Name: Preparação de medula óssea inteira para análise de citometria de massa de células de linhagem de neutrófilos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-19T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Aprenda a preparar medula óssea inteira para citometria de massa de células de linhagem de neutrófilos. Este protocolo preserva a integridade de células mieloides de curta duração, permitindo a análise de populações raras.

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Gostaríamos de agradecer ao núcleo de citometria de fluxo LJI para assistência com procedimento de citometria de massas. Este trabalho foi apoiado por NIH Grants R01HL134236, P01HL136275, e R01CA202987 (all to C. C. H) e ADA7-12-MN-31 (04) (para C.C.H. e Y. P. Z).

Todos os experimentos seguiram as diretrizes aprovadas do Instituto La Jolla para o Comitê de cuidados e uso de animais de alergia e Imunologia, e a aprovação para o uso de roedores foi obtida do Instituto La Jolla para alergia e Imunologia, de acordo com critérios descritos em o guia para o cuidado e uso de animais de laboratório dos institutos nacionais de saúde.
1. colheita da medula óssea do rato (BM)
<ol><li>Compre camundongos C57BL/6J de um vendedor comercial. Alimente a dieta e a casa padrão do Chow do roedor em gaiolas do microisolador em uma facilidade patogénico-livre.</li>
	<li>Use camundongos machos, 6-10 semanas de idade, para fins experimentais. Eutanizar por inalação de CO2 seguida pela luxação cervical.</li>
	<li>Coloque o mouse sobre uma almofada cirúrgica estéril com o lado do abdômen para cima. Esterilizar a pele da área do abdômen e dos membros posteriores pulverizando 70% de etanol. Use um par de dissecando tesouras cirúrgicas para cortar a cavidade abdominal aberta.</li>
	<li>Retire a pele para expor os membros posteriores. Use um par de fórceps curativo de ponta sem corte para segurar a tíbia do mouse logo abaixo do tornozelo. Use um outro par de fórceps curvado do curativo para estabilizar a tíbia abaixo do fórceps de limpeza da ponta sem corte. Quebre a tíbia e exponha o osso arrancando o músculo com o fórceps curativo de ponta sem corte. Nota: A tíbia é frouxamente unida à articulação do joelho e pode facilmente ser escolhida usando o fórceps do curativo da Blunt-ponta.</li>
	<li>Coloque a tíbia no frio 1X PBS.</li>
	<li>Em seguida, mova a pinça de curativo curva estabilizadora para baixo para o fêmur. Deslize o fórceps de limpeza de ponta sem corte abaixo da articulação do joelho e segure a rótula. Deslocar a rótula puxando-a suavemente para cima. Expor o fêmur, arrancando o músculo anexado à rótula. Segure o fêmur exposto pelo curativo curvo fórceps e corte o fêmur fora da parte inferior do osso usando dissecando tesoura cirúrgica.</li>
	<li>Coloc o fémur no frio 1X PBS.</li>
	<li>Perfure um furo no tubo do microcentrifugador de 0,5 mL com uma agulha de 18 G.</li>
	<li>Coloc a tíbia e o fémur no mesmo tubo do microcentrifugador de 0,5 mL com a extremidade aberta dos ossos que enfrentam para baixo ao furo.</li>
	<li>Coloque o tubo de 0,5 mL contendo tanto a tíbia como o fêmur em um tubo de microcentrífuga de 1,7 mL.</li>
	<li>Gire os tubos de duas camadas contendo tíbia e fêmur a 5.510 x g por 30 s na microcentrífuga.</li>
	<li>Certifique-se de que o BM é extraído dos ossos e peletizada na parte inferior do tubo. Atire o tubo de 0,5 mL contendo os ossos santificado. O mouse BM está pronto para os próximos passos. Nota: a BM humana é colhida em recursos clínicos como descrito anteriormente11.</li>
</ol>2. mancha células BM para CyTOF
<ol><li>Ressuscitem o BM em 1 mL de tampão de lise de glóbulos vermelhos (RBC) 1x. Para a BM humana, Ressuspender todo o BM em um volume de 10x de 1x glóbulos vermelhos (RBC) tampão de Lise. Incubar durante 10 min à temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Gire o tubo a 350 x g por 5 min a 4 ° c. Para BM humano, repita a etapa 2,1 e 2,2 antes de prosseguir para a etapa 2,3.</li>
	<li>Aspirar cuidadosamente o sobrenadante e deixar a pelota sem interrupções. Ressuscita a pelota com 1 mL de PBS 1x frio. Filtre o pellet em um tubo cônico de 15 mL através de um filtro de células de 70 μm. As pilhas do BM são isoladas agora completamente no tubo dos restos do músculo e do osso. Lave as células adicionando 9 mL de PBS 1x frio no tubo.</li>
	<li>Gire o tubo de 15 mL em 350 x g para 5min a 4 ° c.</li>
	<li>Aspirar cuidadosamente o sobrenadante e ressuscita as células BM com 10 mL de PBS frio. Tome uma alíquota de células para a contagem. Contagem de células usando um Hemocytometer.</li>
	<li>Alíquota 5 x 106 células BM em um novo tubo de 15 ml para coloração de cytof.</li>
	<li>Girar a alíquota do tubo de 15 mL a 350 x g durante 5 min a 4 ° c.</li>
	<li>Aspirar cuidadosamente o sobrenadante e suspender as células BM com 125 nM de cisplatina em 1 mL de CyTOF mancha tampão como um indicador de viabilidade para a amostra. Incubar por 5 min em RT.</li>
	<li>Após a incubação, adicione 4 mL de tampão de coloração CyTOF ao tubo. Gire o tubo a 350 x g por 5 min a 4 ° c. Para o BM humano, adicione o soro humano do AB de 10% no tampão de mancha do CyTOF.</li>
	<li>Aspirar cuidadosamente o sobrenadante e suspender as células BM com 50 μL de solução de bloqueio do receptor FC. Incubar por 10 min a 4 ° c. Pule este passo para o BM humano.</li>
	<li>Adicionar 50 μL do cocktail de anticorpo CyTOF caseiro5 à amostra para que o volume total de coloração seja de 100 μl. Gentilmente pipeta para misturar. Incubar durante 30 min a 4 ° c. O volume final do cocktail do anticorpo é 100 μL para o rato BM e amostras humanas do BM.</li>
	<li>Adicione 2 mL de tampão de coloração de CyTOF a cada tubo que segue a incubação para lavar as pilhas, gire o tubo em 350 x g por 5 minutos em 4 ° c.</li>
	<li>Repita o passo 2,12 para um total de duas laves.</li>
	<li>Prepare uma solução fresca de formaldeído a 1,6% da ampola de 16%. Diluir 1 parte do formaldeído de ações com 9 partes de 1X PBS.</li>
	<li>Aspirar cuidadosamente o sobrenadante e suspender a pelota com 1 mL de solução fresca de 1,6% de FA. Incubar por 15 min em RT.</li>
	<li>Gire o tubo a 800 x g por 5 min a 4 ° c.</li>
	<li>Aspirar cuidadosamente o sobrenadante e suspender a pelota celular com solução de intercalação de 125 nM em 1 mL de tampão de correção/Perm.</li>
	<li>Incubar a amostra em solução de intercalação durante a noite a 4 ° c.</li>
</ol>3. Prepare células para aquisição de CyTOF
<ol><li>Suavemente vórtice e girar células em 800 x g por 5 min a 4 ° c.</li>
	<li>Lave as células adicionando 2 mL de tampão de coloração CyTOF, gire as células a 800 x g durante 5 min a 4 ° c e retire o sobrenadante por aspiração.</li>
	<li>Reressuscitem as células em 1 mL de diH2O. Reserve um pequeno volume (aproximadamente 10 μL) de cada tubo para contar as células.</li>
	<li>Gire as pilhas em 800 x g por 5 minutos em 4 ° c.</li>
	<li>Repita o passo 3,3 e 3,4.</li>
	<li>Aspirar cuidadosamente o sobrenadante e deixar as células no pellet. As células BM estão agora prontas para reressuscitar a concentração de 1 x 106 células/ml para aquisição de cytof.</li>
</ol>

<ol><li>Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clonogenic+common+myeloid+progenitor+that+gives+rise+to+all+myeloid+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages.</a> Nature. 404, 193-197 (2000).</li>
<li>Iwasaki, H., Akashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+lineage+commitment+from+the+hematopoietic+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Myeloid lineage commitment from the hematopoietic stem cell.</a> Immunity. 26, 726-740 (2007).</li>
<li>Manz, M. G., Miyamoto, T., Akashi, K., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+isolation+of+human+clonogenic+common+myeloid+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 99, 11872-11877 (2002).</li>
<li>Becher, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-dimensional+analysis+of+the+murine+myeloid+cell+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">High-dimensional analysis of the murine myeloid cell system.</a> Nature Immunology. 15, 1181-1189 (2014).</li>
<li>Bendall, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+mass+cytometry+of+differential+immune+and+drug+responses+across+a+human+hematopoietic+continuum%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum.</a> Science. 332, 687-696 (2011).</li>
<li>Samusik, N., Good, Z., Spitzer, M. H., Davis, K. L., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+mapping+of+phenotype+space+with+single-cell+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated mapping of phenotype space with single-cell data.</a> Nature Methods. 13, 493-496 (2016).</li>
<li>Zhu, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+an+Early+Unipotent+Neutrophil+Progenitor+with+Pro-tumoral+Activity+in+Mouse+and+Human+Bone+Marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Identification of an Early Unipotent Neutrophil Progenitor with Pro-tumoral Activity in Mouse and Human Bone Marrow.</a> Cell Reports. 24, 2329-2341 (2018).</li>
<li>Van der Maaten, L. J. P., Hinton, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+High-Dimensional+Data+Using+t-SNE%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Machine+Learning+Research%22%5BJournal%5D)">Visualizing High-Dimensional Data Using t-SNE.</a> Journal of Machine Learning Research. 9, 2579-2605 (2008).</li>
<li>Amir, E. A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((viSNE+enables+visualization+of+high+dimensional+single-cell+data+and+reveals+phenotypic+heterogeneity+of+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia.</a> Nature Biotechnology. 31, 545-552 (2013).</li>
<li>van der Maaten, L., Hinton, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+data+using+t-SNE%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Machine+Learning+Research%22%5BJournal%5D)">Visualizing data using t-SNE.</a> Journal of Machine Learning Research. 9 (85), 2579-2065 (2008).</li>
<li>Cloos, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+Protocol+to+Sample+and+Process+Bone+Marrow+for+Measuring+Measurable+Residual+Disease+and+Leukemic+Stem+Cells+in+Acute+Myeloid+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiment%22%5BJournal%5D)">Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia.</a> Journal of Visualized Experiment. 133, 56386(2018).</li>
<li>Bendall, S. C., Nolan, G. P., Roederer, M., Chattopadhyay, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+deep+profiler%E2%80%99s+guide+to+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">A deep profiler’s guide to cytometry.</a> Trends in Immunology. 33, 323-332 (2012).</li>
<li>Ley, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils%3A+New+insights+and+open+questions%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neutrophils: New insights and open questions.</a> Science Immunology. 3 (30), 4579(2018).</li>
<li>Ng, L. G., Ostuni, R., Hidalgo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of neutrophils.</a> Nature Reviews in Immunology. , (2019).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Nas últimas décadas, a citometria de fluxo à base de fluorescência foi utilizada como método principal para estudar linhagens celulares e heterogeneidade1,2,3. Embora a citometria de fluxo tenha fornecido dados multidimensionais, este método é limitado por opções de parâmetros e sobreposição espectral. Para superar a fraqueza do fluxo citometria nós aproveitamos de cytof, que usa isótopos do metal pesado em vez dos fluoróforos p...

Nas últimas décadas, os métodos de citometria têm sido uma poderosa ferramenta para investigar o sistema hematopoiético na BM. Esses métodos incluem citometria de fluxo ativada por fluorescência e o novo método de CyTOF usando anticorpos com rótulo de metal pesado. Conduziram às descobertas de muitos tipos da pilha em um espécime biológico heterogêneo pela identificação de seus perfis originais da expressão do marcador de superfície. As sobreposições aumentadas do espectro que é associada com mais canaletas conduzem à inexatidão de dados mais elevada em aplicações fluorescência-ativadas da citometria do fluxo. Conseqüentemente, as pilhas indesejadas são removidas rotineiramente a fim enriquecer populações da pilha do interesse para a análise fluorescência-ativada do fluxo citometria. Por exemplo, Ly6G (ou GR-1) e CD11b são considerados marcadores de células mielóides maduros e Ly6G+ (ou GR-1+) e células CD11b+ são ROTINEIRAMENTE removidas das amostras de BM usando kits de enriquecimento magnético antes da análise de citometria de fluxo de tronco hematopoiético e células progenitoras (hspcs) ou combinando esses marcadores em um canal de coquetel de despejo1,2,3. Um outro exemplo é que os neutrófilos são removidos rotineiramente do espécime humano do sangue para enriquecer pilhas mononucleares do sangue periférico (PBMC) para estudos imunológicos. A medula óssea inteira isolada do rato ou do ser humano, entretanto, é investigada raramente intact para a análise da citometria.
Recentemente, cytof tornou-se uma ferramenta revolucionária para investigar o sistema hematopoiético4,5,6. Com CyTOF, os anticorpos etiquetados fluorophore são substituídos por anticorpos repórter-etiquetados do elemento pesado. Este método permite a medição de mais de 40 marcadores simultaneamente sem a preocupação de sobreposição de espectro. Permitiu a análise do espécime biológico intacto sem etapas da pre-depleção ou de uma canaleta da descarga. Portanto, podemos ver o sistema hematopoiético de forma abrangente com dimensionalidade de alto conteúdo a partir de parcelas convencionais de citometria de fluxo 2-D. As populações de células omitidas no passado durante o processo de depleção ou gating agora podem ser trazidas à luz com os dados de alta dimensão gerados pelo cytof4,5. Nós projetamos um painel do anticorpo que mede simultaneamente 39 parâmetros no sistema hematopoietic com um foco no linage Myeloid7. Em comparação com os dados convencionais de citometria de fluxo, a interpretação e visualização dos dados de células unidimensionais sem precedentes gerados pela CyTOF é um desafio. Os cientistas computacionais desenvolveram técnicas de redução de dimensionalidade para a visualização de conjuntos de dados de alta dimensão. Neste artigo, utilizamos o algoritmo viSNE, que utiliza a técnica t-Distributed Stochastic Neighbor incorporação (t-SNE) para analisar os dados CyTOF e apresentar o resultado de alta dimensão em um mapa de 2 dimensões, conservando a estrutura de alta dimensão dos dados8,9,10. No gráfico tSNE, células semelhantes são agrupadas em subconjuntos e a cor é usada para realçar o recurso das células. Por exemplo, na Figura 1 as células mielóides são distribuídas em vários subconjuntos de células com base nas semelhanças de seus padrões de expressão de 33 marcadores de superfície resultantes de cytof (Figura 1)4. Aqui nós investigamos a medula do osso do rato com nosso painel previamente relatado do CyTOF do 39-Marker pela análise7de visne. a análise de visne de nossos dados de cytof revelou uma população não identificada da pilha que mostrasse características de hspc (CD117+) e de neutrófilos (Ly6G+) (Figura 2)7.
Em conclusão, nós apresentamos um protocolo para processar a medula inteira fresca do osso para a análise de CyTOF. Neste artigo, nós usamos a medula óssea do rato como um exemplo, quando este protocolo puder igualmente ser usado para processar amostras humanas da medula. Os detalhes específicos para amostras de medula óssea humana também são observados no protocolo. A vantagem deste protocolo é que contem detalhes tais como o tempo e a temperatura da incubação que foram aperfeiçoados para preservar pilhas da neutrófilos-linhagem na medula inteira para permitir a investigação na medula inteira intacta do osso. Este protocolo também pode ser facilmente modificado para aplicações de citometria de fluxo ativada por fluorescência.

<table><tbody><tr><td>CyTOF Anticorpos (camundongo)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD45 (Clone 30-F11) -89Y</td><td>Fluidigm</td><td>Cat# 3089005B</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Humano/Camundongo CD45R/B220 (Clone RA36B2)-176Yb</td><td>Fluidigm</td><td>Cat# 3176002B</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD105 (Clone MJ7/18)-Purificado</td><td>Biolegend</td><td>Cat# 120402; RRID:AB_961070</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD115 (CSF-1R) (Clone AFS98) - Purificado</td><td>Biolegend</td><td>Cat# 135502; RRID: AB_1937293</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD117 / c-kit (Clone 2B8) -166Er</td><td>Fluidigm</td><td>Cat # 3166004B</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD11a (Clone M17 / 4) - Purificado</td><td>Biolegend</td><td>Cat # 101101; RRID:AB_312774</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD11b (Clone M1/70)-148Nd</td><td>Fluidigm</td><td>Cat# 3148003B</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD11c (Clone N418)-142Nd</td><td>Fluidigm</td><td>Cat# 3142003B</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD127 (IL-7R&alpha;) (Clone A7R34)-MaxPar Ready</td><td>Biolegend</td><td>Cat# 133919; RRID:AB_2565433</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD150 (Clone TC1512F12.2)-167Er</td><td>Fluidigm</td><td>Cat# 3167004B</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD16.2 (Fc&gamma; RIV) (Clone 9E9) - Gato</td><td>Biolegend</td> Purificado <td># 149502; RRID: AB_2565302</td><td></td></tr><tr><td>CD162 anti-rato (clone 4RA10 (RUO)) - Purificado</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat# 557787; RRID:AB_647340</td><td></td></tr><tr><td>Anti-rato CD169 (Siglec-1) (Clone 3D6.112)-Purificado</td><td>Biolegend</td><td>Cat# 142402; RRID:AB_10916523</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD182 (CXCR2) (Clone SA044G4) - Purificado</td><td>Biolegend</td><td>Cat# 149302; RRID: AB_2565277</td><td></td></tr><tr><td>Anti-rato CD183 (Clone CXCR3-173) - Purificado</td><td>Biolegend</td><td>Cat# 126502; RRID:AB_1027635</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD335 (NKp46) (Clone 29A1.4)-MaxPar Ready</td><td>Biolegend</td><td>Cat# 137625; RRID:AB_2563744</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD34 (Clone MEC14.7)-Purificado</td><td>Biolegend</td><td>Cat# 119302; RRID:AB_345280</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD41 (Clone MWReg30)-MaxPar Ready</td><td>Biolegend</td><td>Cat# 133919; RRID:AB_2565433</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD43 (Clone S11)-146Nd</td><td>Fluidigm</td><td>Cat# 3146009B</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD48 (Clone HM48.1)-156Gd</td><td>Fluidigm</td><td>Cat# 3156012B</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD62L (Clone MEL-14)-MaxPar Ready</td><td>ThermoFisher</td><td>Cat# 14-1351-82; RRID: AB_467481</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD71 (Clone RI7217) - Gato</td><td>Biolegend</td> Purificado <td># 113802; RRID:AB_313563</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD90 (Clone G7)-Purificado</td><td>Biolegend</td><td>Cat# 105202; RRID:AB_313169</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse F4/80 (Clone BM8)-159Tb</td><td>Fluidigm</td><td>Cat# 3159009B</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse Fc&epsilon; RI&alfa; (Clone MAR-1)-MaxPar Ready</td><td>Biolegend</td><td>Cat# 134321; RRID:AB_2563768</td><td></td></tr><tr><td>Anti-rato GM-CSF (MP1-22E9 (RUO))-Purificado</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat# 554404; RRID:AB_395370</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse I-A/I-E (Clone M5/114.15.2)-174Yb</td><td>Fluidigm</td><td>Cat# 3174003B</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse Ki67 (Clone B56 (RUO))-Purificado</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat# 556003; RRID:AB_396287</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) (Clone D7)-169Tm</td><td>Fluidigm</td><td>Cat# 3169015B</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse Ly6B (Clone 7/4)-Purificado</td><td>abcam</td><td>Cat# ab53457; RRID:AB_881409</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse Ly-6G (Clone 1A8)-MaxPar Ready</td><td>Biolegend</td><td>Cat# 127637; RRID: AB_2563784</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse NK1.1 (Clone PK136) -165Ho</td><td>Fluidigm</td><td>Cat # 3165018B</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse Siglec-F (Clone E50-2440 (RUO)) - Purificado</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat # 552125; RRID:AB_394340</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse TCR&beta; (Clone H57-597)-143Nd</td><td>Fluidigm</td><td>(Clone H57-597)-143Nd</td><td></td></tr><tr><td>Anti-camundongo TER-119/Células Eritróides (Clone TER-119)-MaxPar Ready</td><td>Biolegend</td><td>Cat# 116241; RRID: AB_2563789</td><td></td></tr><tr><td>Chemicals, Peptídeos e Proteínas Recombinantes </td>Estabilizador de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anticorpos</td><td>CANDOR Bioscience</td><td>Cat# 130050</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# A4503</td><td></td></tr><tr><td>Cisplatina-194Pt</td><td>Fluidigm</td><td>Cat# 201194</td><td></td></tr><tr><td>eBioscience 1x tampão</td> <td>de lise de hemáciasThermoFisher</td><td>Cat# 00-4333-57</td><td></td></tr><tr><td>eBioscience Foxp3 / Conjunto de tampão de coloração de fator de transcrição</td><td>ThermoFisher</td><td>Cat# 00-4333-57</td><td></td></tr><tr><td>EQ Quatro elementos grânulos de calibração</td><td>Fluidigm</td><td>Cat# 201078 Ácido</td><td></td></tr><tr><td>etilenodiaminotetracético (EDTA)</td><td>ThermoFisher</td><td>Cat# AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino fetal</td><td>Omega Scientific</td><td>Cat# FB-02</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato HyClone</td><td>GE Lifesciences</td><td>Cat#SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>Intercalator-Ir</td><td>Fluidigm</td><td>Cat# 201192B</td><td></td></tr><tr><td>MAXPAR Kits de rotulagem de anticorpos</td><td>Fluidigm</td><td>http://www.dvssciences.com/product-catalog-maxpar.php</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# 158127</td><td></td></tr><tr><td>Azida sódica</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# S2002</td><td></td></tr><tr><td>Triton&nbsp; X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# X100</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina EDTA 1x</td><td>Corning</td><td>Cat# 25-053-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Experimental Modelo: Organismo/Cepas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse: C57BL/6J</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>Stock No: 000664</td><td></td></tr><tr><td>Software Alogrithm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Normalizador baseado em contas</td><td>Finck et al., 2013</td><td>https://med.virginia.edu/flow-cytometry-facility/wp-content/uploads/sites/170/2015/10/3_Finck-Rachel_CUGM_May2013.pdf</td><td></td></tr><tr><td>Cytobank</td><td>Cytobank</td><td>https://www.cytobank.org/</td><td></td></tr> <tr><td>Cytofkit v1.r.0</td><td>Chen et al., 2016</td><td>https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/cytofkit.html</td><td></td></tr><tr><td>t-SNE</td><td>van der Maaten e Hinton, 2008</td><td>https://cran.r-project.org/web/packages/Rtsne/index.html</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

preparação de medula óssea inteira para análise de citometria de massa de células de linhagem de neutrófilos

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

Neste artigo, nós apresentamos um protocolo que seja aperfeiçoado para preservar pilhas da neutrófilos-linhagem no BM fresco para a análise inteira de BM CyTOF. Nós utilizamos um painel Myeloid-tendencioso do CyTOF do 39-anticorpo para avaliar o sistema hematopoietic com um foco nas pilhas da neutrófilos-linhagem usando este protocolo. O resultado do CyTOF foi analisado com um algoritmo de redução dimensional de recurso aberto, o viSNE, e os dados foram apresentados para demonstrar o desfecho deste protocolo. Descobrimos novas populações de células de linhagem de neutrófilos com base neste protocolo. Este protocolo da preparação inteira fresca do BM pode ser usado para 1), análise de CyTOF para descobrir populações não identificadas da pilha do BM inteiro, 2), investigando defeitos inteiros do BM para pacientes com desordens de sangue tais como a leucemia, 3), auxiliando a optimização de protocolos de citometria de fluxo ativados por fluorescência que utilizam BM inteiro fresco.

A Figura 1 é apresentada como um resultado de exemplo de experimentos cytof. Neste gráfico de tSNE as células em vários tecidos de mouse foram agrupadas em subconjuntos com base na semelhança de seus perfis de expressão de marcador de superfície medidos por um painel CyTOF 33-Parameter. As células com propriedades mais semelhantes foram agrupadas automaticamente, como os neutrófilos, macrófagos ou os DCs com base na expressão dos marcadores 33 em cada célula.
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Aqui, nós apresentamos um protocolo para processar a medula fresca (BM) isolada do rato ou do ser humano para a análise de massa High-dimensional da citometria (citometria pela tempo--vôo, cytof) de pilhas da neutrófilos-linhagem.

Preparação de medula óssea inteira para análise de citometria de massa de células de linhagem de neutrófilos

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...

Este protocolo de citometria em massa preserva a integridade de toda a medula óssea, permitindo o resgate das informações que foram perdidas durante a preparação convencional da amostra para análise de células estudadas. Este protocolo rápido e sem esforço de isolamento da medula óssea facilita a aquisição de populações viáveis de células mielóides de curta duração, como subconjuntos raros de linhagem de neutrófilos. O uso da citometria em massa para identificar células imunes anteriormente apreciadas, como células de linhagem de neutrófilos, pode ter amplas implicações para uma grande variedade de doenças.Este protocolo preserva a integridade das células mielóides de curta duração que estão presentes na medula óssea e podem ser facilmente aplicadas a outros tipos de tecidos, como o tumor sólido. Simplificamos o protocolo para torná-lo o mais amigável possível, mas como em todos os estudos biológicos pode precisar de algumas práticas para gerenciar. Quando você está fazendo isso da primeira vez, você pode obter todos os seus reagentes pronto primeiro e, em seguida, seguir estritamente o protocolo.Se você tiver algum problema, você pode se conectar ao CyTOForum e conversar com outros usuários do CyTOF que podem ajudar a solucionar problemas. Para a preparação biológica da amostra, truques simples podem fazer uma enorme diferença com o resultado final. Uma demonstração visual é muito mais fácil para um novo usuário entender o protocolo.Se você está fazendo isso pela primeira vez, você pode obter seus reagentes prontos primeiro e, em seguida, seguir estritamente o protocolo. Para a colheita da medula óssea, coloque um rato preto C57 de seis a 10 semanas de idade na posição supina em uma almofada cirúrgica estéril e use 70% de etanol para esterilizar o abdômen e os membros traseiros. Use um par de tesouras cirúrgicas dissecando para abrir a cavidade abdominal e remover a pele para expor os membros traseiros.Usando um par de fórceps de ponta sem corte, segure a tíbia do rato logo abaixo do tornozelo e use um par de fórceps curvos para estabilizar a tíbia abaixo dos fórceps de curativos com pontas bruscas. Use os fórceps de ponta sem corte para quebrar a tíbia e remova o músculo para expor o osso. Antes de colocar a tíbia no PBS frio, mova os fórceps curvados estabilizadores para o fêmur e deslize os fórceps de curativos de ponta sem corte abaixo da articulação do joelho para segurar a rótula.Puxe suavemente para cima para deslocar a rótula e remova o músculo da rótula para expor o fêmur. Segure o fêmur exposto pelos fórceps curvos e use uma tesoura cirúrgica para cortar o fêmur da parte inferior do osso. Em seguida, coloque o fêmur na PBS.Em seguida, use uma agulha de calibre 18 para perfurar um buraco em um tubo de micro centrífuga de 0,5 mililitro e coloque ambos os ossos no tubo com as extremidades abertas dos ossos voltados para baixo no buraco. Coloque o tubo de 0,5 mililitro em um tubo de micro centrífuga de 1,7 mililitro e gire os tubos de duas camadas em uma micro centrífuga. No final da centrifugação, confirme que a medula óssea foi extraída para o fundo do tubo.Para manchar as células da medula óssea para citometria em massa, suspenda novamente a medula óssea em um mililitro de tampão de lise de glóbulos vermelhos por 10 minutos à temperatura ambiente. No final da incubação, recolhe as células por centrifugação e suspende a pelota em um mililitro de PBS frio. Filtre as células através de um coador de 70 micrômetros em um tubo cônico de 15 mililitros e lave as células com nove mililitros de PBS fresco e frio.Suspender a pelota da célula de medula óssea em 10 mililitros de PBS fresco e frio para contar e transferir uma taxa de cinco vezes 10 para a sexta célula aliquot em um novo tubo de 15 mililitros. Coletar as células por centrifugação e suspender as células em um mililitro de tampão de coloração de citometria em massa, complementado com 125 cisplatina nanomolar. Depois de cinco minutos em temperatura ambiente, lave as células em quatro mililitros de tampão de citometria de massa fresca.Suspenda a pelota em 50 microliters da solução de bloqueio do receptor FC. Após 10 minutos a quatro graus Celsius, adicione 50 microliters do coquetel de anticorpos de interesse às células e cano suavemente para misturar. A temperatura em diferentes passos de incubação são muito importantes na preservação da viabilidade das células de medula óssea.Depois de 30 minutos a quatro graus Celsius, lave as células duas vezes em dois mililitros de tampão de citometria de massa fresca por lavagem antes de suspender as células em um mililitro de formaldeído recém-preparado por 15 minutos à temperatura ambiente. Ao final da incubação, colete as células por centrifugação e suspenda a pelota em um mililitro de tampão perm fixo complementado com 125 solução de intercalação nanomolar para uma incubação noturna a quatro graus Celsius. Antes de analisar as células por citometria de massa, vórtice suavemente e centrífuga a suspensão celular antes de lavar as células em dois mililitros de tampão de coloração de cytometria de massa fresca.Em seguida, lave as células duas vezes em um mililitro de água destilada por lavagem, aspirando cuidadosamente o supernascido após a segunda lavagem antes de suspender as células em uma vez 10 a 6 células por mililitro de concentração de tampão de citometria em massa para análise de citometria em massa. Neste t distribuído enredo de incorporação estocástica, as células através de múltiplos tecidos de camundongos foram agrupadas em subconjuntos com base na similaridade de seus perfis de expressão de marcadores de superfície medidos por um painel de citometria de massa de 33 parâmetros. Células com propriedades mais semelhantes foram automaticamente agrupadas com base na expressão desses marcadores em cada célula.Usando este método, a integridade de toda a medula óssea foi preservada, levando à descoberta de uma população celular até então desconhecida que simultaneamente co-expressa neutrófilo e tronco hematopoiético e células progenitoras assinatura marcadores de superfície. Essa população celular, que foi anteriormente omitida em estudos progenitores mieloides, devido ao esgotamento positivo das células Ly6G, apresenta um padrão distinto de expressão de marcador de superfície. Mais importante, esses dados levaram à descoberta de um pequeno subconjunto do aglomerado celular positivo Ly6G que não expressa Ly6G, mas foi agrupado de perto às células positivas ly6G do CD117, sugerindo a semelhança dessas células com a linhagem de neutrófilos com base na expressão dos 33 marcadores de superfície usados neste experimento de citometria em massa.Um painel de classificação celular ativado de 13 cores poderia então ser construído, permitindo o isolamento dos progenitores neutrófilos por citometria de fluxo para ensaios funcionais a jusante. É importante realizar o procedimento de isolamento da medula óssea o mais rápido possível e manter as células a quatro graus Celsius durante o procedimento de coloração.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este vídeo descreve um protocolo detalhado para isolar a medula óssea inteira fresca dos membros posteriores do camundongo para investigar defeitos de MO total para pacientes com doenças do sangue, como leucemia.

Colheita de medula óssea do membro posterior do camundongo

Descreve-se um protocolo para o isolamento e purificação de neutrófilos de medula óssea do rato por centrifugação de gradiente de densidade e de neutrófilos para rotulagem com corantes CellTracker. Isso representa um método simples, rápido, reprodutível e econômica para a obtenção de um grande número de neutrófilos para estudos funcionais a jusante ou de transferência e controle de experimentos adotivos.

Isolamento, purificação e Rotulagem de neutrófilos da medula óssea do rato de Estudos funcionais e Experimentos de transferência adotiva

Relata-se um protocolo de utilização de células activada por fluorescência para isolar células dendríticas plasmocitoides (PDC) com elevado grau de pureza a partir da medula óssea de ratinhos lúpus-propenso para estudos funcionais de PDC.

Classificação de células activadas por fluorescência Para a purificação de células dendríticas plasmocitï¿½des do rato de Medula Óssea

Aqui nós fornecemos um método para identificar e isolar um grande número de GM-CSF dirigido pilhas myeloid usando a classificação de células de alta velocidade. Cinco populações distintas (comuns progenitores mieloides progenitoras granulócitos/macrófagos, monócitos, macrófagos derivados de monócitos e DCs derivados de monócitos) podem ser identificadas com base na expressão Ly6C e CD115.

Geração de um grande número de progenitores mieloides e células dendríticas precursores de murino medula óssea usando um celular romance classificação estratégia

O diagnóstico do MDS é difícil na ausência de critérios morfológicos ou não-informativo citogenética. MFC poderia ajudar a refinar o processo de diagnóstico do MDS. Para se tornar útil para a prática clínica, a análise MFC deve ser baseada em parâmetros com sensibilidade e especificidade suficientes, e dados devem ser reprodutíveis entre diferentes operadores.

Orientada para o banco de dados-citometria de fluxo para avaliação da maturação de células mieloides de medula óssea

Demonstramos como identificar e isolar 6 subconjuntos de progenitores mieloides de murino medula óssea usando uma combinação de magnética e fluorescência classificação (MACS e FACS). Este protocolo pode ser usado para ensaios em vitro cultura (culturas metilcelulose ou líquido), na vivo experiências de transferência adotiva e análises de RNA/proteína.

Identificação e isolamento de oligopotentes e confirmada por linhagem mieloides progenitores da medula óssea de rato

Aqui, descrevemos um protocolo simples para o isolamento e coloração de células murinas da medula óssea para fenótipo de células-tronco hemopoéticas e progenitoras, juntamente com células-tronco endoteliais e mesenquimais de nicho de suporte. Um método para enriquecer células localizadas em áreas endosteal e medula óssea central também é incluído.

Análise por Citometria de Fluxo de Medula Óssea Purina, Células-Tronco e Progenitoras Hematopoéticas e Células de Nicho Estromal

Descrevemos protocolos stepwise medindo a respiração mitocondrial de neutrófilos humanos e camundongos e células HL60 usando o analisador de fluxo extracelular metabólico.

Mensuração em Tempo Real do Perfil Bioenergético Mitocondrial de Neutrófilos

O sucesso da transcriptômica de célula única/núcleo único e multi-ômica depende em grande parte da qualidade das células/núcleos. Portanto, o isolamento de células/núcleos do tecido e sua purificação devem ser altamente padronizados. Este protocolo descreve a preparação de núcleos do cérebro e da medula óssea para o ensaio de multioma de núcleo único a jusante.

Preparação de Núcleos Cerebrais e de Medula Óssea de Alta Qualidade para Ensaios Multioma de Núcleos Únicos

Este é apresentado um protocolo detalhado para isolar e caracterizar populações microambientais da medula óssea de modelos murinos de síndromes mielodisplásicas e leucemia mieloide aguda. Esta técnica identifica alterações no nicho da medula óssea não hematopoiética, incluindo as células endoteliais e estromais mesenquimais, com a progressão da doença.

Identificação de Populações Microambientais de Medula Óssea na Síndrome Mielodisplásica e Leucemia Mielóide Aguda

Este manuscrito descreve um protocolo para preparar uma biblioteca ATAC-seq de neutrófilos da medula óssea murina, com o objetivo de garantir a viabilidade ideal dos neutrófilos e a alta qualidade da biblioteca. Ele oferece instruções passo a passo sobre a preparação do BMC, classificação imunomagnética e construção de bibliotecas, servindo como um guia valioso, especialmente para iniciantes no estudo de neutrófilos.

Biblioteca ATAC-Seq Preparação de neutrófilos derivados da medula óssea murina

Aprenda a preparar medula óssea inteira para citometria de massa de células de linhagem de neutrófilos. Este protocolo preserva a integridade de células mieloides de curta duração, permitindo a análise de populações raras.

Preparação de medula óssea inteira para análise de citometria de massa de células de linhagem de neutrófilos

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