Name: Um ensaio para quantificar a ligação de RNA de proteína em bactérias (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: Aprenda a quantificar a afinidade de ligação de proteínas de ligação a RNA em células bacterianas vivas usando um ensaio de repórter. Este método permite estudar interações proteína-RNA em condições celulares naturais.

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Este projeto recebeu financiamento do programa I-CORE do Comitê de planejamento e orçamento e da Fundação de ciência de Israel (Grant no. 152/11), Marie Curie reintegration Grant no. PCIG11-GA-2012-321675, e do programa Horizonte 2020 de investigação e inovação da União Europeia, a Convenção de subvenção n. º 664918-MRG-gramática.

1. preparação do sistema
<ol><li>Projeto de plasmídeos do ligação-local
	<ol>
<li>Projete a gaveta do local de ligação como representado na Figura 1. Cada que contém as seguintes peças (5 ' a 3 '): Eagl local de restrição, ~ 40 bases do 5 ' fim do canamicina (Kan) gene de resistência, pLac-ara promotor, Ribossoma Binding site (RBS), Aug do gene mcherry, um espaçador (δ), um local de ligação RBP, 80 bases do 5 ' final do gene mCherry, e um local de restrição ApaLI. Nota: Para aumentar a taxa de sucesso do ensaio, projetar três gavetas de encadernação para cada local de ligação, com espaçadores consistindo de pelo menos um, dois e três bases. Consulte a seção resultados representativos para obter mais diretrizes.</li>
	</ol></li>
	<li>Clonagem de plasmídeos do local obrigatório
	<ol>
<li>Encomende as fitas do site de encadernação como minigenos de DNA de duas cordas (dsDNA). Cada que é ~ 500 BP longo e contem um local da limitação de Eagl e um local da limitação de apali nos 5 ' e 3 ' extremidades, respectivamente (veja a etapa 1.1.1). Nota: Neste experimento, minigenes com metade do gene da kanamicina foram ordenados para facilitar a triagem para colônias positivas. Entretanto, a montagem17 de Gibson é igualmente apropriada aqui, neste caso o local obrigatório pode ser requisitado como dois oligos single-stranded complementares mais curtos do ADN.</li>
		<li>Duplo-digerir ambos os mini-genes e o vetor alvo com Eagl-HF e apali pelo protocolo de restrição18, e coluna purificar19.</li>
		<li>Ligate os minigenes digeridos à espinha dorsal do emperramento-local que contem o descanso do gene do repórter de mcherry, do terminador, e de um gene20da resistência do canamicina.</li>
		<li>Transforme a solução de ligadura em células de Escherichia coli -21.</li>
		<li>Identifique os transformantes positivos através do sequenciamento de Sanger.<ol>
<li>Projetar uma cartilha 100 bases upstream para a região de interesse (ver tabela 1 para sequências de primer).</li>
			<li>Miniprep algumas colônias bacterianas22.</li>
			<li>Prepare 5 μL de uma solução de 5 mM da primeira demão e 10 μL de ADN a 80 ng/μL de concentração.</li>
			<li>Envie as duas soluções para uma instalação conveniente para o sequenciamento de Sanger23.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Armazene plasmíos purificados a-20 ° c e cepas bacterianas como estoques de glicerol24, ambos no formato 96-well. O DNA será então usado para a transformação em células de E. coli ------------------------(ver passo 1.3.5)</li>
	</ol></li>
	<li>Concepção e construção do plasmídeo RBP Nota: As sequências de aminoácido e nucleotídeo das proteínas do revestimento utilizadas neste estudo estão listadas na tabela 2.<ol>
<li>Encomende a sequência de RBP necessária sem um Codon de parada como um minigeno dsDNA ordenado encomenda, faltando um Codon de parada com locais de restrição nas extremidades (Figura 1).</li>
		<li>Clonar o RBP testado faltando um Codon de parada imediatamente a jusante de um promotor induzível e a montante de uma proteína fluorescente que falta um Codon do começo (Figura 1), similar às etapas 1.2.2-1.2.4. Certifique-se de que o plasmídeo RBP contenha um gene diferente da resistência antibiótica do que o plasmídeo do ligação-local.</li>
		<li>Identifique os transformantes positivos através do sequenciamento de Sanger, semelhante ao passo 1.2.5 (ver tabela 1 para sequências de primer).</li>
		<li>Escolha um transformante positivo e torne-o quimicamente-competente25. Armazene como plasmídos purificados de glicerol a-20 ° c e estoques de glicerol de cepas bacterianas24 at-80 ° c em placas 96-well.</li>
		<li>Transforme os plasmídeo do local de ligação (da etapa 1.2.6) armazenados em placas 96-well em pilhas bacterianas quimicamente-competentes que contêm já um plasmídeo RBP-mcerulean21. Para economizar tempo, em vez de galvanizar as células em placas de Petri, placa-los usando um pipetador de 8 canais em 8-pistas de pista contendo Luria-Bertani (LB)26 Agar com antibióticos relevantes (Kan e amp). As colônias devem aparecer em 16 h.</li>
		<li>Selecione uma única colônia para cada transformante duplo e cresça durante a noite no meio LB com os antibióticos relevantes (Kan e amp) e armazene como estoques de glicerol24 at-80 ° c em placas 96-well.</li>
	</ol></li>
</ol>2. configuração do experimento
Nota: O protocolo aqui apresentado foi realizado por meio de um sistema robótico de manuseio de líquidos em combinação com uma incubadora e um leitor de placas. Cada medida foi realizada para 24 concentrações de indutor, com duas duplicatas para cada combinação de estirpe + indutor. Utilizando este sistema robótico, foram coletados dados para 16 cepas por dia com 24 concentrações de indutor. No entanto, se tal dispositivo não estiver disponível, ou se forem necessários menos experimentos, estes podem ser facilmente feitos manualmente usando uma multipipeta de 8 canais e adaptando o protocolo de acordo. Por exemplo, resultados preliminares para quatro cepas por dia com 12 concentrações de indutor e quatro tempos-pontos foram adquiridos dessa maneira.
<ol><li>Prepare, com antecedência, 1 L de tampão de bioensaio (BA) misturando 0,5 g de triptona, 0,3 mL de glicerol, 5,8 g de NaCl, 50 mL de 1 M MgSO4, 1 ml de tampão fisiológico de fosfato (PBS) de 10x tamponado e 7,4 ml de água destilada dupla (DDW). Autoclave ou filtro estéril o tampão BA.</li>
	<li>Cresça as estirpes do duplo-Transformant em 37 ° c e 250 rpm que agitam em 1,5 mL LB com os antibióticos apropriados (kanamycin em uma concentração final de 25 μg/mL e Ampicillin em uma concentração final de 100 μg/mL), em placas de 48-well, durante um período de 18 h (durante a noite).</li>
	<li>
De manhã, faça os seguintes preparativos.
	<ol>
<li>Placa do indutor. Em uma placa limpa 96-well, prepare poços com meio semipobre (SPM) que consiste em 95% BA e em 5% LB26 na incubadora em 37 ° c. O número de poços corresponde ao número desejado de concentrações de indutor. Adicione C4-HSL aos poços na placa do indutor que conterá a concentração a mais elevada do indutor (218 nanômetro).</li>
		<li>Programe o robô para diluir serialmente o meio de cada um dos poços de maior concentração em 23 concentrações inferiores variando de 0 a 218 nM. O volume de cada diluição do indutor deve ser suficiente para todas as estirpes (incluindo duplicatas).</li>
		<li>Enquanto as diluições do indutor estão sendo preparadas, aqueça 180 μL de SPM na incubadora em 37 ° c, em placas de 96 poços.</li>
		<li>Diluir as cepas da noite da etapa 2,2 por um fator de 100 por diluições seriais: primeiro diluir por um fator de 10, misturando 100 μL de bactérias com 900 μL de SPM em placas de 48 poços, e depois diluir novamente por um fator de 10, tomando 20 μL da solução diluída em 180 μL de SPM pré-aquecido, em placas de 96 poços adequadas para medições fluorescentes.</li>
		<li>Adicione o indutor diluído da placa do indutor às placas 96-well com as tensões diluídas de acordo com as concentrações finais.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Agite as placas 96-well em 37 ° c por 6 h, ao tomar medidas da densidade ótica em 595 nanômetro (OD595), em mcherry (560 nm/612 nanômetro) e em fluorescência de mCerulean (460 nm/510 nanômetro) através de um leitor da placa cada 30 minutos. Para fins de normalização, medir o crescimento de SMP sem células adicionadas.</li>
</ol>3. análise preliminar dos resultados
<ol><li>Para cada dia de experimento, escolha um intervalo de tempo de crescimento logarítmico de acordo com as curvas de crescimento medido, entre a fase de crescimento linear e a estacionária (T0, tfinal). Tome aproximadamente 6 − 8 pontos de tempo, ao descartar a primeira e a última medida para evitar o erro derivado da inexatidão da deteção exponencial do crescimento (veja Figura 2a, painel superior). Nota: Descarte as cepas que mostram curvas de crescimento anormais ou cepas em que a fase de crescimento logarítmico não pôde ser detectada e repetia o experimento.</li>
	<li>
Calcule a fluorescência normalizada média de mCerulean e a taxa de produção de mCherry, a partir dos dados brutos de fluorescência mCerulean e mCherry para cada concentração de indutor (Figura 2a).
	<ol>
<li>Calcule mCerulean normalizado como segue: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59611/59611eq1.jpg"> onde em branco (mCerulean) é o nível de mCerulean [u.a.] para o meio somente, o espaço em branco (OD) é a densidade ótica para o meio somente, e o mCerulean e o OD são os valores da fluorescência e da densidade ótica de mCerulean, respectivamente.</li>
		<li>MCerulean médio sobre os pontos diferentes do tempo (Figura 2b, os dois painéis superiores) como segue: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/59611/59611eq2.jpg"> onde #Time pontos é o número de temporais dados tidos em conta, t0 é o tempo em que começa a fase de crescimento exponencial, e tfinal é o tempo em que termina a fase de crescimento exponencial.</li>
		<li>Calcule a taxa de produção de mCherry (Figura 2b, dois painéis inferiores) da seguinte forma: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/59611/59611eq3.jpg"> onde mCherry (t) é o nível de mCherry [u.a.] no tempo t, OD é o valor de densidade óptica, T0 é o tempo em que a fase de crescimento exponencial começa, e tfinal é o tempo em que a fase de crescimento exponencial termina.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Por fim, traçar a taxa de produção de mCherry em função de mCerulean, criando curvas de resposta de dose em função da fluorescência de fusão RBP-mCerulean (Figura 2C). Tais parcelas representam a produção do gene repórter em função da presença de RBP na célula.</li>
</ol>4. função de resposta da dose rotina de encaixe e extração de KRBP
<ol><li>a suposição que a taxa Ribossoma de tradução com o limite de RBP é constante, modela a taxa de produção de mcherry como segue (veja Figura 2D, linha verde): <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/59611/59611eq4.jpg"> onde [x] é a fluorescência mCerulean média normalizada calculada de acordo com EQ. 2, taxa de produção de mCherry é o valor calculado de acordo com EQ. 3, KRBP é a afinidade de ligação relativa [u.a.], knão acoplado é a taxa Ribossome de Tradução com a RBP não acoplada, n é o fator de cooperatividade, e C é a fluorescência de base [u.a.]. C, n, Knão acoplado, e kRBP são encontrados ajustando os dados da taxa de produção de mcherry ao modelo (EQ. 4).</li>
	<li>Usando o software da análise de dados, conduza um procedimento apropriado nos lotes que descrevem a taxa de produção de mCherry em função da média mCerulean (etapa 3,3), e extraia os parâmetros do ajuste de acordo com a fórmula em EQ. 4. Nota: Somente os resultados de encaixe com R2 &gt; 0,6 são tomados em consideração. Para esses ajustes, o erro de KRBP é principalmente na faixa de 0,5% a 20% dos valores de kRBP , para um intervalo de confiança de 0,67, enquanto aqueles com maior erro de kRBP também podem ser verificados por olho.</li>
	<li>Normalize os valores de KRBP pelo respectivo valor máximo de mCerulean média para cada função dose-resposta. <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/59611/59611eq5.jpg"> onde KRBP em [u.a.] é o valor extraído do procedimento de encaixe em EQ. 4, e Max (mcerulean média) é o sinal mcerulean de média máxima [a. u] observado para a tensão atual. Nota: A normalização facilita a comparação correta do efeito regulatório entre as cepas, eliminando a dependência dos níveis máximos de expressão de RBP específicos.</li>
</ol>

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<li>Bendak, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+for+assessing+the+RNA-binding+potential+of+a+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A rapid method for assessing the RNA-binding potential of a protein.</a> Nucleic Acids Research. 40 (14), e105(2012).</li>
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<li>Lee, F. C. Y., Ule, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+CLIP+Technologies+for+Studies+of+Protein-RNA+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Advances in CLIP Technologies for Studies of Protein-RNA Interactions.</a> Molecular Cell. 69 (3), 354-369 (2018).</li>
<li>Katz, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+Vivo+Binding+Assay+for+RNA-Binding+Proteins+Based+on+Repression+of+a+Reporter+Gene%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">An in Vivo Binding Assay for RNA-Binding Proteins Based on Repression of a Reporter Gene.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (12), 2765-2774 (2018).</li>
<li>Watters, K. E., Yu, A. M., Strobel, E. J., Settle, A. H., Lucks, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+RNA+structures+in+vitro+and+in+vivo+with+selective+2%E2%80%99-hydroxyl+acylation+analyzed+by+primer+extension+sequencing+%28SHAPE-Seq%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Characterizing RNA structures in vitro and in vivo with selective 2’-hydroxyl acylation analyzed by primer extension sequencing (SHAPE-Seq).</a> Methods. 103, 34-48 (2016).</li>
<li>Saito, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+translational+regulation+by+an+L7Ae-kink-turn+RNP+switch%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Synthetic translational regulation by an L7Ae-kink-turn RNP switch.</a> Nature Chemical Biology. 6 (1), 71-78 (2010).</li>
<li>Gott, J. M., Wilhelm, L. J., Uhlenbeck, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+binding+properties+of+the+coat+protein+from+bacteriophage+GA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">RNA binding properties of the coat protein from bacteriophage GA.</a> Nucleic Acids Research. 19 (23), 6499-6503 (1991).</li>
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<li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+genome-wide+profiling+of+RNA+secondary+structure+reveals+novel+regulatory+features%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo genome-wide profiling of RNA secondary structure reveals novel regulatory features.</a> Nature. 505, (2013).</li>
<li>Rouskin, S., Zubradt, M., Washietl, S., Kellis, M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+probing+of+RNA+structure+reveals+active+unfolding+of+mRNA+structures+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome-wide probing of RNA structure reveals active unfolding of mRNA structures in vivo.</a> Nature. 505 (7485), 701-705 (2014).</li>
<li>Lucks, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+RNA+structure+characterization+with+selective+2%E2%80%99-hydroxyl+acylation+analyzed+by+primer+extension+sequencing+%28SHAPE-Seq%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Multiplexed RNA structure characterization with selective 2’-hydroxyl acylation analyzed by primer extension sequencing (SHAPE-Seq).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (27), 11063-11068 (2011).</li>
<li>Spitale, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+imprints+in+vivo+decode+RNA+regulatory+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural imprints in vivo decode RNA regulatory mechanisms.</a> Nature. 519 (7544), 486(2015).</li>
<li>Watters, K. E., Abbott, T. R., Lucks, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+characterization+of+cellular+RNA+structure+and+function+with+in-cell+SHAPE-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Simultaneous characterization of cellular RNA structure and function with in-cell SHAPE-Seq.</a> Nucleic Acids Research. 44 (2), e12(2016).</li>
<li>Flynn, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+interrogation+of+RNA+secondary+structure+in+living+cells+with+icSHAPE%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide interrogation of RNA secondary structure in living cells with icSHAPE.</a> Nature Protocols. 11 (2), 273-290 (2016).</li>
<li>Bernardi, A., Spahr, P. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+Sequence+at+the+Binding+Site+for+Coat+Protein+on+RNA+of+Bacteriophage+R17%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Nucleotide Sequence at the Binding Site for Coat Protein on RNA of Bacteriophage R17.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 69 (10), 3033-3037 (1972).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O método descrito neste artigo facilita a medida in vivo quantitativa da afinidade obrigatória da RBP-RNA em pilhas de E. coli . O protocolo é relativamente fácil e pode ser conduzido sem o uso de maquinaria sofisticada, e a análise de dados é direta. Além disso, os resultados são produzidos imediatamente, sem o tempo de espera relativamente longo associado com os resultados de sequenciamento da próxima geração (NGS).
Uma limitação a este método é que trabalha somente em pilhas bacter...

A regulação pós-transcricional de proteína de ligação de RNA (RBP), especificamente a caracterização da interação entre RBPs e RNA, tem sido extensivamente estudada nas últimas décadas. Existem vários exemplos de baixo-regulação translacional em bactérias originárias da inibição do rbps, ou diretamente competindo com, ligação Ribossome1,2,3. No campo da biologia sintética, as interações RBP-RNA estão surgindo como uma ferramenta significativa para o desenho de circuitos genéticos baseados em transcrição4,5. Portanto, há um aumento na demanda para caracterização dessas interações RBP-RNA em um contexto celular.
Os métodos mais comuns para o estudo das interações proteína-RNA são o ensaio eletroforético de deslocamento de mobilidade (EMSA)6, que é limitado a configurações in vitro, e vários ensaios pull-down7, incluindo o método de clipe8,9 . Quando tais métodos permiterem a descoberta de locais de ligação do RNA de de novo, sofrem dos inconvenientes tais como protocolos labor-intensivos e de reações de seqüenciamento profundas caras e podem exigir um anticorpo específico para a tração-para baixo de RBP. Devido à natureza suscetível do RNA ao seu ambiente, muitos fatores podem afetar as interações RBP-RNA, enfatizando a importância de interrogar a ligação RBP-RNA no contexto celular. Por exemplo, nós e outros temos demonstrado diferenças significativas entre as estruturas de RNA in vivo e in vitro10,11.
Baseado na aproximação de um estudo precedente12, Nós demonstramos recentemente10 que ao coloc locais obrigatórios pre-projetados para o capsídeo rbps dos bacteriófagos GA13, MS214, PP715, e qβ16 no região de iniciação de tradução de um repórter mRNA, a expressão do repórter é fortemente reprimido. Nós apresentamos um método relativamente simples e quantitativo, baseado neste fenômeno da repressão, para medir a afinidade entre RBPs e seu local de ligação RNA correspondentes in vivo.

<table><tbody><tr><td>Sal de ampicilina sódica</td><td>SIGMA</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de magnésio (MgSO4)</td><td>ALFA AESAR</td><td>33337</td><td></td></tr><tr><td>48 placas</td><td>Axygen</td><td>P-5ML-48-C-S</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 8 pistas</td><td>Axygen</td><td>RESMW8I</td><td></td></tr><tr><td>placas de 96 poços</td><td>Axygen</td><td>P-DW-20-C</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 96 poços para leitor de placas</td><td>Perkin Elmer</td><td>6005029</td><td></td></tr><tr><td>ApaLI</td><td>NEB</td><td>R0507</td><td></td></tr><tr><td>Sequências do local de ligação</td><td>Gen9 Inc. e Twist Bioscience</td><td></td><td>ver Tabela 1</td></tr><tr><td>E. coli Células TOP10</td><td>Invitrogen</td><td>C404006</td><td></td></tr><tr><td>Eagl-HF</td><td>NEB</td><td>R3505</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>BIO LAB</td><td>071205</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>Incubadora</td><td></td> <td>de tecan</td> liconic</tr><tr><td>Kanamycin solfate</td><td>SIGMA</td><td>K4000</td><td></td></tr><tr><td>KpnI- HF</td><td>NEB</td><td>R0142</td><td></td></tr><tr><td>Ligase</td><td>NEB</td><td>B0202S</td><td></td></tr><tr><td>Sistema robótico de manipulação de líquidos</td><td>TECAN</td><td>EVO 100, MCA Software de análise Matlab de 96 canais</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multi-pipeta 8 pistas</td><td>Axygen</td><td>BR703710</td><td></td></tr><tr><td>N-butanoil-L-homoserina lactona (C4-HSL)</td><td>cayman</td><td>K40982552 019</td><td></td></tr><tr><td>Tampão PBS</td><td>Biological Industries</td><td>020235A</td><td></td></tr><tr><td>Platereader</td><td>TECAN</td><td>Infinite F200 PRO</td><td></td></tr><tr><td>Q5 HotStart Polimerase</td><td>NEB</td><td>M0493</td><td></td></tr><tr><td>RBP seqeunces</td><td>Addgene</td><td>27121 e 40650</td><td>ver Tabela 2</td></tr><tr><td>Cloreto de Sódio (NaCL)</td><td>BIO LAB</td><td>190305</td><td></td></tr><tr><td>SV Gel e Sistema de Limpeza de PCR</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td></td></tr><tr><td>Triptona</td><td>BD</td><td>211705</td><td></td></tr></tbody></table>

um ensaio para quantificar a ligação de rna de proteína em bactérias

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

No passo de iniciação da tradução da proteína, o Ribossome liga-se à região de iniciação do mRNA. A iniciação da tradução pode ser obstruída pela ligação de uma proteína obrigatória do RNA (RBP) à região de iniciação do mRNA, que interfere com o emperramento ribossoma. No método apresentado, utilizamos este fenômeno de bloqueio para quantificar a afinidade vinculativa de RBPs aos seus locais de ligação cognato e não cognato. Para fazer isso, inserimos um site de vinculação de teste na região de iniciação de um mRNA de repórter e induzem a expressão do teste RBP. No caso da Associação RBP-RNA, observou-se uma repressão sigmoidal da expressão repórter em função da concentração de RBP. No caso de não afinidade ou de afinidade muito baixa entre o local de ligação e a RBP, não foi observada nenhuma repressão significativa. O método é realizado em células bacterianas ao vivo, e não requer maquinaria dispendiosa ou sofisticada. É útil para quantificar e comparar entre as afinidades de ligação de RBPs diferentes que são funcionais nas bactérias a um jogo de locais de ligação projetados. Este método pode ser inadequado para sites de ligação com alta complexidade estrutural. Isto é devido à possibilidade da repressão da iniciação ribosomal pela estrutura complexa do mRNA na ausência de RBP, que conduziria à expressão de gene mais baixa do repórter basal, e assim à repressão menos-Observable do repórter em cima da ligação de RBP.

O método apresentado utiliza a competição entre uma RBP e o Ribossome para ligação à molécula de mRNA (Figura 1). Esta competição é refletida pela diminuição dos níveis de mCherry em função do aumento da produção de RBP-mCerulean, devido ao aumento das concentrações de indutor. No caso de aumento da fluorescência de mCerulean, sem alterações significativas em mCherry, a falta de ligação à RBP é deduzada. Os resultados representativos para uma cepa positiva e ...

Neste método, nós quantificamos a afinidade obrigatória de proteínas de ligação do RNA (rbps) aos locais de ligação cognato e non-cognato usando um simples, vivo, ensaio do repórter em pilhas bacterianas. O ensaio é baseado na repressão de um gene repórter.

Um ensaio para quantificar a ligação de RNA de proteína em bactérias

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...

A caracterização da ligação proteica ao RNA in vivo continua sendo um grande desafio devido à natureza complexa do RNA e aos muitos fatores que afetam sua interação com proteínas. A proteína de ligação RNA ou afinidade RBP-RNA é medida dentro de células bacterianas vivas. Uma vez que o ambiente celular afeta tanto a estrutura do RNA quanto a consequente ligação RBP-RNA, medir a afinidade in vivo é crucial para entender tais interações em sistemas naturais.O segredo do sucesso está no projeto dos plasmídeos. O design deve usar várias ondas de delta e evitar a inserção de códons stop e mutações de mudança de quadro. Inicie este protocolo projetando o do site de ligação.Cada mini gene contém um local de restrição de EagI, 40 bases da extremidade cinco prime do gene de resistência à kanamicina, o promotor pLac/Ara, o site de ligação ribossosome, AUG do gene mCherry, um espaçador, um site de ligação RBP, 80 bases da extremidade principal do gene mCherry, e um local de restrição ApaLI. Para aumentar a taxa de sucesso do ensaio, projete três de site de ligação para cada local de ligação com espaçadores compostos por pelo menos uma, duas e três bases. Digerir duas vezes os mini genes e o vetor alvo com EagI HF e ApaLI antes de realizar a purificação da coluna dos digestores.Ligate os mini genes digeridos à espinha dorsal do local de ligação contendo o resto do gene repórter mCherry, exterminador e um gene de resistência à kanamicina. Em seguida, transforme a solução de ligadura em Escherichia coli top 10 células. Depois de identificar transformadores positivos via sequenciamento Sanger, armazene plasmídeos purificados no formato 96 bem a menos 20 graus Celsius.Também armazene as cepas bacterianas como estoques de glicerol no formato 96 bem a menos 80 graus Celsius. Peça personalizada a sequência RBP necessária sem um códon de parada como um mini gene de DNA de dupla mente com locais de restrição nas extremidades. Transforme os plasmídeos preparados em células bacterianas quimicamente competentes que já contêm um plasmídeo RBP mCerulean.Para economizar tempo, aplaque as células usando uma pipetter de oito canais em oito placas de pista contendo ágar Luria-Bertani com antibióticos relevantes. Colônias devem aparecer em 16 horas a 37 graus Celsius. Selecione uma única colônia para cada duplo transformador e transfira para 48 placas de poço contendo 1,5 mililitros de LB com antibióticos apropriados.Cresça as células durante um período de 18 horas a 37 graus Celsius tremendo a 250 RPM. Armazene as pernoites como estoques de glicerol a menos 80 graus Celsius em 96 placas de poço. Pela manhã, programe o robô para aquecer 180 microliters de semi-poros médio ou SPM em 96 placas de poço.Programe o robô para preparar a placa indutora. Em uma placa limpa de 96 poços, prepare poços com SPM composto por 95%BA e 5%LB. O número de poços corresponde ao número desejado de concentrações indutoras.Adicione C4-HSL aos poços na placa indutora que conterá a maior concentração de indutores. Em seguida, programe o robô para diluir em série o meio de cada um dos poços de maior concentração em 23 concentrações mais baixas que variam de zero a 218 nanomolar. O volume de cada diluição indutora deve ser suficiente para todas as cepas.Para diluir as cepas durante a noite, programe o robô para diluir por um fator de 10 misturando 20 microliters de bactérias com 180 microliters de SPM em 48 placas de poço. Em seguida, diluir novamente por um fator de 10, tomando 20 microliters da solução diluída para a placa de tensão pré-preparada adequada para medição fluorescente. Agora programe o robô para adicionar o indutor diluído da placa indutora às 96 placas de poço com as cepas diluídas de acordo com as concentrações finais.Agite as 96 placas a 37 graus Celsius por seis horas. Durante esse tempo, faça medições da densidade óptica ou OD a 595 nanômetros, bem como mCherry e fluorescência mCerulean através de um leitor de placas a cada 30 minutos. Para fins de normalização, meça o crescimento da SPM sem células adicionadas.Aqui são tramas tridimensionais para uma tensão positiva. As tramas retratam níveis de OD brutos, fluorescência mCerulean e fluorescência mCherry em função do tempo e concentração de indutor. os níveis de expressão de estado estável mCerulean foram computados para cada concentração de indutor para as cepas positivas e negativas.A taxa de produção mCherry também foi calculada para cada concentração de indutor para cepas positivas e negativas. A taxa de produção de mCherry foi plotada em função da fluorescência média mCerulean média acima de duas duplicatas biológicas para duas cepas. O ajuste KRBP usando a fórmula de montagem é mostrado para a cepa positiva que exibe uma resposta de ligação específica.Para a cepa negativa, nenhum valor KRBP foi extraído. Foram determinadas curvas de resposta de dose normalizadas para 30 cepas diferentes com base em dois RBPs como 10 locais de ligação em locais diferentes. São observados três tipos de respostas, alta afinidade, baixa afinidade e nenhuma afinidade.Aqui são mostrados resultados quantitativos krbp para dois RBPs, proteína de casaco MS2 e proteína de casaco PP7 com 10 diferentes do local de ligação. Curvas de resposta de dose para proteína de casaco MS2 com um local de ligação mutante em quatro locais diferentes são mostradas aqui para demonstrar o efeito do espaçamento mutante na produção mCherry. A sequência do local de ligação mutante testado é mostrada.É importante usar uma técnica estrutural como a forma buscar sondar quimicamente a estrutura do complexo proteína-RNA e visualizar quais regiões de mRNA são afetadas pela ligação RNA. Recentemente, usamos essa técnica de forma de alto rendimento para medir simultaneamente a afinidade dos RBPs a 10.000 locais de vinculação.

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Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Este vídeo demonstra a ação capilar radial diferencial do ensaio de ligante - uma técnica para triagem sistemática de alto rendimento de proteínas de ligação ao segundo mensageiro de nucleotídeos intracelulares. Essa técnica permite a ligação direta dos mensageiros à proteína-alvo superexpressa no lisado celular - ignorando a necessidade de purificação de proteínas.

Ação Capilar Radial Diferencial do Ensaio de Ligante: Uma Técnica de Alto Rendimento para Identificar Proteínas Intracelulares de Ligação ao Segundo Mensageiro de Nucleotídeos Bacterianos

Este vídeo demonstra um ensaio in vivo em bactérias para estudar a interação de proteínas de ligação a RNA (RBPs) com RNA. As células bacterianas são transformadas com duas construções de plasmídeo - um plasmídeo de sítio de ligação que codifica um mRNA contendo um gene repórter fluorescente a jusante de um sítio de ligação de RBP - enquanto um plasmídeo RBP expressa as proteínas RBP sob o controle de um indutor. Após o aumento mediado por indutor na produção de RBP, os RBPs se ligam ao mRNA,...

Ensaio de repressão gênica repórter para estudar a regulação translacional de um gene alvo

Este vídeo demonstra um ensaio de extração de RNA in vitro para identificar proteínas de ligação a RNA (RBPs), que interagem com as sequências de elementos ricos em adenilato-uridilato (ARE) no mRNA. Os RBPs alvo de um lisado celular são misturados com uma sonda de RNA para formar complexos de RNA-proteína. Os complexos são isolados por purificação de afinidade utilizando a afinidade do marcador de destiobietina da sonda de RNA a um grânulo magnético marcado com estreptavidina.

Ensaio pull-down de proteína de RNA para isolar proteínas de ligação a RNA por meio de extração de afinidade

Neste vídeo, descrevemos a evolução sistemática de ligantes pelo método de enriquecimento exponencial (SELEX) para identificar sequências específicas de ligação a RNA para uma proteína-alvo de interesse. A proteína é incubada com um grande conjunto de sequências de RNA aleatórias, e as sequências de RNA de ligação à proteína são isoladas, amplificadas por PCR e sequenciadas para identificar seus locais de ligação à proteína.

Ensaio de ligação in vitro baseado em SELEX para identificar interações RNA-proteína

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Rápidas de teste colorimétrico para Qualitativamente Distinguir RNA e DNA em amostras biomoleculares

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Identificação das Proteínas De Ligação de Pequenos Ligantes com a Ação Capilar Radial Diferencial do Ensaio de Ligand (DRaCALA)

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Uma Análise Pull-Down Quantitativa Otimizada de Proteínas Ligadoras de RNA Usando RNA Biotinilado Curto

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Um ensaio para quantificar a ligação de RNA de proteína em bactérias

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