Name: Shootward movimento de CFDA Tracer carregado no fundo pia tecidos de Arabidopsis (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: Aprenda a carregar CFDA em raízes e hipocótilos de Arabidopsis para estudar transporte intercelular e atividade do floema. Este método revela barreiras simplásticas em plantas.

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Este trabalho foi financiado pela Fundação Nacional de ciência natural da China (31671257) e Hubei centro de inovação colaborativa para a indústria de grãos (LXT-16-18).

1. crescimento vertical de Arabidopsis no meio do MS
<ol><li>O interior do armário do fluxo laminar precisa de ser tratado com a luz UV de 30 minutos e o fluxo de ar de 15 minutos antes do uso. Certifique-se de fechar a porta de vidro quando a luz UV está ligado. Pulverize todas as ferramentas e placas com 70% de etanol antes de colocá-las no armário.</li>
	<li>Prepare o meio Murashige e Skoog (MS) em um prato de Petri padrão de 90 mm de diâmetro um gabinete de fluxo laminar. Nota: o meio MS contém os seguintes componentes: 20,6 mM NH4no3, 18,8 mm kno3, 1,25 mm KH2po4, 1,5 mM MgSO4· 7h2o, 3 mm CAcl2· 2h2o, 0,1 mm mnso4· H2o, 1, 3 μm na2Moo4· 2h2o, 0,1 mm H3Bo3, 30 μm Znso4· 7h2o, 0,1 μm CuSO4· 5h2o, 0,1 μm cocl2· 6h2o, 1,39 μm Ki, 97 μ M FeSO4 · 7h2O, ácido etilenodiaminotetracético de 114,5 μm (EDTA), ácido nicotínico de 4, 7 μm, HCL do piridoxina de 2,44 μm, HCL do tiamina de 0,15 μm, Glycine de 2,68 milímetros, 555 μm Myo-inositol, sacarose de 87,7 mm e Agar 10 g/L.</li>
	<li>Hidratar as pontas ou palitos esterilizados tocando a ponta ou palitos para o meio MS, em seguida, mergulhe as sementes esterilizadas um por um na posição fixa de cada placa de Petri indicada pelo cartão de semeadura.</li>
	<li>Selar o prato de Petri com película de parafina e fita adesiva e colocá-lo verticalmente em um stand claro em uma sala de crescimento (22 ° c, 70% de umidade) com um ciclo de dia de 16 h de luz e 8 h de escuridão (iluminação das 6 am às 10 horas). A planta de Arabidopsis está pronta para o carregamento de CFDA no dia 9-13 após a semeadura. Nota: o procedimento a seguir é realizado na parte da tarde de 2 PM a 5 PM.</li>
</ol>2. carregamento de CFDA com o procedimento de corte da raiz
<ol><li>Prepare a solução de trabalho CFDA fresca imediatamente antes de usar. Diluir a solução conservada em estoque de 1 milímetro CFDA armazenada no congelador de-20 ° c com água estéril do ultrapura a uma concentração de trabalho de 5 μm.</li>
	<li>Corte a película microporosa da membrana da parafina (veja a tabela de materiais) em partes pequenas de 3 milímetros x 3 milímetros de tamanho.</li>
	<li>Descubra as plantas crescentes no quarto em 22 ° c e limpe o excesso de umidade com uma toalha de papel. Coloc as partes pequenas da película abaixo de cada raiz. Nota: a partir deste para o passo 2,6, todo o processo deve ser concluída dentro de 15 min.</li>
	<li>Levante as plantas na tampa do prato de Petri. Corte as raízes em uma posição de cerca de 5-10 mm abaixo da junção raiz-hipocótilo. Coloque a parte do tiro de volta para o filme no meio.</li>
	<li>Aplique com cuidado 0,25 μL de CFDA na extremidade de corte de cada raiz um microscópio de dissecação. Evite espirrar para outras partes da planta.</li>
	<li>Cubra a placa e deixe as plantas a luz para 2-3 h (22 ° c) na sala de crescimento.</li>
	<li>Enxágüe as plantas manchadas três vezes sequencialmente em três copos separados enchidos com a água destilada, a seguir Observe as plantas um microscópio da estéreo-fluorescência com zumbido de 1.4 x a 3.3 x (veja a tabela de materiais). Para detecção de fluorescência, use um cubo de filtro de alta eficiência (470/20 nm de excitação, 495 nm Split e 525/50 nm de emissão) montado para transmitir o sinal de fluorescência.</li>
</ol>3. carregamento de CFDA com procedimento do hypocotyl-beliscar
<ol><li>Prepare a solução de trabalho CFDA fresca imediatamente antes de usar. Diluir a solução conservada em estoque de 1 milímetro CFDA armazenada no congelador de-20 ° c com água estéril do ultrapura (veja a tabela de materiais) a uma concentração de trabalho de 5 μm.</li>
	<li>Corte a película microporosa da membrana da parafina (veja a tabela de materiais) em partes pequenas de 3 milímetros x 3 milímetros de tamanho.</li>
	<li>Descubra as plantas crescentes no quarto em 22 ° c e limpe o excesso de umidade com uma toalha de papel. Nota: a partir deste para o passo 3,7, todo o processo deve ser concluída dentro de 15 min.</li>
	<li>Coloque um pequeno pedaço de filme a junção raiz-hipocótilo de cada planta.</li>
	<li>Use o fórceps para beliscar delicadamente o hipocótilo próximo à junção da raiz-hipocótilo um microscópio de dissecação.</li>
	<li>Aplique com cuidado 0,1 μL de CFDA no local da ferida um microscópio de dissecação. Evite espirrar para outras partes da planta.</li>
	<li>Cubra a placa, e deixe as plantas a luz (° c 22) para 2-3 h.</li>
	<li>Enxágüe as plantas manchadas três vezes sequencialmente em três copos separados enchidos com a água destilada, a seguir Observe as plantas um microscópio da estéreo-fluorescência com zumbido de 1.4 x a 3.3 x (veja a tabela de materiais). Para a detecção de fluorescência, montar um cubo de filtro de alta eficiência (470/20 nm de excitação, 495 nm Split e 525/50 nm de emissão) para transmitir o sinal de fluorescência.</li>
</ol>

<ol><li>Grignon, N., Touraine, B., Durand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((6%285%29Carboxyfluorescein+as+a+tracer+of+phloem+sap+translocation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Botany%22%5BJournal%5D)">6(5)Carboxyfluorescein as a tracer of phloem sap translocation.</a> American Journal of Botany. 76, 871-877 (1989).</li>
<li>Wright, K. M., Oparka, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fluorescent+probe+HPTS+as+a+phloem-mobile%2C+symplastic+tracer%3A+an+evaluation+using+confocal+laser+scanning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">The fluorescent probe HPTS as a phloem-mobile, symplastic tracer: an evaluation using confocal laser scanning microscopy.</a> Journal of Experimental Botany. 47 (3), 439-445 (1996).</li>
<li>Oparka, K. J., Prior, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Movement+of+Lucifer+Yellow+CH+in+potato+tuber+storage+tissues%3A+A+comparison+of+symplastic+and+apoplastic+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Movement of Lucifer Yellow CH in potato tuber storage tissues: A comparison of symplastic and apoplastic transport.</a> Planta. 176 (4), 533-540 (1988).</li>
<li>Knoblauch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multispectral+Phloem-Mobile+Probes%3A+Properties+and+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Multispectral Phloem-Mobile Probes: Properties and Applications.</a> Plant Physiology. 167 (4), 1211-1220 (2015).</li>
<li>Oparka, K. J., Duckett, C. M., Prior, D. A. M., Fisher, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+of+phloem+unloading+in+the+root+tip+of+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging of phloem unloading in the root tip of Arabidopsis.</a> The Plant Journal. 6 (5), 759-766 (1994).</li>
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<li>Roberts, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phloem+Unloading+in+Sink+Leaves+of+Nicotiana+benthamiana%3A+Comparison+of+a+Fluorescent+Solute+with+a+Fluorescent+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Phloem Unloading in Sink Leaves of Nicotiana benthamiana: Comparison of a Fluorescent Solute with a Fluorescent Virus.</a> The Plant Cell. 9 (8), 1381-1396 (1997).</li>
<li>Péron, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Insights+into+Phloem+Unloading+and+Expression+of+Sucrose+Transporters+in+Vegetative+Sinks+of+the+Parasitic+Plant+Phelipanche+ramosa+L+%28Pomel%29%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">New Insights into Phloem Unloading and Expression of Sucrose Transporters in Vegetative Sinks of the Parasitic Plant Phelipanche ramosa L (Pomel).</a> Frontiers in Plant Science. 7 (2048), (2017).</li>
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<li>Bederska, M., Borucki, W., Znojek, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Movement+of+fluorescent+dyes+Lucifer+Yellow+%28LYCH%29+and+carboxyfluorescein+%28CF%29+in+Medicago+truncatula+Gaertn.+roots+and+root+nodules%5BTitle%5D)+AND+%22Symbiosis%22%5BJournal%5D)">Movement of fluorescent dyes Lucifer Yellow (LYCH) and carboxyfluorescein (CF) in Medicago truncatula Gaertn. roots and root nodules.</a> Symbiosis. 58 (1-3), 183-190 (2012).</li>
<li>Robards, A. W., Lucas, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodesmata%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Physiology+and+Plant+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Plasmodesmata.</a> Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 41 (1), 369-419 (1990).</li>
<li>Roberts, A. G., Oparka, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodesmata+and+the+control+of+symplastic+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Plant%2C+Cell+%26+Environment%22%5BJournal%5D)">Plasmodesmata and the control of symplastic transport.</a> Plant, Cell & Environment. 26 (1), 103-124 (2003).</li>
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<li>van Bel, A. J. E., Kempers, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symplastic+isolation+of+the+sieve+element-companion+cell+complex+in+the+phloem+of+Ricinus+communis+and+Salix+alba+stems%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Symplastic isolation of the sieve element-companion cell complex in the phloem of Ricinus communis and Salix alba stems.</a> Planta. 183 (1), 69-76 (1991).</li>
<li>Erwee, M. G., Goodwin, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symplast+domains+in+extrastelar+tissues+of+Egeria+densa+Planch%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Symplast domains in extrastelar tissues of Egeria densa Planch.</a> Planta. 163 (1), 9-19 (1985).</li>
<li>Oparka, K. J., Prior, D. A. M., Wright, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symplastic+communication+between+primary+and+developing+lateral+roots+of+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Symplastic communication between primary and developing lateral roots of Arabidopsis thaliana.</a> Journal of Experimental Botany. 46 (2), 187-197 (1995).</li>
<li>Christensen, N. M., Faulkner, C., Oparka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+Unidirectional+Flow+through+Plasmodesmata%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Evidence for Unidirectional Flow through Plasmodesmata.</a> Plant Physiology. 150 (1), 96-104 (2009).</li>
<li>Wróbel-Marek, J., Kurczyńska, E., Płachno, B. J., Kozieradzka-Kiszkurno, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+symplasmic+domains+in+the+embryo+and+seed+of+Sedum+acre+L.+%28Crassulaceae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Identification of symplasmic domains in the embryo and seed of Sedum acre L. (Crassulaceae).</a> Planta. 245 (3), 491-505 (2017).</li>
<li>Liang, D., White, R. G., Waterhouse, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+silencing+in+Arabidopsis+spreads+from+the+root+to+the+shoot%2C+through+a+gating+barrier%2C+by+template-dependent%2C+non-vascular%2C+cell+to+cell+movement%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Gene silencing in Arabidopsis spreads from the root to the shoot, through a gating barrier, by template-dependent, non-vascular, cell to cell movement.</a> Plant Physiology. 159 (3), 984-1000 (2012).</li>
<li>Radford, J. E., White, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+tissue-preparation-induced+callose+synthesis+on+estimates+of+plasmodesma+size+exclusion+limits%5BTitle%5D)+AND+%22Protoplasma%22%5BJournal%5D)">Effects of tissue-preparation-induced callose synthesis on estimates of plasmodesma size exclusion limits.</a> Protoplasma. 216 (1-2), 47-55 (2001).</li>
<li>Kollist, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Responses+to+Abiotic+Stress%3A+Priming+the+Landscape+for+the+Signal+Transduction+Network%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Rapid Responses to Abiotic Stress: Priming the Landscape for the Signal Transduction Network.</a> Trends in Plant Science. 24 (1), 25-37 (2019).</li>
<li>Haupt, S., Duncan, G. H., Holzberg, S., Oparka, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+Symplastic+Phloem+Unloading+in+Sink+Leaves+of+Barley%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Evidence for Symplastic Phloem Unloading in Sink Leaves of Barley.</a> Plant Physiology. 125 (1), 209-218 (2001).</li>
<li>Botha, C. E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+xylem+sap+retrieval+pathway+in+rice+leaf+blades%3A+evidence+of+a+role+for+endocytosis%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">A xylem sap retrieval pathway in rice leaf blades: evidence of a role for endocytosis?</a> Journal of Experimental Botany. 59 (11), 2945-2954 (2008).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Estudos emergentes demonstraram que as plantas podem responder rapidamente aos estímulos externos23, incluindo a manipulação introduzida nos procedimentos experimentais22. Em nosso experimento inicial, nossa supervisão desse conhecimento muitas vezes leva a uma falha de coloração. Com estas lições, nós sugerimos que as seguintes precauções devam ser mantidas na mente ao executar esta experiência: (1) as sementes após a colheita devem ser mantidas em um armário de armazename...

Muitos traçadores fluorescentes com uma escala de propriedades espectrais, tais como 5 (6)-carboxyfluorescein (CF)1, 8-hydroxypyrene-1, 3, 6-trisulphonic o ácido2, Lúcifer ch amarelo (lych)3, esculin e CTER4, foram desenvolvidos e aplicado em plantas para monitorar o movimento symplastic e a atividade do floema. Geralmente, uma tintura symplastic é carregada em um corte no tecido do alvo e a dispersão seqüencial do repórter em outras partes da planta demonstrará a comunicação intercelular. Embora o mecanismo da absorção da tintura não seja compreendido inteiramente, o movimento subjacente do CF do princípio dentro das pilhas vivas foi reconhecido extensamente. A forma de éster de CF (diacetato de CF, CFDA) é não-fluorescente, mas membrana-permeável. Esta propriedade permite a difusão rápida da membrana da tintura em pilhas. Uma vez dentro das células vivas, as esterases intracelulares removem os grupos de acetato na posição 3 ' e 6 ' do CFDA, liberando a FC fluorescente e membrana-impermeable (Figura 1, alternativamente, consulte Wright et al.2); O CF pode então mover-se através dos plasmodesmos a outras partes das plantas.
Um procedimento bem estabelecido com CFDA é que ele pode ser carregado em folhas de origem e usado para monitorar o fluxo de floema e descarga de floema nos tecidos de pia de muitas espécies, por exemplo, como a descarga de CF na raiz de Arabidopsis 5, descarregamento de floema durante a tuberização da batata6, o descarregamento de floema no dissipador de Nicotiana deixa7, e assim por diante. Por abordagens similares de carga, outros estudos adotaram esse corante para demonstrar a conexão symplastic entre hospedeiro e parasita8,9, ou para revelar as relações simbióticas10,11.
Outra maneira de fazer uso deste corante é carregá-lo em células específicas ou célula única por microinjeção para determinar o seu padrão de distribuição. Tais técnicas sofisticadas facilitaram muito nossa compreensão mais profunda da comunicação intercelular mediada por Plasmodesmata, particularmente no desenvolvimento do conceito de domínio symplastic12,13. Por exemplo, a microinjeção de CFDA em células cotiledôneas de Arabidopsis resultou no padrão de acoplamento de corante na epiderme do hipocótilo, mas não acoplamento nas células subjacentes ou na epiderme radicular, portanto, a epiderme do hipocótilo forma uma domínio symplastic14. Domínios semelhantes, como as células de guarda estomática15, células de companheiro de peneira16, células de cabelo raiz14 e tampão de raiz17,18 foram identificados por técnica de microinjeção. Mais surpreendentemente, alguns domínios permitem que as moléculas traçadoras se movam em uma determinada direção. Tome o domínio do tricomas por exemplo, microinjection de uma ponta de prova fluorescente na pilha epidérmica de apoio conduz ao fluxo do Tracer no domínio do tricomas, entretanto, a injeção reversa não segura19verdadeiro. Um relatório recente também encontrou situações semelhantes nos domínios symplastic do embrião de Sedum 20. Assim, todos os casos acima implicam que a troca de locais de carregamento pode levar a novas percepções sobre a comunicação symplastic. Nosso experimento anterior com o objetivo de dissecar a rota de silenciamento móvel root-to-shoot identificou um novo domínio symplastic, ou a zona de HEJ (Hipócotilo-epicotyl Junction), que foi ainda verificada através do CFDA de carregamento de raízes (coletor não canônico) experimento21. Aqui, Nós elaboramos ainda mais o movimento da raiz para disparar CF usando um método simples e recupero um domínio symplastic potencial deslocando os locais de carregamento. Além disso, este procedimento pode ser adaptado para diferenciar origens genéticas que alteraram o transporte de longa distância root-to-shoot.

<table><tbody><tr><td>KNO3&nbsp; &nbsp;</td><td>Reagente Químico Sinopharm</td><td>10017218</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4&nbsp;</td><td>Reagente Químico Sinopharm</td><td>10017608</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&middot; 7H2O</td><td>Sinopharm Reagente Químico</td><td>10013018</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&middot; Reagente Químico Sinopharm 2H2O</td><td></td><td>20011160</td><td></td></tr><tr><td>MnSO4&middot; H2O&nbsp;</td><td>Reagente Químico Sinopharm</td><td>10013418</td><td></td></tr><tr><td>Na2MoO4&middot; 2H2O</td><td>Sinopharm Reagente Químico</td><td>10019818</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Bórico</td><td>Sinopharm Reagente Químico</td><td>10004818</td><td></td></tr><tr><td>ZnSO4&middot; 7H2O</td><td>Sinopharm Reagente Químico</td><td>10024018</td><td></td></tr><tr><td>CuSO4&middot; 5H2O</td><td>Sinopharm Reagente Químico</td><td>10008218</td><td></td></tr><tr><td>CoCl2&middot; 6H2O</td><td>Reagente Químico Sinopharm</td><td>10007216</td><td></td></tr><tr><td>Reagente Químico KI</td><td>Sinopharm</td><td>10017160</td><td></td></tr><tr><td>FeSO4&middot; 7H2O</td><td>Sinopharm Reagente Químico</td><td>10012118</td><td></td></tr><tr><td>EDTA&nbsp;</td><td>Reagente Químico Sinopharm</td><td>10009717</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Reagente Químico Sinopharm</td><td>10019718</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Reagente Químico Sinopharm</td><td>10017018</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Sinopharm Reagente</td><td>Químico 10021418</td><td></td></tr><tr><td>Mio-inositol&nbsp; &nbsp;</td><td>MACKLIN</td><td>I811835</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Nicotínico</td><td>MACKLIN</td><td>N814565</td><td></td></tr><tr><td>Piridoxina HCl</td><td>MACKLIN</td><td>V820447</td><td></td></tr><tr><td>Tiamina HCl</td><td>MACKLIN</td><td>T818865</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>MACKLIN</td><td>G800880</td><td></td></tr><tr><td>Ágar pó</td><td>Novon</td><td>ZZ14022</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de Fluorescência</td><td>Zeiss</td><td>Axio Zoom V16</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de dissecação</td><td>SDPTOP</td><td>SRE-1030</td><td></td></tr><tr><td>200&mu; l pipeta</td><td>Dragon Laboratory Instruments</td><td>713111110000-20-200ul</td><td></td></tr><tr><td>2.5&mu; l</td><td>pipeta Eppendorf</td><td>3120000011</td><td></td></tr><tr><td>Pinça fina&nbsp;</td><td>PINÇAS</td><td>ST-15</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>PARAFILM</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina dupla face em aço inoxidável</td><td>Gillette</td><td>Platinum-Plus Lâmina</td><td></td> dupla</tr></tbody></table>

shootward movimento de cfda tracer carregado no fundo pia tecidos de arabidopsis

Shootward Movement of CFDA Tracer Loaded in the Bottom Sink Tissues of Arabidopsis

O Tracer symplastic 5 (6)-o diacetato do carboxyfluorescein (CFDA) foi aplicado extensamente em plantas vivas para demonstrar a conexão intercelular, o transporte do floema e o patterning vascular. Este protocolo mostra o movimento de carboxifluoresceína (CF) de baixo para cima na Arabidopsis usando o procedimento de corte radicular e o hipocótilo-pinching, respectivamente. Estes dois procedimentos diferentes resultam em eficiências diferentes do movimento do CF: aproximadamente 91% de aparência de CF nos tiros com o procedimento hypocotyl-beliscando, visto que somente aproximadamente 70% de aparência de CF com o procedimento da raiz-estaca. A simples mudança de locais de carregamento, resultando em mudanças significativas na eficiência móvel deste corante symplastic, sugere que o movimento CF pode estar sujeito à regulação symplastic, provavelmente pela junção raiz-hipocótilo.

O movimento symplastic é frequentemente sujeito às flutuações ambientais. A perturbação do estado vegetante, e até mesmo o processo de preparo tecidual afetarão o limite de exclusão de tamanho de Plasmodesmata, afetando assim o transporte symplastic22. Para melhorar a eficiência de coloração, nós confinamos nossa operação na sala de crescimento, onde a temperatura ea umidade é firmemente controlada, e também executar todo o procedimento o mais rapidamente possível ...

O objetivo deste protocolo é mostrar como carregar o CFDA em diferentes locais das partes inferiores de Arabidopsis. Apresentamos, então, o padrão de distribuição resultante da FC nas brotações.

Shootward movimento de CFDA Tracer carregado no fundo pia tecidos de Arabidopsis

The symplastic tracer 5(6)-carboxyfluorescein diacetate (CFDA) has been widely applied in living plants to demonstrate the intercellular connection, ...

A sonda CFDA amplamente utilizada, ou abreviação de diacetato de carboxyfluorescein, não é fluorescente. Os dois grupos H3 e a posição de 3'6'' neste composto tornam-no membrana-permeante. Quando uma vez dentro das células, os acetatos celulares internos removerão os grupos de acetatos e liberarão a nova forma de CFDA.Isso é um carboxyfluorescein, ou o CF, que é fluorescente. E como essa nova forma é menos permeante de membrana, o peso, todas as células é mover-se através dos poros intercelulares, ou a plasmodesmaata nas plantas, que está fazendo deste diacetato a sonda ideal para estudar o transporte intercelular na atividade phloem. No vídeo de hoje, vamos demonstrar o CFD carregando na raiz e hipocotyl das plantas arabidopsis, respectivamente, e mostraremos como os dois procedimentos ligeiramente diferentes afetarão o movimento inferior ao topo desta sonda fluorescente.Alcançar resultados de coloração de forma consistente, armazenamos as sementes de Arabidopsis colhidas em quatro graus Celsius, armário de 40% de umidade. As sementes recém-colhidas armazenadas nesta condição por mais de sete dias são prontamente utilizadas para a semeadura. Para garantir que cada planta seja cultivada em um espaço relativamente semelhante na placa de Petri, estamos usando um cartão de grau de zona de sementes.Agora, molhando a ponta esterilizada, mergulhe nas sementes esterilizadas, e semeie as sementes um a um na posição designada. Depois de terminar a semeadura, selar a placa de Petri com parafilm e uma fita adesiva, colocá-los em uma caixa de placa de Petri para deixá-lo crescer verticalmente. Aqui estão as ferramentas que vamos usar neste experimento.Por favor, note que é melhor carregarmos o corante o mais rápido possível. Normalmente, você termina todo o processo em 10 a 15 minutos. Antes de realizarmos o experimento de carregamento CFDA, sempre preparamos uma nova solução CFDA.Aqui, diluir o CFDA de um milimão em cinco concentrações de micromolar com água antes de usar imediatamente. Corte o parafilm em pequenos pedaços em três por três milímetros de tamanho. Como há condensação na tampa e no fundo da placa de Petri, precisamos limpá-los com papel toalha para evitar que o corante flua ao redor.Uma pequena peça de parafilm é colocada sob a raiz. Levante as plantas e coloque-as na tampa. Corte as raízes cerca de 5 a 10 milímetros abaixo do hipocótel.Pegue as filmagens de volta nos pequenos pedaços de parafilm. Agora aplique cuidadosamente um CFDA microliter na extremidade de corte da raiz. Tente evitar contaminar todas as proto-plantas.Em seguida, cubra a tampa e deixe-as na sala de crescimento por duas horas. O Método hipocotyl-beliscando. A pequena peça de parafilme, como previamente preparado, é colocada sob a junção raiz-hipocotílico.Usamos um forecep para beliscar suavemente o hipocóclida perto do tecido radicular, e aplicar cuidadosamente 0,1 microliter CFDA no lado apertado e deixar a planta por duas horas. As fotos de nove a 12 dias após as plantas de coloração da zona. Todos eles mostram o padrão de coloração vascular tanto nos cotilledons quanto nas folhas verdadeiras.Apenas em um caso muito raro, a folha de cotilledon mostrou um padrão de coloração de meia folha. Então, basicamente, os dois métodos não fizeram diferença no padrão de coloração cf, no entanto, se realizarmos o carregamento de corante em cada vez mais plantas, descobrimos que os dois procedimentos dão uma diferença significativa na eficiência. Com o método de corte de raízes, cerca de 70% das plantas mostram o sinal fluorescente na filmagem.Mas a eficiência pode ser aumentada para 91% usando o método de beliscar hipocotyl. Também tentamos o método de beliscar raízes, mas esse método resulta na eficiência ainda menor, é de cerca de 30% Portanto, parece que a maneira de carregar o corante não explica a diferença de coloração. A diferença provavelmente está nos locais de carregamento, que podem ser separados por uma barreira simplástica.Mostramos como colocamos o CFDA nas raízes arabidopsis e hipocotyl. Usamos dois procedimentos ligeiramente diferentes, e estes dois procedimentos ligeiramente diferentes resultam em diferença significativa neste movimento inferior para o topo da sonda. Sugerimos que este método poderia nos ajudar a identificar uma potencial barreira siplástica para sinais de tiro derivados de raízes.

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