Name: Olhando para fora: isolamento de cianobactérias liberado polímeros de carboidratos e proteínas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 58 s
Description: Aprenda a isolar polímeros de carboidratos e exoproteomas de cianobactérias com alta pureza. Estes protocolos adaptáveis permitem estudar mecanismos de secreção e aplicar em biotecnologia e biomedicina.

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Este trabalho foi financiado pelos fundos do Fundo Europeu de desenvolvimento regional (FEDER) através do programa de competitividade e internacionalização da 2020 concorrência (POCI), Portugal 2020 e dos fundos portugueses através da FCT-Fundação para a ciência e a tecnologia/Ministério da ciência, tecnologia e ensino superior no âmbito do projecto POCI-01-0145-FEDER-028779 e a subvenção SFRH/BD/99715/2014 (CF).

1. cianobactérias liberado isolamento de polímero de carboidratos
<ol><li>
Isolamento de polímeros e remoção de contaminantes
	<ol>
<li>Cultivar a estirpe de cianobactérias em condições padrão [por exemplo, 30 ° c uma luz de 12 h (50 μE m− 2s− 1)/12 h de regime escuro, com agitação orbital a 150 rpm]. Meça o crescimento usando protocolos padrão [por exemplo, densidade ótica em 730 nanômetro (OD730nm), clorofila a, seco-peso, etc.], a seguir mede a produção de polissacarídeos liberados de acordo com o método do ácido fenol-sulfúrico16.</li>
		<li>Transfira a cultura em membranas da diálise (12-14 kDa do corte do peso molecular) e Dialize de encontro a um mínimo de 10 volumes de água deionizada para 24 h com agitação contínua. Nota: dependendo do volume de cultura para Dialize e composição média, pode ser necessário mudar a água de diálise.</li>
		<li>Centrifugue a cultura em 15.000 x g por 15 min a 4 ° c. Transfira o sobrenadante para um novo frasco para injetáveis e elimine o pellet (células).</li>
		<li>Centrifugue novamente a 20.000 x g durante 15 min a 4 ° c para remover contaminantes como detritos de parede celular ou lipopolissacarídeos (LPs).</li>
		<li>Transfira o sobrenadante para uma taça de vidro e descarte o pellet.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Precipitação do polímero
	<ol>
<li>Adicione 2 volumes de 96% de etanol ao sobrenadante.</li>
		<li>Incubar a suspensão a 4 ° c, pelo menos durante a noite.</li>
		<li>Recuperação de polímeros<ol>
<li>Para quantidades pequenas ou não visíveis de polímero precipitado: Centrifugue a suspensão a 13.000 x g durante 25 min a 4 ° c. Descarte o sobrenadante e resuma a pelota em 1 mL ou 2 mL de água desionizada autoclavada. Transfira a suspensão aquosa para um frasco para injetáveis. Cuidado: o sobrenadante deve ser descartado suavemente, pois pode tornar-se facilmente ressuspender.</li>
			<li>Para quantidades visíveis/grandes de polímero precipitado: colete o polímero precipitado com pinça metálica estéril para um frasco para injetáveis. Esprema o polímero e descarte o excesso de etanol.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Opcional: dependendo do grau de purificação do polímero necessário, repita o passo de precipitação com 96% de etanol após a ressuscitpensão dos polímeros em água desionizada.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Liofilização do polímero
	<ol>
<li>Mantenha os frascos com o polímero precipitado a-80 ° c, pelo menos durante a noite.</li>
		<li>Congelar-secar (liofilização) o polímero para pelo menos 48 h (não deixe a suspensão degelo antes de congelar-secagem).</li>
		<li>Conservar o polímero seco à temperatura ambiente (RT) até à sua utilização. Nota: é aconselhável armazenar o polímero num dessecador, uma vez que pode absorver água ao longo do tempo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. isolamento de cianobactérias exoproteome
<ol><li>
Concentração média
	<ol>
<li>Cultivar cianobactérias em condições padrão [por exemplo, 30 ° c uma luz de 12 h (50 μE m− 2s− 1)/12 h de regime escuro, com agitação orbital a 150 rpm]. Monitore o crescimento do cianobactéria usando procedimentos padrão (por exemplo, OD730nm, clorofila a, seco-peso, etc.).</li>
		<li>Centrifugue as culturas em 4.000 x g, por 10 min em RT.</li>
		<li>Transfira o sobrenadante para um balão e descarte o pellet celular.</li>
		<li>Filtre o meio decantado através de um filtro de tamanho de poros de 0,2 μm. Nota: o protocolo pode ser pausado aqui por um curto período de tempo, se o meio é mantido a 4 ° c.</li>
		<li>Concentre o meio aproximadamente 500x (considerando o volume inicial de meio filtrado), usando concentradores centrífugos com um corte de peso molecular nominal de 3 kDa. A centrifugação deve ser operada a 4.000 x g (máximo de 1 h por rodada de centrifugação) a 15 ° c. Cuidado: para a maioria das marcas concentrador, o dispositivo de filtro precisa ser enxaguado por centrifugação com água ultrapura antes de usar. Uma vez que o filtro está molhado, não deixe secar. Deixe fluido suficiente no reservatório quando o dispositivo não estiver sendo usado. Nota: a redução da temperatura de centrifugação para 4 ° c pode ser útil se o objetivo é estudar a atividade proteica, embora aumente o tempo necessário para a concentração da amostra. O protocolo pode ser pausado entre as etapas de centrifugação por curtos períodos de tempo se o meio for mantido a 4 ° c.</li>
		<li>Enxague as paredes do reservatório da amostra do dispositivo filtrante com a amostra concentrada e transfira o conteúdo para um tubo de microcentrífuga.</li>
		<li>Realize uma etapa de lavagem adicional do reservatório de amostra do dispositivo de filtro com meio de cultura autoclavado para garantir a recuperação máxima do exoproteoma. Nota: para quantificar a percentagem de recuperação, siga as instruções específicas do fabricante.</li>
		<li>Armazene as amostras do exoproteome a-20 ° c até o uso mais adicional. Nota: a adição de inibidores de protease é recomendada para o armazenamento a longo prazo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Análise do exoproteome
	<ol>
<li>Quantificar o teor de proteínas pelo ensaio de proteína BCA em placa 96-well de acordo com as instruções do fabricante.</li>
		<li>Separe as proteínas por eletroforese em gel de dodecilo sulfato de sódio-poliacrilamida (SDS-PAGE), usando protocolos de coloração padrão (por exemplo, azul Coomassie, coloração de prata).</li>
		<li>Cortar as bandas/gel regiões de interesse e recolhê-los em diferentes tubos de microcentrífuga contendo volumes adequados de água ultra-pura.</li>
		<li>Proceder com a identificação e análise das proteínas por espectrometria de massas.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Pereira, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complexity+of+cyanobacterial+exopolysaccharides%3A+composition%2C+structures%2C+inducing+factors+and+putative+genes+involved+in+their+biosynthesis+and+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Complexity of cyanobacterial exopolysaccharides: composition, structures, inducing factors and putative genes involved in their biosynthesis and assembly.</a> FEMS Microbiology Reviews. 33 (5), 917-941 (2009).</li>
<li>Kanekiyo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+an+Antiviral+Polysaccharide%2C+Nostoflan%2C+from+a+Terrestrial+Cyanobacterium%2C+Nostoc+flagelliforme%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Natural+Products%22%5BJournal%5D)">Isolation of an Antiviral Polysaccharide, Nostoflan, from a Terrestrial Cyanobacterium, Nostoc flagelliforme.</a> Journal of Natural Products. 68 (7), 1037-1041 (2005).</li>
<li>Løbner, M., Walsted, A., Larsen, R., Bendtzen, K., Nielsen, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+human+adaptive+immune+responses+by+administration+of+a+high-molecular-weight+polysaccharide+extract+from+the+cyanobacterium+Arthrospira+platensis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicinal+Food%22%5BJournal%5D)">Enhancement of human adaptive immune responses by administration of a high-molecular-weight polysaccharide extract from the cyanobacterium Arthrospira platensis.</a> Journal of Medicinal Food. 11 (2), 313-322 (2008).</li>
<li>Wang, H. B., Wu, S. J., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+polysaccharides+from+cyanobacteria+Nostoc+commune+and+their+antioxidant+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydrate+Polymers%22%5BJournal%5D)">Preparation of polysaccharides from cyanobacteria Nostoc commune and their antioxidant activities.</a> Carbohydrate Polymers. 99, 553-555 (2014).</li>
<li>Ozturk, S., Aslim, B., Suludere, Z., Tan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metal+removal+of+cyanobacterial+exopolysaccharides+by+uronic+acid+content+and+monosaccharide+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydrate+Polymers%22%5BJournal%5D)">Metal removal of cyanobacterial exopolysaccharides by uronic acid content and monosaccharide composition.</a> Carbohydrate Polymers. 101, 265-271 (2014).</li>
<li>Han, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emulsifying%2C+flocculating%2C+and+physicochemical+properties+of+exopolysaccharide+produced+by+cyanobacterium+Nostoc+flagelliforme%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Biochemistry+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Emulsifying, flocculating, and physicochemical properties of exopolysaccharide produced by cyanobacterium Nostoc flagelliforme.</a> Applied Biochemistry and Biotechnology. 172 (1), 36-49 (2014).</li>
<li>Leite, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyanobacterium%E2%80%90Derived+Extracellular+Carbohydrate+Polymer+for+the+Controlled+Delivery+of+Functional+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecular+Bioscience%22%5BJournal%5D)">Cyanobacterium‐Derived Extracellular Carbohydrate Polymer for the Controlled Delivery of Functional Proteins.</a> Macromolecular Bioscience. 17 (2), 1600206(2017).</li>
<li>Estevinho, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+a+cyanobacterial+extracellular+polymeric+substance+in+the+microencapsulation+of+vitamin+B12%5BTitle%5D)+AND+%22Powder+Technology%22%5BJournal%5D)">Application of a cyanobacterial extracellular polymeric substance in the microencapsulation of vitamin B12.</a> Powder Technology. 343, 644-651 (2019).</li>
<li>Klock, J. H., Wieland, A., Seifert, R., Michaelis, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+polymeric+substances+%28EPS%29+from+cyanobacterial+mats%3A+characterisation+and+isolation+method+optimisation%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Biology%22%5BJournal%5D)">Extracellular polymeric substances (EPS) from cyanobacterial mats: characterisation and isolation method optimisation.</a> Marine Biology. 152 (5), 1077-1085 (2007).</li>
<li>Delattre, C., Pierre, G., Laroche, C., Michaud, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production%2C+extraction+and+characterization+of+microalgal+and+cyanobacterial+exopolysaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Advances%22%5BJournal%5D)">Production, extraction and characterization of microalgal and cyanobacterial exopolysaccharides.</a> Biotechnology Advances. 34 (7), 1159-1179 (2016).</li>
<li>Costa, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretion+systems+in+gram-negative+bacteria%3A+structural+and+mechanistic+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Secretion systems in gram-negative bacteria: structural and mechanistic insights.</a> Nature Reviews Microbiology. 13 (6), 343-359 (2015).</li>
<li>Roier, S., Zingl, F. G., Cakar, F., Schild, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+outer+membrane+vesicle+biogenesis%3A+a+new+mechanism+and+its+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell%22%5BJournal%5D)">Bacterial outer membrane vesicle biogenesis: a new mechanism and its implications.</a> Microbial Cell. 3 (6), 257-259 (2016).</li>
<li>Sergeyenko, T. V., Los, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+secreted+proteins+of+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+strain+PCC+6803%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Letters%22%5BJournal%5D)">Identification of secreted proteins of the cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 6803.</a> FEMS Microbiology Letters. 193 (2), 213-216 (2000).</li>
<li>Oliveira, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+versatile+TolC-like+Slr1270+in+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+PCC+6803%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The versatile TolC-like Slr1270 in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803.</a> Environmental Microbiology. 18 (2), 486-502 (2016).</li>
<li>Flores, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+alternative+sigma+factor+SigF+is+a+key+player+in+the+control+of+secretion+mechanisms+in+Synechocystis+sp.+PCC+6803%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The alternative sigma factor SigF is a key player in the control of secretion mechanisms in Synechocystis sp. PCC 6803.</a> Environmental Microbiology. 21 (1), 343-359 (2018).</li>
<li>Dubois, M., Gilles, K. A., Hamilton, J. K., Rebers, P. A., Smith, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorimetric+method+for+determination+of+sugars+and+related+substances%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Colorimetric method for determination of sugars and related substances.</a> Analytical Chemistry. 28 (3), 350-356 (1956).</li>
<li>Parikh, A., Madamwar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+characterization+of+extracellular+polysaccharides+from+cyanobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresource+Technology%22%5BJournal%5D)">Partial characterization of extracellular polysaccharides from cyanobacteria.</a> Bioresource Technology. 97 (15), 1822-1827 (2006).</li>
<li>Rühmann, B., Schmid, J., Sieber, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+identify+the+unexplored+diversity+of+microbial+exopolysaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Methods to identify the unexplored diversity of microbial exopolysaccharides.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 565(2015).</li>
<li>Pathak, J., Rajneesh, R., Sonker, A. S., Kannaujiya, V. K., Sinha, R. P. Cyanobacterial extracellular polysaccharide sheath pigment, scytonemin: A novel multipurpose pharmacophore. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPathak%2C+J+%22Marine+Glycobiology%22">Marine Glycobiology</a>. , CRC Press. 343-358 (2016).</li>
<li>Nguyen, A. T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performances+of+different+protocols+for+exocellular+polysaccharides+extraction+from+milk+acid+gels%3A+Application+to+yogurt%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Performances of different protocols for exocellular polysaccharides extraction from milk acid gels: Application to yogurt.</a> Food Chemistry. 239, 742-750 (2018).</li>
<li>Jamshidian, H., Shojaosadati, S. A., Mousavi, S. M., Soudi, M. R., Vilaplana, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implications+of+recovery+procedures+on+structural+and+rheological+properties+of+schizophyllan+produced+from+date+syrup%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Implications of recovery procedures on structural and rheological properties of schizophyllan produced from date syrup.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 105, 36-44 (2017).</li>
<li>Couto, N., Schooling, S. R., Dutcher, J. R., Barber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome+profiles+of+outer+membrane+vesicles+and+extracellular+matrix+of+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Proteome profiles of outer membrane vesicles and extracellular matrix of Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Journal of Proteome Research. 14 (10), 4207-4222 (2015).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Para compreender melhor os mecanismos de secreção bacteriana e estudar os produtos liberados, é de extrema importância demonstrar o isolamento e a análise eficientes das biomoléculas presentes no ambiente bacteriano extracelular (como o liberado polímeros e proteínas de carboidratos).
Os polímeros de carboidratos extracelulares de cianobactérias são extremamente complexos, principalmente devido ao número e proporção de diferentes monossacarídeos que constituem sua composição1...

As cianobactérias são amplamente reconhecidas como fontes prolíficas de produtos naturais com promissoras aplicações biotecnológicas/biomédicas. Portanto, a compreensão dos mecanismos de secreção de cianobactérias e a otimização dos métodos de extração/recuperação são essenciais para implementar cianobactérias como eficientes fábricas de células microbianas.
Muitas cepas de cianobactérias são capazes de produzir substâncias poliméricos extracelulares (EPS), formadas principalmente por heteropolissacarídeos, que permanecem associadas à superfície celular ou são liberados para o meio1. Estes polímeros de carboidratos liberados têm características distintas em comparação com aqueles de outras bactérias, que os tornam adequados para uma ampla gama de aplicações (por exemplo, antivirais2, imunoterapia Imunoestimulador3, antioxidante4, metal-quelante5, emulsificante6, e agentes de entrega de fármacos7,8). A metodologia para o isolamento desses polímeros contribui, em grande parte, não só para a melhoria da produtividade, mas também para o aumento da pureza e as propriedades físicas específicas do polímero obtido9. A grande maioria destes métodos de isolamento dos polímeros dependem de estratégias de precipitação do meio de cultura que são facilmente realizadas devido à forte natureza aniônica do polímero9,10. Além disso, a remoção dos solventes utilizados na etapa de precipitação pode ser rapidamente alcançada por evaporação e/ou liofilização. Dependendo da aplicação prevista, podem ser acoplados diferentes passos, quer após ou antes da precipitação do polímero, a fim de adaptar o produto final, que incluem o tratamento com ácido tricloroacético (TCA), filtração ou cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) purificação de coluna10.
As cianobactérias também são capazes de secretar uma ampla gama de proteínas através de vias dependentes de transportadores de membrana (clássica)11 ou mediadas por vesículas (não-clássicas)12. Portanto, a análise do exoproteoma cianobactérias constitui uma ferramenta essencial, tanto para compreender/manipular os mecanismos de secreção de proteínas cianobactérias quanto para compreender a função extracelular específica dessas proteínas. A isolação e a análise confiáveis de exoproteomes exigem a concentração do Milieu extracelular, desde que a abundância de proteínas secretado é relativamente baixa. Além disso, outras etapas físicas ou químicas (por exemplo, centrifugação, filtração ou precipitação protéica) podem otimizar a qualidade do exoproteoma obtido, enriquecedora do conteúdo proteico13, e evitando a presença de contaminantes (por exemplo, pigmentos, hidratos de carbono, etc.) 14 anos de , 15 ou a predominância de proteínas intracelulares nas amostras. No entanto, algumas dessas etapas também podem restringir o conjunto de proteínas que podem ser detectadas, levando a uma análise tendenciosa.
Este trabalho descreve protocolos eficientes para o isolamento de polímeros de carboidratos liberados e exoproteomes de meios de cultura de cianobactérias. Esses protocolos podem ser facilmente adaptados aos objetivos específicos do estudo e às necessidades dos usuários, mantendo as etapas básicas aqui apresentadas.

<table><tbody><tr><td>Membranas de diálise</td><td>Medicell Membranes Ltd&nbsp;</td><td>DTV.12000.07</td><td>Visking Tubing Tamanho 7, Diâmetro 23.8 mm, Largura 39-41 mm 30m Rolo&nbsp;</td></tr><tr><td>Etanol 96%</td><td>AGA - &Aacute; lcool e G&eacute; neros Alimentares, S.A.</td><td>4.000.02.02.00</td><td>Fermentação álcool etílico 96% AGA</td></tr><tr><td>PES Filtro 0.2 &mu; m</td><td>Fisher Scientific, Lda</td><td>15206869</td><td>Seringa filtro de poliestireno 33MM 0.2&micro; M STR&nbsp;</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15, Ultracel-3K</td><td>Merck Millipore Ltd.</td><td>UFC900324</td><td>Filtros centrífugos com um corte de peso molecular nominal de 3 kDa</td></tr><tr><td>Thermo Scientific&nbsp; Pierce BCA Protein Assay</td><td>Fisher Scientific, Lda</td><td>10741395</td><td>Reagente de ensaio de verde a azul, preciso, compatível com detergente para medir a concentração total de proteína</td></tr><tr><td>Concentrado Coloidal Brillant Blue G&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich Qu&iacute; mica SL</td><td>B2025-1EA</td><td>Coomassie azul&nbsp;</td></tr></tbody></table>

olhando para fora: isolamento de cianobactérias liberado polímeros de carboidratos e proteínas

Looking Outwards: Isolation of Cyanobacterial Released Carbohydrate Polymers and Proteins

A cianobactéria pode secretar ativamente uma ampla gama de biomoléculas para o ambiente extracelular, como heteropolissacarídeos e proteínas. A identificação e caracterização dessas biomoléculas podem melhorar o conhecimento sobre suas vias de secreção e ajudar a manipulá-las. Além disso, algumas dessas biomoléculas também são interessantes em termos de aplicações biotecnológicas. Descritos aqui estão dois protocolos para o isolamento fácil e rápido de cianobactérias liberado polímeros de carboidratos e proteínas. O método de isolamento de polímeros de carboidratos liberados é baseado em técnicas convencionais de precipitação de polissacarídeos em soluções aquosas utilizando solventes orgânicos. Este método preserva as características do polímero e, simultaneamente, evita a presença de contaminantes de detritos celulares e meio de cultura. No final do processo, o polímero liofilizado está pronto para ser usado ou caracterizado ou pode ser submetido a novas rodadas de purificação, dependendo do uso final pretendido. Em relação ao isolamento do exoproteoma cianobactérias, a técnica baseia-se na concentração do meio livre de células após a remoção dos principais contaminantes por centrifugação e filtração. Essa estratégia permite o isolamento confiável de proteínas que atingem o meio extracelular através de transportadores de membrana ou vesículas de membrana externa. Essas proteínas podem ser posteriormente identificadas usando técnicas de espectrometria de massas padrão. Os protocolos aqui apresentados podem ser aplicados não apenas a uma ampla gama de cianobactérias, mas também a outras cepas bacterianas. Além disso, estes procedimentos podem facilmente ser costurados de acordo com o uso final dos produtos, o grau da pureza exigido, e a tensão bacteriana.

Uma representação esquemática do método descrito para extrair polímeros de carboidratos liberados de culturas de cianobactérias é descrita na Figura 1. Os polímeros precipitados do moderado produtor de EPS cianobactéria synechocystis SP. PCC 6803 e o eficiente produtor de EPS cyanothece SP. CCY 0110 são mostrados na Figura 2. Na Figura 3, são mostrados polímeros liofilizados com diferentes graus de contaminação, de...

Aqui, os protocolos para o isolamento de cianobactérias liberado polímeros de carboidratos e isolamento de seus exoproteomes são descritos. Ambos os procedimentos incorporam etapas-chave para obter polímeros ou proteínas com graus de alta pureza que podem ser usados para posterior análise ou aplicações. Eles também podem ser facilmente adaptados de acordo com as necessidades específicas do usuário.

Olhando para fora: isolamento de cianobactérias liberado polímeros de carboidratos e proteínas

Cyanobacteria can actively secrete a wide range of biomolecules into the extracellular environment, such as heteropolysaccharides and proteins. The ...

Esses protocolos que desenvolvemos são importantes para estudar os mecanismos de secreção em cianobactérias e seus produtos liberados, ou seja, os polímeros e proteínas de carboidratos extracelulares. O conhecimento gerado nos permitirá personalizar esses produtos para diversas aplicações, ou seja, aplicações biotecnológicas e biomédicas. Esses protocolos são muito simples.Eles podem ser adaptados de acordo com o organismo produtor, as necessidades do usuário e a aplicação final do produto. A principal vantagem desses protocolos é que eles podem ser facilmente adaptados a outros sistemas vivos, em particular a outras bactérias. Esses protocolos são fáceis.No entanto, pode-se precisar introduzir algumas alterações dependendo da cepa bacteriana ou do grau de pureza necessário. Para começar, cultive a cepa cianobacteriana em condições normais. Medir o crescimento usando protocolos padrão.Em seguida, transfira a cultura para membranas de diálise, e diálise contra um mínimo de 10 volumes de água deionizada por 24 horas com agitação contínua. Centrifugar a cultura a 15.000 vezes g a quatro graus Celsius por 15 minutos. Transfira o supernatante para um novo frasco, e descarte a pelota.Centrífuga novamente a 20.000 vezes g a quatro graus Celsius por 15 minutos para remover contaminantes, como detritos de parede celular ou lipopólises. Após a centrifugação, transfira o supernatante para um béquer de vidro, e descarte a pelota. Para precipitar o polímero, adicione dois volumes de 96% de etanol ao supernascido e incuba a suspensão a quatro graus Celsius durante a noite.Para pequenas ou não quantidades visíveis de polímero precipitado, centrifugar a suspensão a 13.000 vezes g a quatro graus Celsius por 25 minutos. Descarte suavemente o supernasciente, e resuspenque a pelota em um a dois mililitros de água deionizada autoclavada. Transfira a suspensão aquosa para um frasco.Para visível, grandes quantidades de polímero precipitado, colete o polímero precipitado com fórceps metálicos estéreis em um frasco. Aperte o polímero e descarte o excesso de etanol. Para realizar o processo de liofilização também conhecido como secagem congelante, mantenha os frascos com o polímero precipitado a menos 80 graus Celsius durante a noite.Lyophilize o polímero por pelo menos 48 horas. Em seguida, armazene o polímero seco em um desiccador à temperatura ambiente até usar ainda mais. Para concentrar o meio, primeiro cultivar cianobactérias em condições padrão.Monitore o crescimento do cianobacterium usando procedimentos padrão. Em seguida, centrifugar as culturas a 4.000 vezes g em temperatura ambiente por 10 minutos. Transfira o supernatante para um frasco, e descarte a pelota celular.Em seguida, filtre o meio decantado através de um filtro de tamanho de poros de 0,2 mícrons. Para concentrar o meio aproximadamente 500 vezes, use concentradores centrífugas com um corte nominal de peso molecular de três kilodaltons para centrífugas 4.000 vezes g e 15 graus Celsius para um máximo de uma hora por rodada de centorifugação. Após a centrifugação, enxágue as paredes do reservatório de amostra do dispositivo do filtro com a amostra concentrada e transfira o conteúdo para um tubo de microcentrifutura.Realize uma etapa adicional de lavagem do reservatório de amostra do dispositivo do filtro com o meio de cultura autoclaved para garantir a recuperação máxima do exoproteome. Em seguida, armazene as amostras de exoproteome a menos 20 graus Celsius até usar mais. O etanol deve ser adicionado vigorosamente para otimizar a precipitação e o rendimento do polímero.Após a centrifugação do polímero precipitado, o descarte do supernante deve ser feito cuidadosamente para evitar a ressuspensão da pelota que pode ser vagamente presa na parede do frasco. Se a filtragem manual for realizada, deve ser suave para evitar quebrar a membrana do filtro. Alguns polímeros precipitados só podem ser visíveis após a centrifugação, principalmente nas paredes dos frascos, como o caso de EPS de Synechocystis.Em outros casos, como o polímero Cyanothece, é possível ver os aglomerados de polímeros flutuando no béquer de vidro logo após a precipitação. Algumas contaminações podem ser facilmente detectadas macroscopicamente após a liofilização do polímero, pois alteram a pigmentação do polímero, geralmente branco ou marrom claro. Polímeros laranjas estão contaminados com carotenoides ou estruturas contendo esses pigmentos.Por exemplo, polímeros verdes estão contaminados com detritos celulares e clorofila. Exoproteomes podem variar significativamente dependendo da cepa bacteriana. Veja, por exemplo, o exoproteome de um cianobacterium unicelular e o de uma cepa fiomante.A alta quantidade de polissacarídeos em amostras exoprotetoras concentradas pode dificultar a análise exoproteome. Por exemplo, pode atrasar a separação de proteínas e mascarar proteínas menos abundantes. O usuário pode caracterizar o polímero em termos de composição, propriedades físicas/químicas, atividade biológica de polímero de teste ou componentes de polímeros modificados.Para identificação de proteínas, pode ser realizada a separação de proteínas em gel e espectrometria de massa. E para a separação das vesículas, a ultracentrifugação do exoproteome deve ser realizada. Em nosso grupo, esses protocolos já abriram caminho para desvendar mecanismos de secreção cianobacteriana ou aplicações dos polímeros de carboidratos extracelulares em diferentes campos, como na bioremediação ou como agentes de antitumor ou de entrega de medicamentos.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Fonte: Shivaiah, K., et al. Isolamento de gotículas lipídicas de plastoglobulos do tecido foliar da planta e cianobactérias. J. Vis. Exp. (2022)O vídeo demonstra o isolamento de plastoglóbulos de cianobactérias. Começa com uma cultura de cianobactérias e prossegue através da ruptura celular usando força mecânica. A liberação de pigmentos fotossintéticos indica lise bem-sucedida. Um gradiente de etapa de sacarose é então usado para separar os componentes celulares por densidade, permitindo que...

Extração e Purificação de Plastoglóbulos de Bactérias Fotossintéticas

Fonte: Shivaiah, K., et al. Isolamento de gotículas lipídicas de plastoglobulos do tecido foliar da planta e cianobactérias. J. Vis. Exp. (2022).Este vídeo demonstra o isolamento de plastoglóbulos de cianobactérias usando centrifugação com gradiente de densidade de sacarose, destacando sua natureza rica em lipídios e de baixa densidade e garantindo sua preservação estrutural para análise a jusante.

Purificação por gradiente de densidade de plastoglóbulos de cianobactérias

Fonte: Jiang, H., Ho, M. Isolamento e caracterização do ficobilissomo intacto em cianobactérias. J. Vis. Exp. (2021).Este vídeo demonstra o procedimento de cultivo de cianobactérias para obter biomassa por meio do cultivo de células sob iluminação contínua com suprimento de dióxido de carbono e condições ricas em nutrientes, seguido de colheita por centrifugação.

Preparação de cultura de cianobactérias para produção de biomassa

Aqui, apresentamos um ensaio confiável e fácil para medir o teor de glicogênio em células cianobacterianas. O procedimento implica a precipitação, despolimerização selecionável e a detecção de resíduos de glicose. Este método é adequado para ambas as variedades de tipo selvagem e geneticamente modificado e pode facilitar a engenharia metabólica de cianobactérias.

Determinação do conteúdo de glicogênio em cianobactérias

Aqui, apresentamos um protocolo para determinar quantitativamente o conteúdo de phycobiliprotein na associação Synechocystis , usando um método espectrofotométrico. O procedimento de extração foi aplicado também com sucesso para outras cepas de cianobactérias e algas; no entanto, devido às variações em espectros de absorção do pigmento, é necessário testar as equações espectrofotométricas para cada estirpe individualmente.

Determinação espectrofotométrica de Phycobiliprotein conteúdo em associação Synechocystis

O protocolo atual detalha o isolamento de ficobilísomees de cianobactérias por centrifugação através de um gradiente de densidade de sacarose descontínua. As frações de ficobilismos intactos são confirmadas pelo espectro de emissão fluorescente de 77K e pela análise de SDS-PAGE. As frações ficobilínicas resultantes são adequadas para coloração negativa da TEM e análise de espectrometria de massa.

Isolamento e Caracterização de Ficobilisome intacto em cianobactérias

O presente protocolo fornece descrições detalhadas para isolamento, concentração e caracterização de vesículas extracelulares de culturas cianobacterianas. Abordagens para purificar vesículas de culturas em diferentes escalas, trocas entre metodologias e considerações para o trabalho com amostras de campo também são discutidas.

Isolamento e Caracterização de Vesículas Extracelulares Cianobacterianas

Um protocolo rápido e eficiente é apresentado para o isolamento de gotículas lipídicas de plastoglobule associadas a vários organismos fotossintéticos. A preparação bem-sucedida de plastoglóbulos isolados é um primeiro passo crucial que precede investigações moleculares detalhadas, como análises proteômicas e lipidômicas.

Isolamento de gotículas lipídicas de platoglobulos do tecido foliar da planta e cianobactérias

Apresentamos um método simples e acessível para visualização de cianobactérias filamentosas no plano XY. Foi utilizada uma matriz de agarose de baixo ponto de fusão, permitindo a aquisição de imagens das proteínas envolvidas na divisão, na orientação vertical. Portanto, esta metodologia pode ser aplicada a qualquer organismo filamentoso e diferentes tipos de proteínas.

Método de imobilização vertical para análise de microscopia time-lapse em cianobactérias filamentosas

Aqui, descrevemos métodos de amostragem das zonas eufóticas de ecossistemas marinhos e de água doce para isolar cianofagos (e seus hospedeiros) e processos pós-amostragem que enriquecem genótipos únicos e caracterizam a dinâmica de interação vírus-hospedeiro.

Amostragem ambiental de micróbios fotossintéticos e seus vírus: do campo ao laboratório

Aprenda a isolar polímeros de carboidratos e exoproteomas de cianobactérias com alta pureza. Estes protocolos adaptáveis permitem estudar mecanismos de secreção e aplicar em biotecnologia e biomedicina.

Olhando para fora: isolamento de cianobactérias liberado polímeros de carboidratos e proteínas

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