Determinando a densidade do ducto biliar no fígado do rato
30 de abril de 2019
Nós apresentamos um método rather simples e sensível para a quantificação exata da densidade do colagogo no fígado do rato. Este método pode ajudar a determinar os efeitos dos modificadores genéticos e ambientais e a eficácia de terapias potenciais em modelos de camundongo de doenças biliares.
Este protocolo permite ao pesquisador quantificar o desenvolvimento de ductos biliares em modelos de camundongos de doença hepática. Também permite avaliar os efeitos dos modificadores genéticos no desenvolvimento do ducto biliar. A vantagem dessa técnica é que é um método simples, sensível e quantitativo para a avaliação direta do desenvolvimento do ducto biliar.
Para começar, com a pele esticada por fórceps, use uma pequena tesoura para fazer uma incisão transversal aproximadamente uma polegada abaixo da caixa torácica de um rato eutanizado. Exponha toda a superfície ventral do fígado. Use uma tesoura pequena para cortar cuidadosamente os ligamentos que ligam o fígado aos outros órgãos do abdômen.
Em seguida, corte o ducto biliar comum para separar o fígado do intestino. Segure-se na vesícula biliar e remova cuidadosamente o fígado. Coloque-o imediatamente em um tubo de 50 mililitros preenchido três quartos com 4% de paraformaldeído.
Para consertar o tecido hepático, incuba-o em 4% PFA a quatro graus Celsius por 48 horas. Depois de uma série de lavagem de etanol, lave o fígado com agente de compensação três vezes por 30 minutos cada um em temperatura ambiente. Para começar a incorporar, lave uma fita de tecido em um molde de tecido três vezes por 30 minutos em cera de parafina pré-superaquecida a 60 graus Celsius.
Em seguida, encha o molde de tecido com cera de parafina a três quartos de altura e mantenha-o em um bloco de aquecimento a 60 graus Celsius. Coloque o fígado no molde com o lado ventral voltado para cima. Depois de remover cuidadosamente o molde do bloco de aquecimento, coloque a parte superior do no molde.
Cubra com parafina líquida quente e deixe esfriar à temperatura ambiente durante a noite. Depois de remover o bloco hepático do molde, use um microtome para começar a se separar pelo lado dorsal superficial do fígado, fazendo cinco seções de micrômetros. Verifique as seções superficiais sob um microscópio de dissecção para garantir que as seções não sejam tesouradas ou dobradas.
Para processar slides para imunohistoquímica, selecione um slide por genótipo para ser analisado e lave-o por 15 minutos em xileno, 100% etanol, 95% etanol e, finalmente, 70% etanol. Depois de lavar o slide na água ionizada, mergulhe-o na solução de recuperação de antígeno de pH à base de Tris. Em seguida, aqueça-o sob pressão em uma panela de pressão por três minutos a 10 libras por polegada quadrada.
Depois de deixar o slide esfriar até a temperatura ambiente, use uma caneta PAP para delinear as seções no slide. Depois de lavar com PBS Tween, bloqueie as seções teciduais adicionando 100 microliters de solução de bloqueio por seção e incubar coberto a quatro graus Celsius por uma hora. Aplique 100 microlitadores da solução de anticorpos diluídos contendo todos os três anticorpos primários em cada seção e incuba-os a quatro graus Celsius durante a noite.
Após lavar as lâminas, adicione 100 microliters da solução de anticorpos secundários contendo anticorpos secundários e incubar por uma hora à temperatura ambiente. Por último, aplique meio de montagem e uma mancha de cobertura nos slides. Use um microscópio fluorescente para tirar imagens de 20x a 1x de zoom de cada seção.
Certifique-se de que todas as veias do portal através do fígado são imagens. Crie uma planilha com as seguintes colunas:Número de animais/amostra, número da imagem, número de veias do portal e número de dutos biliares. Identifique e regise o número de veias do portal por imagem para cada imagem.
Em seguida, identifique os dutos biliares patenteados em cada imagem, pela presença de cholangiocitos em torno de um lúmen definível. Essas estruturas devem ser distintas e separadas por mesenquime de outras células citokeratinas de amplo espectro. Um dos principais desafios dessa técnica é identificar dutos biliares de patente.
Determinar o que é um duto de patente requer uma análise da forma do duto e das células ao redor do lúmen. Conte cada ducto bile de patente e coloque na mesma coluna do número da imagem e repita para cada imagem venosa do portal. Finalmente, calcule a soma de todas as veias do portal e todos os dutos biliares na amostra hepática e calcule a relação biliar do ducto ao portal para a amostra hepática.
Os fígados de camundongos P30 foram seccionados e co-manchados para CK8 e CK19, juntamente com o marcador vascular, alfa-SMA, para determinar a razão BD para PV. Quando todas as veias do portal em cada lobo hepático são imagens, as veias do portal foram definidas como vasos manchados alfa-SMA que têm manchas de citoquenatina de amplo espectro adjacentes. As estruturas de manchas alfa-SMA sem citoquestina de amplo espectro foram veias centrais que foram excluídas da análise.
Os dutos de patente têm um lúmen claramente definível que é cercado por colangioctyes citokeratin-positivo de amplo espectro e geralmente são separados de dutos próximos ou cholangiocitos por mesenchyme. Células de citokeratin-positivas de amplo espectro que não têm um lúmen definível, não são contadas para o número total de dutos biliares. A seção hepática de um animal selvagem mostra uma veia portal associada a um duto totalmente patenteado, juntamente com várias células não incorporadas.
A seção hepática representativa de um animal heterozigoso JAG1 não mostra que há dutos biliares patenteados ao redor das três veias do portal. Todas as células citokeratine-positivas de amplo espectro aqui não são incorporadas e, portanto, não devem ser contadas. A análise da relação BD para PV para três animais heterozigosos de tipo selvagem e três JAG1 mostra como os dois genótipos podem ser facilmente distinguidos com base na contagem de dutos biliares.
É importante avaliar todos os vasos portais para dutos biliares. É especialmente crítico para determinar a densidade do ducto biliar se houver variabilidade fenotípica em todo o fígado. Esta técnica foi usada para identificar um supressor genético do fenótipo biliar em um modelo de rato de Helgason.
Portanto, pode ser útil na avaliação de modalidades de tratamento de modelos animais de doença biliar.
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Visão Geral
Este protocolo permite a quantificação do desenvolvimento dos ductos biliares em modelos murinos de doenças hepáticas. É um método simples, sensível e quantitativo para avaliar a densidade dos ductos biliares, o que pode auxiliar na avaliação dos efeitos genéticos e ambientais sobre doenças biliares.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Neurociência
- Biologia
- Pesquisa em Doenças Hepáticas
Contexto
- A densidade dos ductos biliares é crucial para compreender a função hepática.
- Modelos de camundongos são comumente usados para estudar doenças hepáticas.
- Modificadores genéticos podem influenciar o desenvolvimento dos ductos biliares.
- Métodos precisos de quantificação são necessários para uma pesquisa eficaz.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método para quantificar a densidade dos ductos biliares.
- Avaliar o impacto de fatores genéticos e ambientais.
- Avaliar terapias potenciais em modelos de camundongos.
Métodos Utilizados
- Incisão transversal feita abaixo da caixa torácica de um camundongo eutanasiado.
- Exposição da superfície ventral do fígado.
- Dissecação cuidadosa dos ligamentos que conectam o fígado a outros órgãos.
- Avaliação quantitativa da densidade dos ductos biliares.
Resultados Principais
- Quantificação bem-sucedida da densidade dos ductos biliares alcançada.
- O método demonstrou sensibilidade e precisão.
- Aplicações potenciais na avaliação de terapias para doenças biliares.
- Informações sobre modificadores genéticos que afetam o desenvolvimento dos ductos biliares.
Conclusões
- O método fornece uma abordagem confiável para o estudo da densidade dos ductos biliares.
- Pode facilitar pesquisas sobre influências genéticas e ambientais.
- Ferramenta promissora para avaliar intervenções terapêuticas em doenças hepáticas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A avaliação quantitativa do desenvolvimento do ducto biliar permite a redução de riscos mecanicistas em modelos pré-clínicos de doença hepática colestática. Este método apoia a validação de alvos ao fornecer uma leitura reprodutível e independente de genótipo dos fenótipos biliares. Ele facilita a triagem de portfólios ao distinguir modelos selvagens de modelos de doença com base nas razões entre ductos biliares e veias porta.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas mediante a quantificação da densidade dos ductos biliares como indicador funcional da maturação de colangiócitos.
- Valor Operacional: Oferece um ensaio padronizado baseado em microscopia para comparar o desenvolvimento biliar entre diferentes genótipos e condições experimentais.
- Valor Preditivo: Apoia a redução de riscos mecanicistas ao correlacionar modificações genéticas com fenótipos biliares em sistemas relevantes para doenças.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Gera razões quantitativas entre ductos biliares e veias porta que permitem comparação objetiva da formação da reação ductular.
- Valor Operacional: Utiliza imunomarcação para citoceratina e microscopia de luz, oferecendo um fluxo de trabalho escalável e reprodutível para análise hepática multilobar.
- Prontidão do Ensaio: Produz saídas numéricas adequadas para triagem de alto conteúdo e compartilhamento de dados entre diferentes funções.
Pesquisa Translacional e Pré-Clinica
- Valor Científico: Alinha-se a sistemas relevantes para doenças ao modelar defeitos biliares humanos em fígados de camundongos, como na síndrome de Alagille.
- Valor Operacional: Garante continuidade da descoberta à validação pré-clínica por meio de protocolos consistentes de corte e imagem.
- Avanço Ajustado ao Risco: Apoia decisões de prosseguir/não prosseguir ao quantificar a gravidade fenotípica e os efeitos supressores em modelos genéticos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra aos fluxos de trabalho da biologia de descoberta ao fornecer um ponto final quantitativo para a avaliação do desenvolvimento biliar antes da identificação do composto líder.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a elucidação de vias ao medir a densidade dos ductos biliares como um fenótipo resultante de manipulações genéticas.
- Triagem: Permite a padronização e reprodutibilidade de ensaios por meio da imagem sistemática de todas as veias porta nos lobos hepáticos.
- Análises: Fornece medidas quantitativas de variáveis dependentes (contagem de ductos biliares por veia porta) que permitem comparações estatísticas entre condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica ao modelar fenótipos de doenças biliares humanas em camundongos.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma capacidade reutilizável para avaliar toxicidade ou reparo biliar em múltiplos modelos de doenças.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao reduzir a ambiguidade na avaliação do fenótipo biliar.
- Valor Operacional: Aprimora a padronização e a reprodutibilidade por meio de procedimentos definidos de seccionamento, coloração e contagem.
- Valor Estratégico: Melhora a eficiência do capital ao permitir a eliminação precoce de riscos associados a alvos envolvidos nas vias de desenvolvimento biliar.
- Impacto no Portfólio: Orienta a priorização ajustada ao risco ao quantificar a fidelidade do modelo da doença e a resposta terapêutica.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em histologia, imuno-histoquímica e microscopia óptica para identificação precisa dos ductos biliares.
- Depende da infraestrutura de inclusão em parafina, corte em micrótomo e recuperação de antígenos.
- Necessita padronização entre equipes na aquisição de imagens e no registro de dados para garantir comparabilidade.
- As considerações para adaptação incluem a validação de anticorpos e a consistência na definição da luz em diferentes sistemas modelo.
- Limitação prática: não é possível visualizar a estrutura tridimensional da árvore biliar, limitando a avaliação à densidade ductal bidimensional.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
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Title
0:36
Mouse Liver Tissue Collection
1:19
Fixation, Paraffin Embedding, and Liver Block Sectioning
2:35
Immunohistochemistry for Wide-spectrum Cytokeratin (wsCK) and αSMA
4:08
Imaging and Quantification of Bile Ducts (BDs)
5:27
Results: Determining BD to PV Ratio
7:00
Conclusion
