Name: Functionalization dos Cantialavancos do microscópio da força atômica com únicas-células de T ou único-partícula para a espectroscopia imunológica da força da único-pilha (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-10T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 6 s
Description: Aprenda a funcionalizar cantilevers de microscopia de força atômica com células T únicas para estudar interações imunológicas. Este método permite monitorar respostas celulares em tempo real.

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Este trabalho é apoiado pela Fundação Nacional de ciências naturais do programa geral da China (31370878), programa de chave estatal (31630023) e programa de grupo de pesquisa inovadora (81621002).

<ol><li>Benoit, M., Gabriel, D., Gerisch, G., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discrete+interactions+in+cell+adhesion+measured+by+single-molecule+force+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Discrete interactions in cell adhesion measured by single-molecule force spectroscopy.</a> Nature Cell Biology. 2 (6), 313-317 (2000).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strong+adhesion+by+regulatory+T+cells+induces+dendritic+cell+cytoskeletal+polarization+and+contact-dependent+lethargy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Strong adhesion by regulatory T cells induces dendritic cell cytoskeletal polarization and contact-dependent lethargy.</a> Journal of Experimental Medicine. 214 (2), 327-338 (2017).</li>
<li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanotransduction-modulated+fibrotic+microniches+reveal+the+contribution+of+angiogenesis+in+liver+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Mechanotransduction-modulated fibrotic microniches reveal the contribution of angiogenesis in liver fibrosis.</a> Nature Materials. 16 (12), 1252-1261 (2017).</li>
<li>Mu, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phosphatidylinositol+4%2C5-bisphosphate+redistribution-based+sensing+mechanism+initiates+a+phagocytosis+programing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate redistribution-based sensing mechanism initiates a phagocytosis programing.</a> Nature Communications. 9, (2018).</li>
<li>Qi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathology-targeted+cell+delivery+via+injectable+micro-scaffold+capsule+mediated+by+endogenous+TGase%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Pathology-targeted cell delivery via injectable micro-scaffold capsule mediated by endogenous TGase.</a> Biomaterials. 126, 1-9 (2017).</li>
<li>Muller, D. J., Helenius, J., Alsteens, D., Dufrene, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+probing+surfaces+of+living+cells+to+molecular+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Force probing surfaces of living cells to molecular resolution.</a> Nature Chemical Biology. 5 (6), 383-390 (2009).</li>
<li>Muller, D. J., Dufrene, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+microscopy%3A+a+nanoscopic+window+on+the+cell+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Atomic force microscopy: a nanoscopic window on the cell surface.</a> Trends in Cell Biology. 21 (8), 461-469 (2011).</li>
<li>Radotic, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+microscopy+stiffness+tomography+on+living+Arabidopsis+thaliana+cells+reveals+the+mechanical+properties+of+surface+and+deep+cell-wall+layers+during+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysics+Journal%22%5BJournal%5D)">Atomic force microscopy stiffness tomography on living Arabidopsis thaliana cells reveals the mechanical properties of surface and deep cell-wall layers during growth.</a> Biophysics Journal. 103 (3), 386-394 (2012).</li>
<li>Kuznetsova, T. G., Starodubtseva, M. N., Yegorenkov, N. I., Chizhik, S. A., Zhdanov, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+microscopy+probing+of+cell+elasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Atomic force microscopy probing of cell elasticity.</a> Micron. 38 (8), 824-833 (2007).</li>
<li>Scheuring, S., Dufrene, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+microscopy%3A+probing+the+spatial+organization%2C+interactions+and+elasticity+of+microbial+cell+envelopes+at+molecular+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Atomic force microscopy: probing the spatial organization, interactions and elasticity of microbial cell envelopes at molecular resolution.</a> Molecular Microbiology. 75 (6), 1327-1336 (2010).</li>
<li>Berdyyeva, T. K., Woodworth, C. D., Sokolov, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+epithelial+cells+increase+their+rigidity+with+ageing+in+vitro%3A+direct+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Physics+in+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Human epithelial cells increase their rigidity with ageing in vitro: direct measurements.</a> Physics in Medicine and Biology. 50 (1), 81-92 (2005).</li>
<li>Sokolov, I., Dokukin, M. E., Guz, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+quantitative+measurements+of+the+elastic+modulus+of+biological+cells+in+AFM+indentation+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Method for quantitative measurements of the elastic modulus of biological cells in AFM indentation experiments.</a> Methods. 60 (2), 202-213 (2013).</li>
<li>Bozna, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+strength+and+dynamics+of+invariant+natural+killer+cell+T+cell+receptor%2FCD1d-glycosphingolipid+interaction+on+living+cells+by+single+molecule+force+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Binding strength and dynamics of invariant natural killer cell T cell receptor/CD1d-glycosphingolipid interaction on living cells by single molecule force spectroscopy.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (18), 15973-15979 (2011).</li>
<li>Flach, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alum+interaction+with+dendritic+cell+membrane+lipids+is+essential+for+its+adjuvanticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Alum interaction with dendritic cell membrane lipids is essential for its adjuvanticity.</a> Nature Medicine. 17 (4), 479-487 (2011).</li>
<li>Ng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor-independent%2C+direct+membrane+binding+leads+to+cell-surface+lipid+sorting+and+Syk+kinase+activation+in+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Receptor-independent, direct membrane binding leads to cell-surface lipid sorting and Syk kinase activation in dendritic cells.</a> Immunity. 29 (5), 807-818 (2008).</li>
<li>Helenius, J., Heisenberg, C. P., Gaub, H. E., Muller, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+force+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Single-cell force spectroscopy.</a> Journal of Cell Science. 121 (11), 1785-1791 (2008).</li>
<li>Litvinov, R. I., Shuman, H., Bennett, J. S., Weisel, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+strength+and+activation+state+of+single+fibrinogen-integrin+pairs+on+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Binding strength and activation state of single fibrinogen-integrin pairs on living cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (11), 7426-7431 (2002).</li>
<li>Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+Force+Technique+to+Probe+Molecular+Adhesion+and+Structural+Linkages+at+Biological+Interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysics+Journal%22%5BJournal%5D)">Sensitive Force Technique to Probe Molecular Adhesion and Structural Linkages at Biological Interfaces.</a> Biophysics Journal. 68 (6), 2580-2587 (1995).</li>
<li>Lamprecht, C., Hinterdorfer, P., Ebner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+biosensing+atomic+force+microscopy+in+monitoring+drug+and+nanoparticle+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Delivery%22%5BJournal%5D)">Applications of biosensing atomic force microscopy in monitoring drug and nanoparticle delivery.</a> Expert Opinion on Drug Delivery. 11 (8), 1237-1253 (2014).</li>
<li>Charras, G. T., Horton, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+mechanotransduction+and+its+modulation+analyzed+by+atomic+force+microscope+indentation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysics+Journal%22%5BJournal%5D)">Single cell mechanotransduction and its modulation analyzed by atomic force microscope indentation.</a> Biophysics Journal. 82 (6), 2970-2981 (2002).</li>
<li>Sun, M. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+membrane+tethers+probed+by+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysics+Journal%22%5BJournal%5D)">Multiple membrane tethers probed by atomic force microscopy.</a> Biophysics Journal. 89 (6), 4320-4329 (2005).</li>
<li>Yan, J. C., Liu, B., Shi, Y., Qi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Class+II+MHC-independent+suppressive+adhesion+of+dendritic+cells+by+regulatory+T+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Class II MHC-independent suppressive adhesion of dendritic cells by regulatory T cells in vivo.</a> Journal of Experimental Medicine. 214 (2), 319-326 (2017).</li>
<li>Hao, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipase+C-mediated+hydrolysis+of+PIP2+releases+ERM+proteins+from+lymphocyte+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Phospholipase C-mediated hydrolysis of PIP2 releases ERM proteins from lymphocyte membrane.</a> Journal of Cell Biology. 184 (3), 451-462 (2009).</li>
<li>Rodriguez, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocyte-T+Adhesion+to+Fibronectin+%28Fn%29+-+a+Possible+Mechanism+for+T-Cell+Accumulation+in+the+Rheumatoid+Joint%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Immunology%22%5BJournal%5D)">Lymphocyte-T Adhesion to Fibronectin (Fn) - a Possible Mechanism for T-Cell Accumulation in the Rheumatoid Joint.</a> Clinical and Experimental Immunology. 89 (3), 439-445 (1992).</li>
<li>Kimura, A., Ersson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+Lymphocytes-T+by+Lectins+and+Carbohydrate-Oxidizing+Reagents+Viewed+as+an+Immunological+Recognition+of+Cell-Surface+Modifications+Seen+in+the+Context+of+Self+Major+Histocompatibility+Complex+Antigens%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Activation of Lymphocytes-T by Lectins and Carbohydrate-Oxidizing Reagents Viewed as an Immunological Recognition of Cell-Surface Modifications Seen in the Context of Self Major Histocompatibility Complex Antigens.</a> European Journal of Immunology. 11 (6), 475-483 (1981).</li>
<li>Miller, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Stimulation+of+Human+Lymphocyte-B+and+Lymphocyte-T+by+Various+Lectins%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">The Stimulation of Human Lymphocyte-B and Lymphocyte-T by Various Lectins.</a> Immunobiology. 165 (2), 132-146 (1983).</li>
<li>Vitte, J., Pierres, A., Benoliel, A. M., Bongrand, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+quantification+of+the+modulation+of+interaction+between+cell-+or+surface-bound+LFA-1+and+ICAM-1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Direct quantification of the modulation of interaction between cell- or surface-bound LFA-1 and ICAM-1.</a> Journal of Leukocyte Biology. 76 (3), 594-602 (2004).</li>
<li>Beaussart, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+the+forces+guiding+microbial+cell+adhesion+using+single-cell+force+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Quantifying the forces guiding microbial cell adhesion using single-cell force spectroscopy.</a> Nature Protocols. 9 (5), 1049-1055 (2014).</li>
<li>Shu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholesterol+Crystal-Mediated+Inflammation+Is+Driven+by+Plasma+Membrane+Destabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cholesterol Crystal-Mediated Inflammation Is Driven by Plasma Membrane Destabilization.</a> Frontiers in Immunology. 9, (2018).</li>
<li>Hosseini, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+synapse+formation+determines+interaction+forces+between+T+cells+and+antigen-presenting+cells+measured+by+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Immune synapse formation determines interaction forces between T cells and antigen-presenting cells measured by atomic force microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (42), 17852-17857 (2009).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A espectroscopia da força da único-pilha baseada em AFM evoluiu para ser uma ferramenta poderosa para endereçar as propriedades biofísicas de pilhas vivas. Para essas aplicações, o cantilever precisa ser funcionalizada corretamente, a fim de sondar interações específicas ou propriedades sobre as células de interesse. Aqui, os métodos para acoplando a única pilha de T e a única grânulo Micron-feitos medida ao modilhão Tip-less são descritos respectivamente. Para prender uma única pilha de T ao cantilever, uma colagem bioc...

A microscopia da força atômica (AFM), uma ferramenta versátil, encontrou muitas aplicações na pesquisa da biologia da pilha1,2,3,4,5. Aparte de sua capacidade de imagem latente de alta resolução, a característica da força-sondagem nativa permite que as propriedades biofísicas de pilhas vivas sejam investigadas diretamente in situ no nível da único-pilha6,7. Estes incluem a rigidez de estruturas subcelulares ou mesmo células inteiras8,9,10,11,12, ligante específico/receptor de forças de ligação no nível de molécula única na superfície celular13, e forças de aderência entre pares de partículas sólidas e células ou entre duas células1,2,14,15. Os dois últimos são frequentemente categorizados como espectroscopia de força de célula única (SCFS)16. Devido aos cantialavancos prontamente disponíveis com vária mola constante, a escala da força acessível a AFM é rather larga de alguns piconewtons (pN) aos micronewtons (μN), que cobre adequadamente a escala inteira de eventos celulares que envolvem forças de algumas dezenas de pN, como ligação de molécula única baseada em receptores, a nN, como eventos celulares fagocíticos15. Esta grande escala dinâmica da força faz AFM vantajoso sobre outras técnicas da forçar-sondagem tais como pinças óticos/magnéticos e uma ponta de prova da força do biomembrana, porque são mais apropriadas para medidas da fraco-força, com força tipicamente menos do que 200 PN17 , 18. Além disso, AFM pode funcionar como um manipulador de alta precisão para entregar vários estímulos em células individuais em uma forma espaciotemporalmente definida4,19. Isso é desejável para os estudos de ativação de célula única em tempo real. Combinada com a imagem latente da fluorescência da vivo-pilha, a resposta celular subseqüente ao estímulo específico pode ser monitorada simultaneamente, assim fazendo o SCFS AFM-baseado excessivamente robusto como a imagem latente ótica que fornece uma ferramenta prática para sondar a sinalização celular. Por exemplo, AFM foi utilizado para determinar as cepas necessárias para provocar transientes de cálcio em osteoblastos20. Neste trabalho, os transientes do cálcio foram controlados cDNAs com a imagem latente ratiométrica do cálcio após a aplicação de forças localizadas em osteoblastos cultivados com uma ponta de AFM. Recentemente, AFM foi empregado para esticar as fibrilas do colagénio em que as pilhas stellate hepatic (HSC) estiveram crescidas e esta ativação mechano-transaculada de HSC era tempo real monitorado por um biosensor fluorescente do src, cuja o fosforilação como representado pelo a intensidade da fluorescência do biosensor é correlacionada com a ativação de HSC3.
Em experimentos SCFS baseados em AFM, a funcionalização adequada de cantimanhas AFM é um passo fundamental para medições bem-sucedidas. Desde que nosso interesse da pesquisa centra-se sobre a ativação das pilhas imunes, nós funcionamos rotineiramente cantialavancas com matérias particuladas tais como únicas partículas contínuas que podem provocar o fagocitose e/ou respostas imunes fortes4,14 , 15 e células T únicas que podem formar uma sinapse imune com células apresentadoras de antígeno, como células dendríticas ativadas (DC)2. As únicas partículas contínuas são acopladas normalmente a um cantilever através de uma colagem da cola Epoxy no ambiente do ar, visto que as únicas pilhas de T, devido a sua natureza não-adesiva, são funcionalizadas a um cantilever através de uma colagem biocompatível na solução. Aqui, descrevemos os métodos para executar esses dois tipos de modificação cantilever e dar duas aplicações associadas também. A primeira aplicação é sondar interações de T Cell/DC com AFM-SCFS para compreender o mecanismo supressor de células T reguladoras do ponto de vista da mecânica celular. O segundo envolve a combinação de AFM com a imagem latente da fluorescência da vivo-pilha para monitorar a resposta celular do macrófago a uma partícula contínua no tempo real para revelar o mecanismo molecular do fosfatidilinositol receptor-independente 4, 5-bisphosphate (PIP2)- Moesin mediou a fagocitose. O objetivo deste protocolo é fornecer um quadro de referência para que pesquisadores interessados projetem e implementem seus próprios parâmetros experimentais com análise de células simples baseadas em AFM para pesquisa imunológica.

<table><tbody><tr><td><forte>Material</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 &mu; l ponta de pipeta</td><td>Thermo Fisher</td><td>104-Q</td><td></td></tr><tr><td>tubo de 15 ml</td><td>Corning</td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td>placa de cultura de 6 cm de diâmetro</td><td>NALGENE nunc</td><td>150462</td><td></td></tr><tr><td>placa de cultura de 6 poços</td><td>JET</td><td>TCP011006</td><td></td></tr><tr><td>AFM Cantilever</td><td></td><td>NanoWorld Arrow-TL1-50</td><td>cantilever sem ponta</td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>7604</td><td></td></tr><tr><td>Cola biocompatível</td><td>BD Cell-Tak</td><td>354240</td><td></td></tr><tr><td>Isolamento de células T CD4 + Coquetel</td><td>STEMCELL</td><td>19852C.1</td><td></td></tr><tr><td>DC2.4 linha celular</td><td>Um presente de K. Rock (University of Massachusetts Medical School, Worcester, MA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Partículas magnéticas revestidas com dextrana</td><td>STEMCELL</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>GENEray</td><td>Generay-E1101-500 ml</td><td></td></tr><tr><td>Epóxi</td><td>ERGO</td><td>7100</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>twbio</td><td>00019</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Ex Cell Bio</td><td>FSP500</td><td></td></tr><tr><td>Bloqueador FcR</td><td>STEMCELL</td><td>18731</td><td></td></tr><tr><td>Lamínula de vidro</td><td>vendedor local (Hai Men Lian Sheng)</td> <td>HX-E37</td><td>24mm de diâmetro, 0,17mm thinckness</td></tr><tr><td>Lâminas</td> <td>de vidroDepartamento de gerenciamento de laboratórios e equipamentos da JinTong, Haimen&nbsp;</td><td>N / A</td><td>personalizado</td></tr><tr><td>H2O2 (30%)</td> <td>Sino pharm</td><td>10011218</td><td></td></tr><tr><td>H2SO4</td><td>Sino pharm</td><td>80120892</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>51558</td><td></td></tr><tr><td>Ímã</td><td>STEMCELL</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>Malha filtro de nylon</td><td>BD</td><td>Falcon REF 352350</td><td></td></tr><tr><td>Moesin-EGFP</td><td>N / A</td><td></td><td>clonado em laboratório</td></tr><tr><td>Kit de isolamento positivo de células Treg CD25 de camundongo</td><td>STEMCELL</td><td>18782</td><td>Componente: Bloqueador FcR, Coquetel de Seleção Positiva de Células T Reguladoras, Coquetel de Seleção PE, Dextran RapidSpheres,</td></tr> <tr><td>Mouse CD4+ Kit de isolamento de células T</td><td>STEMCELL</td><td>19852</td><td>Componente: Isolamento de células T CD4 + Coquetel, Streptavidin RapidSpheres, produtos</td></tr><tr>químicos co. de<td>NaOH</td><td>Lanyi do soro do rato., LTD? Beijing</td><td>1310-73-2</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Solarbio</td><td>P1022-500</td><td></td></tr><tr><td>PE seleção cocktail</td><td>STEMCELL</td><td>18151</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>PLC&delta;-PH-mCherry</td><td>Addgene</td><td>36075</td><td></td></tr><tr><td>Microesferas de poliestireno 6.0&mu; m</td><td>Polysciences</td><td>07312-5</td><td></td></tr><tr><td>tubo de fundo redondo de poliestireno</td><td>BD Falcon</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>Soro de rato</td><td>STEMCELL</td><td>13551</td><td></td></tr><tr><td>RAW264.7</td><td>&nbsp; ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Interleucina-2 Humana Recombinante</td><td>Peprotech</td><td>Peprotech, 200-02-1000</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de lise de glóbulos vermelhos</td><td>Beyotime</td><td>C3702</td><td></td></tr><tr><td>Coquetel de seleção positiva de células T reguladoras</td><td>STEMCELL</td><td>18782C</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td> Câmara <td>de amostra de C11875500BT</td><td></td><td>de vida</td></tr><tr><td></td><td>Caseiro</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Partículas magnéticas revestidas com estreptavidina</td><td>STEMCELL</td><td>50001</td><td></td></tr><tr><td>Kit de transfecção</td><td>Clontech</td><td>631318</td><td></td></tr><tr><td>tripsina 0,25% EDTA</td><td>Vida útil</td><td>25200114</td><td></td></tr><tr><td>pinças</td><td>JD</td><td>N / A</td><td></td></tr> <tr><td>< forte > nome< / forte ></td> <td>< forte > empresa < / forte ></td> <td>< forte > número de catálogo< / forte ></td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Equipamento</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20x objetiva NA 0,8</td><td>Zeiss</td><td>420650-9901</td><td>Microscópio de força atômica apocromático plana</td></tr><tr><td></td><td></td><td>JPK cellHesion200</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Beckman relha</td><td>Allegra X-12R</td><td></td></tr><tr><td>Imagem de fluorescência</td><td>microscop de fluorescência de reflexão interna total do tipo objetivo caseiro baseado em um suporte</td><td></td><td></td>de microscópio Zeiss</tr><tr><td>Incubadora de CO2 umidificado</td><td>Thermo Fisher</td><td>HERACELL 150i</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de luz invertida</td><td>Zeiss</td><td>Observer A1 manual</td><td></td></tr></tbody></table>

functionalization dos cantialavancos do microscópio da força atômica com únicas-células de t ou único-partícula para a espectroscopia imunológica da força da único-pilha

Functionalization of Atomic Force Microscope Cantilevers with Single-T Cells or Single-Particle for Immunological Single-Cell Force Spectroscopy

A microscopia de força atômica baseou a espectroscopia da força da única pilha (AFM-SCFS) é uma ferramenta poderosa para estudar Propriedades biofísicas de pilhas vivas. Esta técnica permite a sondagem de pontos fortes e dinâmicas de interação em uma membrana celular viva, incluindo aquelas entre células, receptores e ligantes, e ao lado de muitas outras variações. Igualmente trabalha como um mecanismo para entregar um estímulo físico ou bioquímico em únicas pilhas em uma maneira spatiotemporally controlada, assim permitindo a ativação específica da pilha e os eventos celulares subseqüentes a ser monitorados no tempo real quando combinados com a viver-pilha imagem latente da fluorescência. O passo chave nessas medições AFM-SCFS é a funcionalização do AFM-cantilever, ou seja, anexar um assunto de interesse ao cantilever. Aqui, nós apresentamos métodos para modificar cantialavancas de AFM com uma única pilha de T e um único grânulo do poliestireno respectivamente para estudos imunológicos. O primeiro envolve uma colagem biocompatível que acopla únicas pilhas de T à ponta de um cantilever liso em uma solução, quando o último depender em uma colagem da cola Epoxy para a única aderência do grânulo no ambiente do ar. Duas aplicações imunológicas associadas a cada modificação do cantilever são fornecidas também. Os métodos descritos aqui podem ser facilmente adaptados a diferentes tipos de células e partículas sólidas.

A figura 4a mostra curvas de força-distância típicas da interação de ligação entre a célula single-T e o single-DC em um ciclo de retração de abordagem. A curva vermelha clara é a curva da extensão e o vermelho escuro um é a curva da retração. Desde que a curva da extensão é usada tipicamente para o recuo ou a rigidez-análise, aqui somente a curva da retração é concernida para a adesão da pilha. O valor mínimo (o círculo verde) na curva dá uma medida da força...

Nós apresentamos um protocolo para funcionalizar cantialavancas do microscópio de força atômica (AFM) com uma única pilha de T e partícula do grânulo para estudos imunológicos. Os procedimentos para sondar a ligação Cell-dendritic do único-par célula T por AFM e monitorar a resposta celular em tempo real dos macrófagos a uma única partícula contínua pelo AFM com imagem latente da fluorescência são mostrados.

Functionalization dos Cantialavancos do microscópio da força atômica com únicas-células de T ou único-partícula para a espectroscopia imunológica da força da único-pilha

Atomic force microscopy based single cell force spectroscopy (AFM-SCFS) is a powerful tool for studying biophysical properties of living cells. This ...

Este protocolo descreve a melhor forma de funcionalizar os cantilevers AFM usando células T únicas e partículas sólidas. Essas dicas podem então ser usadas para sondar interações células T dendríticas de um par único e monitorar respostas celulares de tamanho instável, respectivamente. Uma das principais vantagens dessa técnica é que ela usa uma cola biocompatível para a funcionalização de células T únicas de cantilevers.Esta cola é inerte para células eucarióticas, mantendo assim as células T em seu estágio de ativação da linha de base. Esses métodos fornecem informações sobre a ativação de células imunes e eventos intercelulares complexos, como a formação de sinapse imunológica. Os métodos também podem ser estendidos a outros sistemas que envolvam interações célula-célula ou superfície celular.Para alguém que é novo nesta técnica, é importante ter certeza de que as células T estão em boas condições antes do uso e que elas são pré-tratadas com IL-2 durante a noite. Além disso, ao usar a cola biocompatível, mova-se rapidamente para protegê-la da oxidação desnecessária. Para iniciar este procedimento, prepare as células T únicas para microscopia seguindo o protocolo de texto.Em seguida, prepare as tampas de vidro semeadas com células DC2.4 e incuba as células durante a noite em uma câmara umidificada a 37 graus Celsius e 5%de CO2. Limpe cantilevers macios e sem ponta com uma baixa constante de mola usando tratamento de piranha, limpeza de plasma ou limpeza de UV-ozônio. Em seguida, monte o cantilever limpo na cabeça de varredura AFM.Em seguida, prepare uma câmara de amostra limpa, e encha-a com água pura. Calibrar a cantilever na solução de água executando primeiro uma curva de força no substrato de vidro para obter a sensibilidade do cantilever. Em seguida, grave um espectro de ruído térmico para extrair a constante da mola.Quando o cantilever estiver devidamente calibrado, remova a cabeça de varredura AFM da solução. Lave o cantilever montado com algumas gotas de etanol puro, e mantenha o cantilever seco na cabeça de varredura. Pré-aqueça um compartimento de ambiente de célula viva a 37 graus Celsius com 5% de CO2.Em seguida, monte o deslizamento de tampa de vidro semeado com células DC2.4 para o conjunto da câmara de amostra, e adicione imediatamente 600 microliters de Médio B à câmara. Coloque o conjunto completo no estágio de amostra AFM. Adicione células T cd4-positivas incubadas pelo IL-2 na câmara de amostra.Aguarde até que as células T de alvo estejam totalmente estabelecidas na parte inferior da tampa e, em seguida, traga as células para o campo de visão sob o microscópio. Agora, adicione uma gota de dois microliter de cola biocompatível na extremidade do cantilever montado com uma pipeta. Uma vez aplicada a cola biocompatível ao cantilever, as etapas subsequentes precisam ser concluídas o mais rápido possível, a fim de maximizar a adesão.Coloque rapidamente a cabeça de varredura no estágio da amostra, imergindo o cantilever revestido de cola na solução. Mova o estágio da amostra até que uma célula T saudável esteja localizada abaixo da ponta do cantilever. Em seguida, ajuste bem sua posição movendo a cabeça de varredura.Em seguida, abaixe o cantilever manualmente. Comece com um tamanho de passo de 50 mícrons, e depois diminua para 10, cinco e dois e, finalmente, 0,5 mícrons gradualmente, como indicado pela nitidez da imagem cantilever. Agora, mantenha a posição dos motores do passo, e ajuste o posicionamento da cabeça de varredura para alinhar melhor a ponta cantilever e a célula.Continue até que o contato firme seja indicado por um pequeno deslocamento da posição do laser, correspondendo a uma força típica de 0,5 a 1,5 nanonovos. Após 30 segundos de contato, retraia o cantilever. Se a célula se mover com o cantilever, o acessório foi bem sucedido.Se não, repita o passo de adesão até três vezes antes de mudar para um novo cantilever. Posicione a célula T anexada acima de uma célula DC2.4 movendo o estágio da amostra e a cabeça de varredura. Depois de configurar parâmetros adequados, execute a espectroscopia de força sobre a amostra.Para uma nova rodada de sondagem, monte uma nova cantilever limpa. Calibrar em água pura, e depois voltar para um par de células T e repetir a varredura. Monte uma tampa de vidro limpo para a montagem da câmara de amostra.No lado esquerdo da tampa, adicione uma gota de uma solução de contas que foi diluída em etanol e contém contas de poliestireno de seis mícrons de diâmetro. Uma vez que o solvente evaporar, verifique o espaçamento das contas usando um microscópio de campo brilhante equipado com um objetivo de 20x. Certifique-se de que as contas individuais estão bem separadas.Em seguida, mergulhe uma ponta de micropipette ou um palito em uma cola epóxi bem misturada, e transfira uma pequena quantidade da cola para três pontos separados com toques suaves sucessivos no lado direito, mas perto do centro da tampa, como mostrado aqui. Em seguida, monte uma cantilever limpa e sem ponta na cabeça de varredura AFM e calibra-a no ar com uma superfície limpa para obter a constante de mola. Em seguida, posicione a ponta cantilever sobre o limite esquerdo do último ponto de cola epóxi, e lentamente traga o cantilever perto da cola usando pequenos tamanhos de passo nos motores stepper.Uma vez feito contato com a cola, puxe rapidamente o cantilever lateralmente movendo a cabeça de varredura AFM para trás. Remova qualquer excesso de cola esfregando-a contra o vidro, deixando apenas uma pequena quantidade da cola na extremidade da ponta. Agora, mova a ponta cantilever em cima de uma pérola bem isolada.Aproxime-se da única pérola lentamente, e faça um contato firme com ele na faixa de dois a cinco nanonovos por cerca de 10 segundos. Ao fazer contato, use ajuste de ponta fina para posicionar a conta no final da ponta. Retraia a ponta no final do contato.Se a conta desaparecer do plano focal original, ocorreu um evento de adesão bem sucedido. Finalmente, desmonte a cantilever modificada com cuidado, e armazene-a em uma caixa de cantilever durante a noite para que o epóxi cure totalmente. Aqui estão as típicas curvas de distância de força da interação de ligação entre uma única célula T e uma única célula dendrítica ao longo de um ciclo de retração de aproximação.A curva vermelha clara é a curva de extensão, e a vermelha escura é a curva de retração. O valor mínimo na curva dá uma medida da força máxima de adesão entre a célula T e a célula dendrítica, e a área sob a curva representa o trabalho necessário para separá-los. Os eventos de ruptura acentuada e passo a passo podem ser interpretados como amarras de membrana sendo retiradas da superfície celular devido à forte ligação na interface célula-célula e, em seguida, quebrando discretamente sob o puxão contínuo.Aqui, a ligação convencional de células T às células dendríticas é mostrada em cinza, e a ligação regulatória de células T às células dendríticas é mostrada em azul. As forças de adesão entre uma célula T convencional e uma célula T regulatória reconhecem antígenos de peptídeos apresentados por células que apresentam antígenos, enquanto as células T regulatórias são células T supressoras que desligam a imunidade convencional mediada por células T no final de uma reação imune. Este esquema de uma célula RAW 264.7 de rotulagem fluorescente mostra a célula sendo abordada com um único diâmetro nu de seis mícrons, contas de poliestireno.Ao engajar a conta, a membrana PIP2 é classificada no local de contato, próximo a B, que então induz o recrutamento de membrana de moesina, resultando em um evento fagocítico. Além do procedimento descrito aqui, a espectroscopia de força unicelular baseada em AFM pode ser usada juntamente com imagens de fluorescência para estudar a ativação de células imunes em tempo real no nível de célula única. Técnicas combinadas de fluorescência, este método permite abordar processos celulares mais complexos em tempo real, como a formação de uma sinapse imunológica entre células dendríticas e par de células T.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

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