Name: Estudando infecção por Cryptosporidium em sistemas de cultura Organóide humano derivado do tecido 3D por microinjeção (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 31 s
Description: Aprenda a purificar esporozoítos de Cryptosporidium parvum e microinjetar em organoides intestinais humanos 3D. Este método permite estudar interações hospedeiro-patógeno com precisão e visualização por imunocoloração.

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Agradecemos a Deborah a. Schaefer, da escola de Ciências Biomédicas de animais e comparativos, da faculdade de agricultura e ciências biológicas da Universidade do Arizona, Tucson, AZ, EUA, por nos ajudar com a produção e análise do oocisto. Nós igualmente Agradecemos o centro da microscopia e da imagem latente de Franceschi e o DL Mullendore na Universidade de estado de Washington para a preparação e a imagem latente de ooocysts organoid isolados.
D.D. é o beneficiário de um subsídio de VENI da organização neerlandesa para a investigação científica (NWO-ALW, 016. Veni. 171.015). I.H. é o beneficiário de uma subvenção VENI da organização neerlandesa de investigação científica (NWO-ALW, 863.14.002) e foi apoiado por bolsas Marie Curie da Comissão Europeia (proposta 330571 FP7-PEOPLE-2012-IIF). A investigação que conduz a estes resultados recebeu financiamento do Conselho Europeu de investigação no âmbito do acordo de subvenção avançado do ERC n. º 67013 e da NIH NIAIH R21 AT009174 à RMO. Este trabalho faz parte do Instituto Oncode, que é parcialmente financiado pela sociedade holandesa do cancro e foi financiado por uma subvenção da sociedade holandesa do cancro.

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<li>Wilke, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+Antibodies+to+Intracellular+Stages+of+Cryptosporidium+parvum+Define+Life+Cycle+Progression+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22mSphere%22%5BJournal%5D)">Monoclonal Antibodies to Intracellular Stages of Cryptosporidium parvum Define Life Cycle Progression In Vitro.</a> mSphere. 3 (3), (2018).</li>
<li>Vinayak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+modification+of+the+diarrhoeal+pathogen+Cryptosporidium+parvum%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genetic modification of the diarrhoeal pathogen Cryptosporidium parvum.</a> Nature. 523 (7561), 477-480 (2015).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A cultura de parasitas de Cryptosporidium em organóides intestinais e de vias aéreas fornece um modelo preciso para estudar interações parasita-hospedeiro10 , mas também tem muitas outras aplicações. Por exemplo, os métodos atuais de seleção e propagação de parasitas de Cryptosporidium geneticamente modificados necessitam de passagem em camundongos19 , o que não permite o isolamento de parasitas que têm modificações essenciais para a infecção in vivo. A cu...

O desenvolvimento de medicamentos ou vacinas para tratamento e prevenção da infecção por Cryptosporidium tem sido dificultado pela falta de sistemas in vitro que imitam precisamente a situação in vivo em humanos1,2. Muitos dos sistemas atualmente disponíveis permitem apenas a infecção a curto prazo (< 5 dias) ou não suportam o ciclo de vida completo do parasita3,4. Outros sistemas que permitam o desenvolvimento completo do parasita são baseados em linhas celulares imortalizadas ou linhas de células cancerosas que não recapitulam fielmente a situação fisiológica em humanos5,6,7 . Organóides ou ' miniórgãos ' são estruturas derivadas de tecido 3D que são cultivadas em uma matriz extracelular suplementada com vários fatores de crescimento específicos do tecido. Organóides foram desenvolvidos a partir de vários órgãos e tecidos. Eles são geneticamente estáveis e recapitulam a maioria das funções dos órgãos de sua origem, e podem ser mantidos em cultura por longos períodos de tempo. Nós desenvolvemos um método para infectar organóides intestinais e pulmonares humanos com Cryptosporidium que fornece um modelo in vitro exato para o estudo de interações hospedeiro-parasita relevantes para a criptosporidiose intestinal e respiratória8 ,9,10,11,12,13. Em contraste com outros modelos de cultura publicados, o sistema organoide é representativo das interações do parasita hospedeiro da vida real, permite a conclusão do ciclo de vida para que todos os estágios do ciclo de vida do parasita possam ser estudados, e mantém a propagação do parasita até 28 dias10.
O Cryptosporidium parvum é um parasita apicomplexum que infecta o epitélio dos tratos respiratório e intestinal, causando doença diarreica prolongada. A fase ambiental resistente é o oocisto, encontrado em alimentos contaminados e água14. Uma vez ingerido ou inalado, o oocisto excistos e libera quatro esporozoítos que se unem às células epiteliais. Os esporozoítos deslizam sobre as células hospedeiras e envolvem receptores de células hospedeiras, mas o parasita não invade totalmente a célula, e parece induzir a célula hospedeira a engolir15. O parasita, que é internalizado dentro de um compartimento intracelular mas extracytoplasmic, permanece na superfície apical da pilha, replicando dentro de um vacuole do vacúolos parasitóforos. Ele sofre duas rodadas de reprodução assexuada — um processo chamado merogonia. Durante a merogonia, o tipo I meronts desenvolve que contêm oito merozoítos que são liberados para invadir novas células. Estes merozoítos invadem novas células para se desenvolverem em merontes tipo II contendo quatro merozoítos. Estes merozoites, quando liberados, infectam as células e se desenvolvem em macrogamonts e microgamonts. Microgametas são liberados e fertilizar os macrogametas produzindo zigotos que amadurecem em oocistos. Os oocistos maduros são liberados subseqüentemente no lúmen. Os oocistos são ou de paredes finas que imediatamente exquisto para reinfectar o epitélio, ou paredes grossas que são liberados para o ambiente para infectar o próximo hospedeiro14. Todas as etapas do ciclo de vida de Cryptosporidium foram identificadas no sistema de cultivo organoide previamente desenvolvido pelo nosso grupo10.
Como os organóides humanos replicam fielmente os tecidos humanos9,11,13, e apoiam todos os estágios replicativos do Cryptosporidium10, eles são o sistema ideal de cultura tecidual para estudar Biologia de Cryptosporidium e interações hospedeiro-parasita. Aqui nós descrevemos os procedimentos para infectar organóides com oocistos do Cryptosporidium e os sporozoites metacercárias, e isolando os ooocysts novos produzidos neste sistema da cultura do tecido.

<table><tbody><tr><td>Extrato de membrana basal (matriz extracelular)</td><td>amsbio</td><td>3533-010-02</td><td>&nbsp; </td></tr><tr><td>Crypt-a-Glo anticorpo (anticorpo específico para Oocyst)</td><td>Waterborne, Inc</td><td>A400FLR-1X</td><td>Concentração Final = Use 2-3 gotas/lâmina</td></tr><tr><td>Contas magnéticas revestidas com IgM Crypto-Grab</td><td>Waterborne, Inc</td><td>IMS400-20</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Dynamag 15 rack</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>12301D</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Dynamag 2 rack</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>12321D</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>EMD Millipore&nbsp; Filtros de Membrana de Policarbonato Isopore - 3&micro; m</td><td>EMD-Millipore</td><td>TSTP02500</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Corante verde rápido</td><td>SIGMA</td><td>F7252-5G&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Microinjetor Femtojet 4i</td><td>Eppendorf</td><td>5252000013</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Capilares de vidro de 1 mm de diâmetro</td><td>WPI</td><td>TW100F-4</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Matrigel (matriz extracelular)</td> <td>Corning</td><td>356237</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tubo de microfuga 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>T9661-1000EA&</td><td>nbsp;</td></tr><tr><td>Pontas de micro-carregador</td><td>Eppendorf</td><td>612-7933</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Extrator de micropipetas P-97</td><td>Instrumento de obturador</td><td>P-97</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Soro de burro normal</td><td>Bio-Rad</td><td>C06SB&</td><td>nbsp;</td></tr><tr><td>Penstrep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Hipoclorito de sódio (use 5%)</td><td>Clorox</td><td>50371478</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Slides super stick</td><td>Waterborne, Inc</td><td>S100-3</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Swinnex-25 47 mm Suporte de filtro de policarbonato</td><td>EMD-Millipore</td><td>SX0002500</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Ácido taurocólico de hidrato de sal de sódio</td><td>SIGMA</td><td>T4009-5G</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Merck</td><td>8221840500</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Agente de montagem Vectashield</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Vortex Genie 2</td><td>Scientific industries, Inc</td><td>SI0236</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Adv+++ (DMEM+Penstrep+Glutamax+Hepes)</td><td>&nbsp; </td><td>&nbsp; </forte></td><td><forte>Quantidade final</forte></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>12634-010</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Penstrep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>5 mL de estoque em 500 mL DMEM</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050038</td><td>5 mL de estoque em 500 mL DMEM</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Gibco</td><td>15630056</td><td>5 mL de estoque em 500 mL DMEM</td></tr><tr><td><forte> MEIO ORGANOIDE INTESTINAL-OME (Meio de expansão)</forte></td><td><forte>&nbsp; </td><td>&nbsp; </forte></td><td><forte>Concentração final</forte></td></tr><tr><td>A83-01</td><td>Tocris</td><td>2939-50mg</td><td>0,5 &micro; M</td></tr><tr><td>Adv+++</td><td>&nbsp;</td><td>&nbsp;</td><td>perfazer até 100 ml</td></tr><tr><td>B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504044</td><td>1x</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td>50 ng/mL</td></tr><tr><td>Gastrin</td><td>Tocris</td><td>3006-1mg</td><td>10 nM</td></tr><tr><td>NAC</td><td>Sigma</td><td>A9125-25G</td><td>1.25</td></tr><tr><td>mM NIC</td><td>Sigma</td><td>N0636-100G</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Noggin CM</td><td>In house*</td><td>&nbsp;</td><td>10% de sucesso</td></tr><tr><td>Inibidor de P38 (SB202190)</td><td>Sigma</td><td>S7076-25 mg</td><td>10 &micro; M</td></tr><tr><td>PGE2</td><td>Tocris</td><td>2296/10</td><td>10 nM</td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pm-1</td><td>1 mL/500 mL de mídia</td></tr><tr><td>RSpoI CM</td><td>In house*</td><td>&nbsp;</td><td>20% de sucesso</td></tr><tr><td>Wnt3a CM</td><td>Em casa*</td><td>&nbsp;</td><td>50% de sucesso</td></tr><tr><td>In house* - linhas celulares serão fornecidas mediante solicitação</td><td>&nbsp;</td><td>&nbsp;</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td><forte>MEIO ORGANOIDE INTESTINAL-OMD (Meio de diferenciação)</forte></td><td>&nbsp;</td><td>&nbsp;</td><td>Para diferenciar os organoides, os organoides do intestino delgado em expansão foram cultivados em meio rico em Wnt por seis a sete dias após a divisão e, em seguida, cultivados em meio de diferenciação (retirada de Wnt, nicotinamida, SB202190, em meio de diferenciação (retirada de Wnt, nicotinamida, SB202190, prostaglandina E2 de um meio rico em Wnt ou OME)</td></tr><tr><td><forte>MEIOS ORGANOIDES PULMONARES (meios de diferenciação)</td><td>&nbsp; </td><td>&nbsp; </td><td>Concentração final</td></tr><tr><td>Adv+++</td><td>&nbsp;</td><td>&nbsp;</td><td>perfazer até 100 ml</td></tr><tr><td>ALK-I A83-01</td><td>Tocris</td><td>2939-50mg</td><td>500 nM</td></tr><tr><td>B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504044</td><td>0,0763888889</td></tr><tr><td>FGF-10</td><td>Peprotech</td><td>100-26</td><td>100 ng/mL</td></tr><tr><td>FGF-7</td><td>Peprotech</td><td>100-19</td><td>25 ng/mL</td></tr><tr><td>N-Acetilcisteína</td><td>Sigma</td><td>A9125-25G</td><td>1,25 mM</td></tr><tr><td>Nicotinamida</td><td>Sigma</td><td>N0636-100G</td><td>5 mM</td></tr><tr><td>Noggin UPE</td><td>U-Protein Express</td><td>Entre em contato diretamente com a empresa</td><td>10%</td></tr> <tr><td>p38 MAPK-I</td><td>Sigma</td><td>S7076-25 mg</td><td>1 &micro; M</td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pm-1</td><td>1:500</td></tr><tr><td>RhoKI Y-27632</td><td>Abmole Bioscience</td><td>M1817_100 mg</td><td>2.5 &micro; m</td></tr><tr><td>Rspo UPE</td><td>U-Protein Express</td><td>Entre em contato direto com a empresa</td><td>10%</td></tr><tr><td>Reducing buffer (para ressuspensão de oocistos e esporozoítos para injeção)</td><td>&nbsp; </td><td>&nbsp; < / forte ></td> <td>< forte > concentração final< / forte ></td></tr> <tr><td>L-glutationa reduzida</td><td>Sigma</td><td>G4251-10MG</td><td>0,5 &mu; g/&mu; L de OME/OMD/LOM</td></tr><tr><td>Betaína</td><td>Sigma</td><td>61962</td><td>0.5 &mu; g/&mu; L de OME/OMD/LOM</td></tr><tr><td>L-Cisteína</td><td>Sigma</td><td>168149-2.5G</td><td>0.5 &mu; g/&mu; L de OME / OMD / LOM</td></tr><tr><td>Ácido linoléico</td><td>Sigma</td><td>L1376-10MG</td><td>6.8 &mu; g/mL de OME/OMD/LOM</td></tr><tr><td>Taurina</td><td>Sigma</td><td>T0625-10MG</td><td>0,5 &mu; g/&mu; L de OME/OMD/LOM</td></tr><tr><td>Blocking buffer (para coloração de imunofluorescência)</td><td>&nbsp; </td><td>&nbsp; </forte></td><td><forte>Concentração final</forte></td></tr><tr><td>Soro de burro/cabra</td><td>Bio-Rad</td><td>C06SB</td><td>2%</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermo-Fisher</td><td>70011044</td><td>Composição até 100 mL</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Merck</td><td>P1379</td><td>0,1%</td></tr><tr><td><forte>Lista de anticorpos usados </forte></td><td><forte>&nbsp; </td><td>&nbsp; </td><td>&nbsp; </td></tr><tr><td>Alexa 568 cabra anti-coelho</td><td>Invitrogen</td><td>A-11011</td><td>Diluição-1:500; RRID: AB_143157</td></tr><tr><td>Crypt-a-Glo Comprehensive Kit- Anticorpo marcado com fluoresceína Crypto-Glo</td><td>Waterborne, Inc</td><td>A400FLK</td><td>Diluição- 1:200</td></tr><tr><td>Crypta-Grab IMS Beads- Grânulos magnéticos revestidos em anticorpo monoclonal reativo</td><td>Waterborne, Inc</td><td>IMS400-20</td><td>Diluição-1:500</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td>Diluição-1:1,000; RRID: AB_2629482</td></tr><tr><td>Faloidina-Alexa 674</td><td>Invitrogen</td><td>A22287</td><td>Diluição-1:1.000; RRID: AB_2620155</td></tr><tr><td>anticorpo anti-gp15 de coelho gerado por R. M. O' Connor (co-autor).</td><td>Mediante solicitação</td><td>Mediante solicitação</td><td>Diluição-1:500</td></tr><tr><td>Sporo-Glo</td><td>Waterborne, Inc</td><td>A600FLR-1X</td><td>Diluição- 1:200</td></tr></tbody></table>

estudando infecção por cryptosporidium em sistemas de cultura organóide humano derivado do tecido 3d por microinjeção

Studying Cryptosporidium Infection in 3D Tissue-derived Human Organoid Culture Systems by Microinjection

O parvum de Cryptosporidium é uma das causas principais da doença diarreicas humana. Para compreender a patologia do parasita e desenvolver drogas eficientes, um sistema in vitro da cultura que recapitula as circunstâncias no anfitrião é necessário. Organóides, que se assemelham estreitamente aos tecidos de sua origem, são ideais para estudar interações hospedeiro-parasita. Os organóides são estruturas derivadas de tecido tridimensionais (3D) derivadas de células-tronco adultas e crescem em cultura por longos períodos de tempo sem sofrer qualquer aberração genética ou transformação. Têm a polaridade bem definida com superfícies apical e basolateral. Organóides têm várias aplicações em testes de drogas, biobancário, e modelagem de doenças e estudos de interação hospedeiro-micróbio. Aqui nós apresentamos um protocolo passo a passo de como preparar os oocistos e os esporozoítos do Cryptosporidium para infectar organoids intestinais e da via aérea humana. Nós demonstramos então como a microinjeção pode ser usada para injetar os micróbios no lúmen organoid. Existem três métodos principais pelos quais os organóides podem ser usados para estudos de interação hospedeiro-micróbe — microinjeção, cisalhamento mecânico e chapeamento, e fazendo monolayers. Microinjection permite a manutenção da estrutura 3D e permite o controle preciso de volumes do parasita e de contato lateral apical direto para os micróbios. Nós fornecemos detalhes para o crescimento ideal dos organóides para a produção da imagem latente ou do ooocyst. Finalmente, nós igualmente demonstramos como os ooocysts recentemente gerados podem ser isolados do organoid para um processamento e uma análise a jusante mais adicionais.

Os protocolos aqui apresentados resultam na purificação eficiente de oocistos e esporozoítos (Figura 1a) prontos para a microinjeção. O protocolo do excistação conduz à liberação dos esporozoítos de aproximadamente 70 – 80% dos ooocysts, conseqüentemente é essencial filtrar para fora os ooocysts e os escudos restantes através de um filtro de 3 μm. A filtração resulta em quase 100% de purificação de esporozoíta (Figura 1b). Além disso, a adição de um corante verd...

Nós descrevemos protocolos para preparar ooocysts e purificar esporozoítos para estudar a infecção de organóides intestinais e da via aérea humanos pelo parvum de Cryptosporidium. Nós demonstramos os procedimentos para o microinjection dos parasita no lúmen organoid intestinal e na imunocoloração dos organoids. Finalmente, nós descrevemos o isolamento de ooocysts gerados dos organoids.

Estudando infecção por Cryptosporidium em sistemas de cultura Organóide humano derivado do tecido 3D por microinjeção

Cryptosporidium parvum is one of the major causes of human diarrheal disease. To understand the pathology of the parasite and develop efficient drugs, an ...

Usando este procedimento de purificação e microinjeção de sporozoita, essencialmente qualquer micróbio hospedeiro pode ser estudado em qualquer sistema de órgão derivado do tecido. Usando esta técnica, podemos controlar a quantidade de esporozoitas puros injetados no lúmen organoide ou no lado apical do organoide. Para purificar os esporozoites de C.parvum, transfira o oocisto para um tubo de 15 mililitros e resuspenque as células em uma única vez 10 a 7 vezes o oocito por concentração média de extivestação mililitro.Após 60 a 90 minutos a 37 graus Celsius, misture 14 mililitros de uma solução de lavagem apropriada com os oócitos, e sedimente as células por centrifugação. Aspire o supernatante cuidadosamente para evitar perder oocistos e resuspensar a pelota esozoica em um três vezes 10 para o sétimo oociista por um a dois mililitros de concentração de DMEM. Para remover quaisquer oocistos e conchas restantes, coloque um barril de seringa de 10 mililitros equipado com um aparelho de suporte de filtro de 47 mililitros equipado com um filtro de policarbonato de tamanho de três micrômetros em um tubo de 15 mililitros a quatro graus Celsius.Adicione 7,5 mililitros da suspensão do sporozoita ao conjunto do filtro. Quando todo o volume tiver passado pelo coador pela gravidade, lave todas as células restantes através do coador com outros 7,5 mililitros de DMEM. Quando toda a lavagem passar pelo filtro, colete a suspensão de sporozoita filtrada por centrifugação por 10 minutos e rotule a pelota em 50 a 100 microliters de um meio de cultura organoide apropriado, complementado com corante verde 0,05% rápido, e L-glutathione, betaine, L-cisteína, ácido linoleico e taurino contendo tampão redutor.Para microinjetar os parasitas no lado apical de um organoide 3D, primeiro use um puxador de micropipette para preparar capilares de injeção de vidro. Use fórceps para cortar a ponta do capilar para um diâmetro de nove a 12 micrômetros para permitir um fluxo fácil de esporozoites ou oocistos, se você optar por injetar oocistos diretamente, e usar dicas de micro-carregador para encher cada capilar com um corante verde rápido rotulado oocisto ou suspensão sporozoita. Em seguida, carregue o primeiro capilar preenchido com esporozoita em um microinjetor e use um microscópio invertido a uma ampliação de 5x e uma pressão constante para microinjetar 100 a 200 nanolitros da suspensão em cada organoide.O protocolo de excisão resulta na liberação de esporozoites de aproximadamente 70 a 80% dos oocistos. Portanto, é essencial filtrar as conchas oocistas restantes através de uma filtragem de três micrômetros. Remova quase 100% dos oocistos não excitados.Além disso, a adição de um corante verde ajuda a garantir a injeção de todos os organoides, e permite a visualização dos organoides injetados por pelo menos 24 horas após a injeção. Embora este seja um método bem praticado, a microscopia eletrônica de varredura pode ser usada para garantir que o processo de excisão não danifique os esporozoitas ou os oocistos. A injeção de quantidades iguais de oócitos no lúmen organoide pode ser confirmada visualmente por imagens microscópicas simples.Ensaios de imunofluorescência também podem ser usados para explorar os tipos de células que são infectadas pelo Cryptosporidium. Após os organoides diferenciados terem sido infectados por cinco dias, a presença de esporozoitas dentro dos oocistos pode ser confirmada secando uma porção dos oocistos em um slide adesivo, fixando os oócitos com metanol e combinando a coloração da DAPI com um anticorpo específico para oocistos adequados. Para obter resultados máximos, use oocistos frescos, use o mesmo capilar para todas as injeções e mude a mídia todos os dias após a injeção.Usando essa técnica, vários laboratórios estão começando a usar organoides para estudar interações hospedeira-micróbios. Estamos estudando commensais, bem como outros patógenos em configurações de microcultura organoide semelhante. Como o Cryptosporidium é um parasita humano, é importante realizar esses experimentos de acordo com as normas de segurança nível 2.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Neste vídeo, demonstramos um método in vitro para purificar esporozoítos de oocistos de paredes espessas do parasita patogênico Cryptosporidium parvum. Os esporozoítos isolados podem ser usados para estudos de infecção.

Isolamento in vitro de esporozoítos de oocistos de Cryptosporidium parvum

Este vídeo demonstra uma técnica de microinjeção para desenvolver um modelo de infecção organoide intestinal humana. O estágio de esporozoíto infeccioso do parasita Cryptosporidium parvum é microinjetado no lúmen organoide. Ao invadir as células epiteliais do organoide, ele sofre reprodução assexuada e sexuada para completar seu ciclo de vida e disseminar a infecção.

Uma técnica para desenvolver uma infecção parasitária em organoides intestinais por meio de microinjeção

Este protocolo explica cultura organóide Lgr5-positve primário eo desempenho subseqüente de transdução retroviral. Isto permite que a sobre-expressão de Cre-indutível ou knockdown do transgene entregue e permite estudos funcionais a serem realizadas no novo em organotípica vitro   sistema modelo.

Um Protocolo de vídeo de infecção retroviral na Primária Intestinal organóide Cultura

Neste protocolo de vídeo, damos uma explicação passo a passo da transdução lentiviral em organoides do epitélio intestinal primário e do processamento e análise a jusante dessas culturas por RT-PCR quantitativo, RNA-microarray e imuno-histoquímica.

Um Protocolo de Transdução Lentivirus e Análise de Downstream da Intestinal Organóides

As culturas derivadas de células-tronco abrigam um tremendo potencial para modelar doenças infecciosas. Aqui, a cultura de organoides gástricos de camundongos e humanos derivados de células-tronco adultas é descrita. Os organoides são microinjetados com o patógeno gástrico Helicobacter pylori.

Organóides como modelo para Doenças Infecciosas: Cultura dos Direitos Humanos e Organóides e estômago murino Microinjection do Helicobacter pylori

Este protocolo descreve a medição da permeabilidade da barreira epitelial em tempo real seguir tratamento farmacológico em organoids intestinal humana, usando microscopia fluorescente e vive microscopia de célula.

Medição em tempo real da permeabilidade da barreira epitelial no Organoids Intestinal humana

Os organóides intestinais derivados de células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem (hiPSC) oferecem oportunidades emocionantes para modelar doenças entéricas in vitro. Nós demonstramos a diferenciação de hiPSCs em organoids intestinais (iHOs), na estimulação destes iHOs com cytokines, e na microinjeção de Salmonella typhimurium no lúmen de Iho, permitindo o estudo de uma invasão epithelial por este Patógeno.

Usando organóides intestinais derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos para estudar e modificar a proteção de células epiteliais contra Salmonella e outros patógenos

Aqui apresentamos dois protocolos que permitem a modelagem de interações apical-específicas intestinais. Monocamadas intestinais derivadas de organoides e culturas de Interface Ar-Líquido (ALI) facilitam a geração de epitélio bem diferenciadas acessíveis tanto de lados luminosos quanto basolaterais, enquanto as organoides intestinais invertidas pela polaridade expõem seu lado apical e são favoráveis a ensaios de alto rendimento.

Métodos culturais para estudar interações específicas apical usando modelos organoides intestinais

O presente protocolo descreve o estabelecimento de um sistema organoide colônico murino para estudar a atividade e o funcionamento das células-tronco colônicas em um modelo knockout de claudina-7.

Cultura tridimensional de criptas colônicas murinas para estudar a função das células-tronco intestinais ex vivo

Descrevemos um protocolo para isolar criptas murinas do intestino delgado e cultura de organoides intestinais 3D das criptas. Adicionalmente, descrevemos um método para gerar organoides a partir de uma única célula-tronco intestinal na ausência de um nicho celular subepitelial.

A Cultura 3D de Organoides de Criptas Intestinais Murinas e uma Única Célula-Tronco para Pesquisa de Organoides

O estudo apresenta um método para investigação in vitro de infecção bacteriana utilizando organoides intestinais derivados de células-tronco teciduais. O protocolo descreve como cultivar e diferenciar organoides em duas dimensões, infectá-los com Escherichia coli invasiva aderente e avaliar leituras-chave, incluindo ruptura da barreira epitelial, imagem de infecção e resposta de RNA epitelial.

Uma cultura organoide bidimensional em extrato de invasina ou membrana basal para estudar as interações hospedeiro-bactéria

Aprenda a purificar esporozoítos de Cryptosporidium parvum e microinjetar em organoides intestinais humanos 3D. Este método permite estudar interações hospedeiro-patógeno com precisão e visualização por imunocoloração.

Estudando infecção por Cryptosporidium em sistemas de cultura Organóide humano derivado do tecido 3D por microinjeção

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