente usada para placas do PCR) para minimizar a evaporação e incubar no escuro por 18 h em 37 ° c. Meça a produção da fluoresceina usando os parâmetros do leitor da placa alistados na etapa 6,2.</li>
</ol>7. armazenamento de EVs e lipossomas
Nota: para todas as finalidades do armazenamento, é aconselhável usar os tubos Low-Binding para reduzir a perda do EV devido à adsorção.
<ol><li>Siga os parâmetros nesta seção para reproduzir os resultados representativos abaixo. Utilize amostras compostas por 400 μL de suspensão de EV.<ol>
<li>Armazene a 4 ° c ou-80 ° c ou prossiga para as etapas listadas abaixo.</li>
		<li>Liofililize os EVs.<ol>
<li>Adicionar trealose (40 mg/ml em H2o) até uma concentração final de 4 mg/ml para os EVS purificados. Congelar as amostras a-80 ° c durante pelo menos 1 h.</li>
			<li>Liofililize as amostras usando os seguintes parâmetros. Para a secagem principal, ajuste a temperatura da prateleira a 15 ° c e a pressão a 0,180 mbar e deixe as amostras para secar por 46 h. Para a secagem final, ajuste a temperatura da prateleira a 25 ° c e a pressão a 0, 35 mbar e deixe as amostras para secar por 2 h. Guarde as amostras liofilizadas a 4 ° c.</li>
			<li>Para Rehidratar as amostras, adicionar H2o, igual à quantidade de EV suspensão presente no início (tipicamente, 400 μL). Não utilize nenhum tampão para reidratação.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. análise após o armazenamento
<ol><li>Para avaliar a atividade enzimática, primeiro remova a glucuronidase livre, que pode ter vazado dos EVs durante o armazenamento. Consiga isto por uma etapa adicional da purificação que seja realizada pelo SEC (veja a etapa 5) ou pelo fraccionamento do fluxo de campo assimétrico do fluxo (AF4) (veja a etapa 8.1.2). Nota: Informamos que ambos os métodos levam a uma diluição da amostra EV; assim, use concentrações suficientes de EV antes do armazenamento para evitar mover-se abaixo do limite de quantificação de NTA. Espere uma diluição 1:10 das partículas devido ao SEC ou ao AF4.<ol>
<li>Para a purificação da SEC, siga o protocolo descrito acima (ver secção 5).</li>
		<li>Realize a purificação AF4.<ol>
<li>Configure o instrumento usando um pequeno canal com um espaçador de 350 μm e uma membrana de celulose de corte de peso molecular de 30 kD. Coloque um filtro de tamanho de poros de 0,1 μm entre a bomba HPLC e o canal AF4. Use a PBS filtrada recentemente preparada 0,1 μm como a fase móvel para reduzir a carga e o ruído da partícula nos detectores da luz-espalhamento.</li>
			<li>Detecte proteínas utilizando um detector UV definido para 280 nm. Para detectar partículas, use espalhamento de luz multiangular com o laser definido para 658 nm.</li>
			<li>Use o seguinte método de execução. Pre-Focus para 1 minuto com um fluxo do foco de 1 mL/min; em seguida, injete 300 μL da amostra a uma taxa de 0,2 mL/min e mantenha o fluxo de focagem durante 10 min. Após a injeção, eluir a amostra em 1 ml/min ao aplicar um fluxo transversal que diminua de 2 ml/min a 0,1 ml/min ao longo de 8 min. eluir por outro 10 min sem fluxo cruzado. Colete frações de 1 mL, começando após 12,5 min e continuando até 27 min.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Realize o ensaio de glucuronidase como descrito acima (ver secção 6).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para avaliar o tamanho e a concentração, use o NTA como descrito acima (ver passo 2,5).</li>
	<li>Opcionalmente, execute TEM e SEM para avaliar a morfologia dos EVs após o armazenamento (ver 5,3).</li>
</ol>

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<li>Bhattacharjee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DLS+and+zeta+potential+-+What+they+are+and+what+they+are+not%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">DLS and zeta potential - What they are and what they are not.</a> Journal of Controlled Release. 235, 337-351 (2016).</li>
<li>Van Deun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+disparate+isolation+methods+for+extracellular+vesicles+on+downstream+RNA+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 24858(2014).</li>
<li>Taylor, D. D., Shah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+isolating+extracellular+vesicles+impact+down-stream+analyses+of+their+cargoes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes.</a> Methods. 87, 3-10 (2015).</li>
<li>Patel, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+cell+culture+parameters+on+production+and+vascularization+bioactivity+of+mesenchymal+stem+cell-derived+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Bioengineering+%26+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Impact of cell culture parameters on production and vascularization bioactivity of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles.</a> Bioengineering & Translational Medicine. 2 (2), 170-179 (2017).</li>
<li>Gardiner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+used+for+the+isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicles%3A+results+of+a+worldwide+survey%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 5 (1), 32945(2016).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+distinct+nanoparticles+and+subsets+of+extracellular+vesicles+by+asymmetric+flow+field-flow+fractionation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification of distinct nanoparticles and subsets of extracellular vesicles by asymmetric flow field-flow fractionation.</a> Nature Cell Biology. 20 (3), 332-343 (2018).</li>
<li>Linares, R., Tan, S., Gounou, C., Arraud, N., Brisson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+centrifugation+induces+aggregation+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">High-speed centrifugation induces aggregation of extracellular vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4 (1), 29509(2015).</li>
<li>Lobb, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+exosome+isolation+protocol+for+cell+culture+supernatant+and+human+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27031(2015).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Neste manuscrito, apresentamos um protocolo abrangente para estudar a estabilidade dos EVs diferentes condições de armazenagem. Com a combinação de glucuronidase encapsulado como um leitura funcional e a avaliação dos parâmetros físico-químicas dos EVS, o protocolo permite uma avaliação de estabilidade de armazenamento direta de EVS e a comparação de EVS da pilha diferente Linhas. SEM e TEM como métodos complementares permitem uma introspecção em mudanças dos EVs no nível da único-partícula. Os resultados aqui apresentad...

Os EVs são nanopartículas ligadas à membrana produzidas por quase todos os tipos de células. Para as células de mamíferos, os EVS podem ser subdivididos em dois grupos principais com distintas viasdeprodução1,2. As vesículas da membrana, com uma escala do tamanho de aproximadamente 100-1000 nanômetro, são produzidas pelo brotamento direto da membrana de pilha. Os exosomas, de tamanho 30-200 nm, são derivados de corpos multivesiculares formados por brotamento interno em endosomas que posteriormente se fundem com a membrana celular para liberar vários exosomas de uma só vez. A principal função dessas vesículas é o transporte de informações entre as células3. Para esta finalidade, as cargas tais como o RNA, o ADN, e as proteínas são classificadas ativamente neles. Os EVs podem transmitir uma variedade de efeitos sobre seus alvos, com implicações tanto para a saúde quanto para o estado da doença. De um lado, eles mediam efeitos positivos como regeneração tecidual, apresentação de antígenos ou efeitos de antibióticos, o que os torna alvos auspiciosos para seu desenvolvimento como terapêutica4,5. Por outro lado, os EVs podem promover a vascularização tumoral6, induzir efeitos de espectador nas respostas de estresse7, podendo desempenhar um papel nas doenças auto-imunes8 e doenças inflamatórias9. Assim, eles podem ser um componente-chave para uma melhor compreensão de muitos efeitos patológicos. No entanto, a presença de EVS alterados em doenças múltiplas, como câncer10,11,12 e distúrbios cardiovasculares13, e sua fácil acessibilidade no sangue e na urina os torna ideais Biomarcadores. Finalmente, a sua boa biocompatibilidade14 e sua capacidade de segmentação inerente fazer EVS também interessante para a entrega de drogas15. Neste manuscrito, descrevemos um protocolo para a avaliação da estabilidade de armazenamento de EVs derivados de células de mamíferos, uma importante propriedade que ainda é pouco investigada.
Para o desenvolvimento clínico de EVS, ainda existem muitos obstáculos para superar16, incluindo a avaliação de seus efeitos terapêuticos, produção, purificação e armazenamento17. Enquanto-80 ° c é amplamente visto como o padrão de ouro para o armazenamento de EV18, os congeladores necessários são caros, e manter a cadeia de frio necessária a partir da produção para o paciente pode ser desafiador. Além disso, alguns relatórios indicam que o armazenamento em-80 ° c ainda não preserva otimamente EVS e induz uma perda na funcionalidade de EV19,20. Outros métodos, como liofilização21,22 ou spray-secagem23, têm sido propostos como alternativas potenciais para o armazenamento congelado de EVS.
A maneira ideal de avaliar a estabilidade do armazenamento seria testar os EVs em ensaios funcionais ou pela avaliação de um marcador específico, por exemplo, sua atividade antibacteriana19. Isso é possível quando o efeito desejado das vesículas é conhecido e quando um grupo distinto de EVs deve ser estudado. Se os EVs de diferentes fontes de células forem comparados (por exemplo, para encapsulamento de drogas) ou se não houver leitura funcional conhecida, não será mais possível avaliar as alterações devidas ao armazenamento de forma direta.
Por outro lado, a simples avaliação de alterações em seus parâmetros físico-químicos, como tamanho, recuperação de partículas e concentração proteica, nem sempre prediz mudanças na atividade de EV, como foi demonstrado em uma patente recente20.
Aqui, nós fornecemos um protocolo prontamente aplicável para medir a estabilidade do armazenamento de EVS avaliando seus parâmetros físico-químicas combinados com a atividade de uma enzima encapsulada da beta-glucuronidase como um substituto para a carga dos EVS. O carregamento da enzima é feito por incubação de saponina, um método leve estabelecido com EVS de diferentes fontes21,24,25. A saponina forma poros transitórios na membrana EV, o que permite a absorção enzimática na vesícula. Como as enzimas são propensas a perder sua atividade se submetido a condições de armazenamento desfavorável, eles são um substituto ideal para a avaliação da preservação das cargas funcionais dos EVs.
Nós demonstramos que a aplicação deste protocolo aos EVS derivados das pilhas de haste mesenquimais humanas (MSCS), das pilhas endothelial humanas da veia de cordão umbilical (HUVECs), e das pilhas epithelial alveolares humanas do adenocarcinoma (A549) resulta certamente em grandes diferenças na estabilidade de armazenamento entre diferentes linhas celulares, que devem ser levados em consideração ao escolher a fonte EV21.

<table><tbody><tr><td>1,2 dimiristol-sn glicero-3-fosfo-colina (DMPC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2663-25MG</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfo-colina (DPPC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4329-25MG</td><td></td></tr><tr><td>225 cm&sup2; frascos de cultura de células</td><td>Corning</td><td>431082</td><td>Usado com 25 ml de membrana de</td></tr><tr><td>celulose regenerada média de 30</td><td>kDa Wyatt Technology Europe</td><td>1854</td><td></td></tr><tr><td>350 &micro; m espaçador</td><td>Wyatt Technology Europe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coletor de frações automatizado</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beta-glucuronidase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7646-100KU</td><td></td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>Fisher scientific</td><td>C / 4966/17</td><td></td></tr><tr><td>Forno de coluna</td><td>Hitachi High-Technologies Europe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Trealose di-hidratada</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9531-10G</td><td></td></tr><tr><td>DAWN HELEOS II, Detector de Dispersão de Luz Multi-ângulo</td><td>&nbsp; Filtro de membrana Durapore da Wyatt Technology Europe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, PVDF,&nbsp; 0,1&nbsp; &micro; m, 47&nbsp; mm</td><td>Merck</td><td>VVLP04700</td><td>Usado para a preparação de buffers para AF4</td></tr><tr><td>EBM-2</td><td>Lonza Verviers, S.p.r.</td><td>CC-3156</td><td>Crescimento de células endoteliais meio basal, usado para a cultura livre de soro de células HUVEC</td></tr><tr><td>Eclipse dualtec</td><td>Wyatt Technology Europe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EGM-2</td><td>Lonza Verviers, S.p.r.</td><td>CC-3162</td><td>Meio de crescimento de células endoteliais, usado para a cultura normal de células HUVEC</td></tr><tr><td>Seladores de placas ELISA</td><td>R & D Systems</td><td>DY992</td><td>usado para vedação de placas de 96 poços para o ensaio de glucuronidase</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Fisher scientific E</td><td>/ 0665DF / 17</td><td></td></tr><tr><td>Conjunto de extrusora com suporte / bloco de aquecimento</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610000-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Suporte de filtro</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610014-1EA</td><td>usado para preparação de lipossomas</td></tr><tr><td>Fluoresceína di-&beta;-D-glucoronídeo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F2915</td><td></td></tr><tr><td>Gibco PBS-tablets+CA10:F36</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18912014</td><td></td></tr><tr><td>Hettich Universal 320 R</td><td>Andreas Hettich GmbH & Co.KG</td><td></td><td>Usado para peletizar células a 300 g</td></tr><tr><td>Hettich Rotina 420 R</td><td>Andreas Hettich GmbH & Co.KG</td><td></td><td>Usado para peletizar detritos maiores a 3000 g</td></tr><tr><td>de células HUVEC</td><td>Lonza Verviers, S.p.r.</td><td>C2517A</td><td></td></tr><tr><td>Kimble&nbsp; FlexColumn 1X30CM</td><td>Kimble</td><td>420401-1030</td><td></td></tr><tr><td>Liofilizador ALPHA 2-4 LSC</td><td>Christ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge Tubes, Polipropileno</td><td>VWR international</td><td>525-0255</td><td>os tubos usados para todo o manuseio de EV, considerados mais favoráveis do que produtos comparáveis de outros fornecedores em relação à recuperação de partículas</td></tr><tr><td>Nanosight LM14 equipado com um laser verde</td><td>Malvern Pananalytical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanosight-software versão 3.1</td><td>Malvern Pananalytical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nucleopore 200 nm track-etch membranas de policarbonato</td><td>Whatman/GE Healthcare</td><td>110406</td><td>usado para preparação de lipossomas</td></tr><tr><td>PEEK Suporte de filtro em linha</td><td>Wyatt Technology Europe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hidrato de ácido fosfotúngstico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>79690-25G</td><td></td></tr><tr><td>Frascos de policarbonato para ultracentrifugação</td><td>Beckman Coulter</td><td>355622</td><td></td></tr><tr><td>QuantiPro BCA Assay Kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>QPBCA-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Saponina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>Microscopia eletrônica de varredura Zeiss EVO HD 15</td><td>Carl Zeiss AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sepharose Cl-2b</td><td>GE Healthcare</td><td>17014001</td><td></td></tr><tr><td>SEM cobre grades com filme de carbono</td><td>Plano</td><td>S160-4</td><td></td></tr><tr><td>Pequeno AF4 canal</td><td>Wyatt Technology Europe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sputter-coater Q150R ES</td><td>Quorum Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopia eletrônica de transmissão JEOL JEM 2011</td><td>Oxford Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tipo 45 Ti rotor de ultracentrifugação</td><td>Beckman Coulter</td><td>339160</td><td></td></tr><tr><td>Ultimate 3000 Amostrador automático Dionex</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultimate 3000 Bomba isocrática Dionex</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultimate 3000 Desgaseificador a vácuo online Dionex</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge OptimaTM L-90 K</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Detector UV</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Whatman 0.2 &micro; Filtro de celulose mista de tamanho de poro</td><td>M Whatman/GE Healthcare</td><td>10401712</td><td>Usado para a filtragem de todos os tampões usados com os EVs e em SEC</td></tr></tbody></table>

avaliação da estabilidade do armazenamento de vesículas extracelulares

Evaluation of the Storage Stability of Extracellular Vesicles

As vesículas extracelulares (EVs) são alvos promissores na pesquisa atual, usadas como drogas, portadores de drogas e biomarcadores. Para seu desenvolvimento clínico, não somente sua atividade farmacêutica é importante mas também sua produção precisa de ser avaliada. Neste contexto, a pesquisa concentra-se no isolamento de EVs, sua caracterização e seu armazenamento. O presente manuscrito tem como objetivo fornecer um procedimento facile para a avaliação do efeito de diferentes condições de armazenamento em EVs, sem manipulação genética ou ensaios funcionais específicos. Isto torna possível obter rapidamente uma primeira impressão da estabilidade de EVs uma condição de armazenamento dada, e os EVs derivados das fontes diferentes da pilha podem ser comparados facilmente. A medida de estabilidade baseia-se nos parâmetros físico-químicos dos EVs (tamanho, concentração de partículas e morfologia) e na preservação da atividade de sua carga. O último é avaliado pelo encapsulamento saponina-negociado do beta-glucuronidase da enzima nos EVs. Glucuronidase atua como um substituto e permite uma quantificação fácil através da clivagem de uma molécula de repórter fluorescente. O presente protocolo poderia ser uma ferramenta para os pesquisadores na busca de condições de armazenamento que otimamente reter Propriedades EV para avançar a pesquisa EV para aplicação clínica.

A Figura 1 exibe as características de armazenamento de EVS isoladas de HUVECs. Os EVs foram isolados por UC, a glucuronidase foi encapsulada e, após a SEC, os EVs purificados foram avaliados por suas propriedades físico-químicas por NTA. Uma amostra dos vesículas foi submetida subseqüentemente à purificação AF4 e a atividade do glucuronidase foi medida.
As vesículas foram então armazenadas por 7 d a 4 ° c ou-80 ° c e a 4 ° c em forma liofilizada, no último caso com a adição d...

Aqui nós apresentamos um protocolo prontamente aplicável para avaliar a estabilidade do armazenamento de vesicles extracelular, um grupo de nanopartículas naturais produzidas pelas pilhas. As vesículas são carregadas com glucuronidase como uma enzima modelo e armazenadas diferentes condições. Após o armazenamento, os seus parâmetros físico-químicos e a atividade da enzima encapsulada são avaliados.

Avaliação da estabilidade do armazenamento de vesículas extracelulares

Extracellular vesicles (EVs) are promising targets in current research, to be used as drugs, drug-carriers, and biomarkers. For their clinical ...

A estabilidade de armazenamento de vesículas celulares extras é um parâmetro importante para seu uso terapêutico prospectivo. Nosso protocolo fornece uma ferramenta prontamente aplicável para avaliar como o armazenamento afeta as vesículas. A principal vantagem de nossa técnica é que introduzindo glucuronidase como um marcador exógeno, vesículas extracelulares derivadas de diferentes células-mãe são facilmente comparadas com relação à sua armazenamento.O fracionamento do fluxo de fluxo assimétrico, ou AF4, é uma alternativa leve à purificação da cromatografia de exclusão de tamanho para compostos muito sensíveis. Porque os compostos encontram menos estresse no canal. Como a glucuronidase é uma enzima sensível, a qualidade do reside beneficia-se do planejamento minucioso e da realização das etapas de purificação e análise de volta para trás.Depois de cultivar a linha de interesse celular de acordo com as condições padrão para essas células, substitua o supernaente por meio esgotado sem soro ou extra celular e devolva as células à incubadora de cultura celular por mais 24 a 72 horas. No final da incubação, colete o super natant de cada frasco e centrífugue as amostras para sedimentar

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Este é um protocolo para isolar vesículas extracelulares do tecido (EVs) do fígado. O protocolo descreve um processo da dois-etapa que envolve a perfusão do colagenase seguida pelo ultracentlee diferencial para isolar EVS do tecido do fígado.

Isolamento de vesículas extracelulares teciduais do fígado

O protocolo descreve um método reprodutível, projetado para uso com sobrenadantes de cultura celular para detectar epítopos superficiais em pequenas vesículas extracelulares (EV). Ele utiliza a imunoprecipitação de EV específica usando grânulos juntamente com anticorpos que reconhecem o antígeno de superfície CD9, CD63 e CD81. O método é otimizado para análise de citometria de fluxo a jusante.

Fluxo Cytometric análise das vesículas extracelulares de célula-condicionado Media

O presente relatório destaca os requisitos cronológicos para o isolamento da vesícula extracelular (EV) de microglia ou macrófagos sanguíneos. Os EVs derivados de microglia foram avaliados como reguladores do crescimento do neurite, enquanto os EVs derivados do macrófago sanguíneo foram estudados no controle da invasão celular C6 glioma em ensaios in vitro. O objetivo é entender melhor essas funções de EV como mediadores imunológicos em microambientes específicos.

Caracterização de vesículas extracelulares derivadas de células imunes e estudo do impacto funcional no ambiente celular

Aqui, apresentamos um protocolo para rotular vesículas extracelulares derivadas de plaquetas para monitorar sua migração e absorção em explanações de cartilagem usadas como modelo de osteoartrite.

Rotulagem de vesículas extracelulares para monitoramento de migração e absorção em Explants de cartilagem

O presente protocolo fornece descrições detalhadas para isolamento, concentração e caracterização de vesículas extracelulares de culturas cianobacterianas. Abordagens para purificar vesículas de culturas em diferentes escalas, trocas entre metodologias e considerações para o trabalho com amostras de campo também são discutidas.

Isolamento e Caracterização de Vesículas Extracelulares Cianobacterianas

Apresentamos um protocolo para o isolamento e fratura de congelamento de vesículas extracelulares (EVs) originárias de células cancerígenas uroteliais. A técnica de fratura congelante revelou o diâmetro e a forma dos EVs e como uma característica única- a organização interna das membranas EV. Estes são de imensa importância na compreensão de como os EVs interagem com as membranas receptoras.

Microscopia eletrônica de fratura congelante para análise de vesícula extracelular

O presente protocolo descreve um método para extração de vesículas extracelulares do sangue periférico e tecidos sólidos com posterior perfilamento de antígenos de superfície e cargas proteicas.

Isolamento e Análise de Vesículas Extracelulares Rastreáveis e Funcionalizadas do Plasma e Tecidos Sólidos

Este protocolo fornece uma descrição detalhada da classificação de vesículas extracelulares (EVs) liberadas por células estromais mesenquimais. Em particular, ele se concentra na configuração do instrumento e na otimização das condições de classificação. O objetivo é classificar as vesículas extracelulares, preservando suas características.

Configurando uma classificação bem-sucedida para isolamento de vesículas extracelulares

Aqui, descrevemos as condições de cultivo in vitro , isolamento e aumento da geração de vesículas extracelulares (EVs) de Echinococcus granulosus. Os pequenos EVs foram caracterizados por espalhamento dinâmico de luz e microscopia eletrônica de transmissão. A captação por células dendríticas derivadas da medula óssea e sua modulação fenotípica foram estudadas por meio de microscopia confocal e citometria de fluxo.

Isolamento e captação de células dendríticas de pequenas vesículas extracelulares de Echinococcus granulosus

Aqui, demonstramos o método de caracterização de vesículas extracelulares (EVs) coletadas de fluidos biológicos, como lágrimas e saliva, de seres humanos. O scanner usado neste método é capaz de detectar o fenótipo, tamanho e contagem total de partículas de EVs a partir de 1 μL da amostra.

Caracterização de Vesículas Extracelulares a partir de Fluidos Biológicos

Aprenda a avaliar a estabilidade de vesículas extracelulares usando glucuronidase como marcador exógeno e AF4 para purificação suave. Este protocolo permite comparar a capacidade de armazenamento de vesículas de diferentes células.

Avaliação da estabilidade do armazenamento de vesículas extracelulares

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